制首烏和生首烏對小鼠大腦β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1影響的對比實驗研究

農(nóng)嘉琦 梅金鈺 李芳蕾 俞巧玲 梁菊華 鐘世茂 黃鷗飛 張樹球 楊艷萍

摘要：目的：探討中藥制首烏和生首烏對小鼠腦組織β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1（β分泌酶， BACE1）及其他相關(guān)酶的影響。方法：將30只小白鼠分成三組，每組10只，即實驗1組，實驗2組，正常組;實驗1組用制首烏提取液灌胃，實驗2組用生首烏提取液灌胃，正常組不治療，連續(xù)30天。灌胃20天測1次血紅蛋白，實驗結(jié)束，取血，分離血清測定生化指標，處死動物，取大腦，勻槳，用生理鹽水制成10%腦勻槳，放4-8℃冰箱保存。結(jié)果：實驗1組，實驗2組，正常組;依次分別為，腦勻槳β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1（ BACE1） 33.28±3.99、32.24±3.2、35.52±4.08（ U/L），與正常組比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），85.65±13.82、97.13±16.84、70.53±6.84 （U/L） ，與正常組比較，，P<0.01，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：制首烏和生首烏對大腦（ BACE1）活力有明顯的抑制作用，以生首烏更明顯，這是何首烏抗衰老，抗癡呆的基礎(chǔ)，但它對肝功能也產(chǎn)生影響，用量需控制。

關(guān)鍵詞：何首烏（生，制）;β分泌酶（β-位淀粉樣前體蛋白裂解酶1;BACE1）老年癡呆癥;

【中圖分類號】R955 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2021）07-002-01

何首烏是蓼科植物何首烏（Polygonummuhiflorum Thunb）的干燥塊根，是歷代的補益中藥。何首烏有解毒，消癰，潤腸通便的功效，制何首烏主要用于補肝腎，益精血，烏須發(fā)，強筋骨……。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，何首烏具有降血脂、增強免疫、抗氧化、延緩衰老等廣泛的藥理學(xué)活性，這與其主要化學(xué)成分的藥理活性密切相關(guān)。二苯乙烯苷是何首烏中特有的生物活性成分[1]。生、制首烏在臨床上用法有區(qū)別，制首烏偏于補血，而生首烏偏于活血，生首烏毒性較大，經(jīng)高溫炮制成制首烏后，毒性減小[2]。本文利用小鼠作研究對象，用制首烏和生首烏水提取液灌胃，測定小鼠腦β-位淀粉樣前體蛋白裂解酶1（BACE1活力等，探討療效及機理，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 試劑 高鐵氰化鉀、氰化鉀、碳酸氫鈉、氯化鈉、甲醛、鹽酸（HCL）、均為國產(chǎn)分析純。各種測試盒，甘油三酯（TG）測試盒、總膽固醇（TC）測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶測試盒，購自南京建成生物工程研究所科技有限責(zé)任公司。β-分泌酶1（蛋白裂解酶1，BACE1）測試盒購自上海江萊生物有限責(zé)任公司。

1.2中藥 何首烏（生），購自本市市場，原產(chǎn)本地農(nóng)村，經(jīng)切片，高溫炮制7次，55℃烤干成制首烏干品，。生，制何首烏，分別經(jīng)加熱水提取，乙醇沉，去沉淀，去乙醇，制成口服水溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物，小白鼠30只，昆明種，清潔級，健康，雌雄各半，鼠齡2個月。由學(xué)院動物室提供（動物使用許可證號：SYXK桂2011-0010。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2012-0003.）.

1.2.2動物實驗 分籠喂養(yǎng)，每籠5只，分三組，每組10只， 實驗1組， 實驗2組，正常組; 實驗1組用制首烏提取液灌胃， 實驗2組用生首烏提取液灌胃， 正常組不灌、每天一次，連續(xù)30天. 灌胃到20天測1次血紅蛋白. 結(jié)束實驗， 從眼球后取血、分離血清放普通冰箱待用，測定生化指標;處死小鼠，取肝腎器官，放甲醛浸泡，作病理檢查;取大腦，制成10%腦勻漿.

1.2.4測定方法 血紅蛋白Hb測定，取小鼠尾巴全血20ul，用高鐵氰化鉀（HiCN法）測定，具體操作參考文獻[4]。實驗結(jié)束， 從眼球后取全血，分離血清， 測定生化指標：甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）; 處死小鼠，取大腦組織，在冰浴下用玻璃勻漿器研磨，用生理鹽水制成10%腦勻漿， 3000rpm離心10min，取上清放4-8度冰箱保存待用，測定BACE1：血清ALT用改良賴氏法測定;TC用COD-CE-PAP測定;TG用GPO-OAO法測定;β-分泌酶1測試采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。按試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS-13軟件處理，進行方差分析和Q檢驗，結(jié)果用（）表示。

2.結(jié)果

2.1小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、腦勻漿BACE1含量測定結(jié)果， 谷丙轉(zhuǎn)氨酶，各組間比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義; 腦勻漿BACE1， 各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義; 見表1.

方差分析：谷丙轉(zhuǎn)氨酶，各組間比較，F(xiàn)=5.448，p=0.017， 與正常組比較， P<0.01，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義; 腦勻漿BACE1， 各組間比較，F(xiàn)=2.274，p=0.119，與正常組比較， P<0.05， ， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義;

2.2 血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、血紅蛋白Hb含量測定結(jié)果。結(jié)果顯示， TG， 各組間比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義; （TC） ， 各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義; 血紅蛋白Hb，各組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2.

方差分析： TG， 各組間比較，F(xiàn)=6.345，p=0.011， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義; 與正常組比較： P<0.05，P<0.01; TC， 各組間比較，F(xiàn)=1.604，p=0.236，，差異無統(tǒng)計學(xué)意義; 血紅蛋白Hb， 各組間比較，F(xiàn)=4.614，p=0.026，，與實驗2組比較， P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

3.討論

何首烏是歷代的補益中藥 。主要有補肝腎，益精血 ，烏須發(fā)，強筋骨等功效。近年來的研究發(fā)現(xiàn) ，何首烏具有降血脂、增強免疫 、抗氧化 、延緩衰老等廣泛的藥理學(xué)活性. 因而在臨床上有廣泛的應(yīng)用，特別在抗衰老方面，而在老年癡呆癥治療方面也獲得較好的效果[3]，本文的研究結(jié)果進一步證明. 老年癡呆癥又稱阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD，）是最常見的一種漸進性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是一種快速的衰老， 病因未明，機理復(fù)雜，其主要病理特征為細胞外 β 淀粉樣肽（β-amyloid，Aβ） 沉積形成老年斑（senile plaques）， 細胞內(nèi)Tau 蛋白過度磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles）[1]，神經(jīng)纖維變性細胞減少和間質(zhì)膠質(zhì)細胞增生四方面. 制首烏和生首烏對大腦（ BACE1）活力有明顯的抑制作用，以生首烏更明顯，這是何首烏抗衰老，抗癡呆的基礎(chǔ).根據(jù)β 淀粉樣肽學(xué)說， β 淀粉樣前體蛋白，正常經(jīng)a分泌酶與r分泌酶配合催化水解成可溶性肽并最終水解成氨基酸，而經(jīng)β分泌酶（BACE1）與r分泌酶配合催化生成β 淀粉樣肽，其二級空間結(jié)構(gòu)是β折疊型，易沉淀而不被水解，最終在細胞外形成老年斑，正常衰老也存在老年斑，但較少，而老年癡呆癥卻大量增加，影響神經(jīng)正常傳導(dǎo)功能.本實驗證明制首烏和生首烏對大腦（ BACE1）活力有明顯的抑制作用，以生首烏更明顯，從而減少形成老年斑，達到抗衰老，治療阿爾茨海默病（老年癡呆癥）的作用.

近年來文獻常有報道，臨床使用何首烏制劑病人出現(xiàn)肝功能損害的現(xiàn)象.本文實驗也證明，何首烏有一定毒性，主要是對肝臟損害，引起轉(zhuǎn)氨酶升高，以生首烏較明顯，與中醫(yī)理論相符合，經(jīng)高溫炮制后毒性降低，中藥何首烏炮制是九蒸九曬成制首烏，無毒， 炮制后成分發(fā)生了轉(zhuǎn)變，如蒽醌結(jié)合型高溫后變成游離型， 毒性發(fā)生轉(zhuǎn)變.所以炮制時間一定要夠，不能偷工減料減時間，同時用量也需嚴格控制，否則容易造成肝功能損害.本文實驗其他指標變化不明顯.

參考文獻：

[1].高任龍 王會 肖 李曉娜 等. 何首烏的藥理毒理研究進展.河北醫(yī)藥 2015， 37（2）： 269-271

[2]. 胡錫琴 楊紅蓮 張 曉 琴 苗 等. 制何首烏對大鼠肝臟毒理的實驗研究.·陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 20O6， 29（ 3）： 40-41

[3] 馬 允， 張樹球 ， 梁月秀等 . 烏圓補血口服液對擬老年癡呆癥小鼠腦乙酰膽堿酯酶的影響. 中國臨床康復(fù) 2005，9 （44）：94-97

[4]葉應(yīng)嫵 ，王毓三 ，主編 . 全國臨床檢驗操作規(guī)程 南京[ M] 2版 ， 南京：東南大學(xué)出版社， 1997.

項目名稱及編號：創(chuàng)建《中草藥原料種植基地》201910599003