轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中醫(yī)治療優(yōu)勢人群的腸道菌群及TB淋巴細(xì)胞亞群特征分析

閆蘊(yùn)孜 孫凌云 徐鈺瑩 陳冬梅 閆韶花 楊宇飛

摘要 目的：分析轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）中醫(yī)治療優(yōu)勢人群腸道菌群及TB淋巴細(xì)胞亞群分布特征及相關(guān)性。方法：選取2018年3月至2019年3月期間中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院腫瘤科門診或病房收治的mCRC患者40例作為研究對象，采用隨機(jī)雙盲、安慰劑對照臨床研究方法，隨機(jī)分為觀察組與安慰劑組，治療給予常規(guī)中醫(yī)治療加用祛邪膠囊，對照組在與觀察組相同治療基礎(chǔ)上服用安慰劑膠囊。收集基線時(shí)患者的糞便樣本及外周血樣本并進(jìn)行檢測。根據(jù)入組患者3年隨訪的生存結(jié)局以及mCRC中醫(yī)治療優(yōu)勢人群判定標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為中醫(yī)治療優(yōu)勢人群及非優(yōu)勢人群，分析2組間腸道菌群及TB淋巴細(xì)胞亞群的差異性及相關(guān)性。結(jié)果：腸道菌群Alpha多樣性分析顯示，中醫(yī)治療非優(yōu)勢人群相比優(yōu)勢人群具有更高的sobs指數(shù)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（115.17±19.25 vs.81.96±36.79，P=0.005），中醫(yī)治療優(yōu)勢人群具有更高比例的擬桿菌屬（30.6% vs.23.9%，P=0.33）和普雷沃氏菌屬（5.7% vs.3.9%，P=0.69）;TB淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)治療優(yōu)勢人群組較非優(yōu)勢人群組具有更高的雙陰T細(xì)胞絕對值（89.6±82.0 vs.37.1±16.5，P=0.01）以及非HLA依賴細(xì)胞毒性T細(xì)胞（83.0±43.6 vs.28.4±18.3，P=0.01）;HLA依賴細(xì)胞毒性T細(xì)胞絕對值與糞厭氧棒狀菌（Anaerostipes）呈顯著負(fù)相關(guān)（P=0.04）。結(jié)論：mCRC中醫(yī)治療優(yōu)勢人群與非優(yōu)勢人群在腸道菌群分布以及TB淋巴細(xì)胞亞群特征方面存在顯著差異且具有一定相關(guān)性，為進(jìn)一步闡釋中醫(yī)優(yōu)勢人群特征及療效機(jī)制提供了必要的科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌;中醫(yī)藥;優(yōu)勢人群;腸道菌群;淋巴細(xì)胞亞群

Analysis on Intestinal Flora and TB Lymphocyte Subsets of Traditional Chinese Medicine Beneficiaries in Metastatic Colorectal Cancer

YAN Yunzi1，2， SUN Lingyun2， XU Yuying1，2， CHEN Dongmei3， YAN Shaohua2，YANG Yufei2

（1 Graduate School， Beijing University of Chinese Medicine， Xiyuan Clinical Medical College， Beijing 10029， China; 2 Department of Oncology， Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Science， Beijing 100091， China; 3 China-Japan Friendship Hospital， Beijing 10029， China）

Abstract Objective：To analyze the distribution characteristics and correlation of intestinal flora and TB lymphocyte subpopulations in Chinese medicine beneficiaries of metastatic colorectal cancer（mCRC）. Methods：From March 2018 to March 2019， a total of 40 patients with mCRC admitted to the Oncology Department or Ward of Xiyuan Hospital of the Chinese Academy of Chinese Medical Sciences were selected as the research objects. A randomized double-blind， placebo-controlled clinical research method was used and the patients were randomly divided into a treatment groups and a placebo group. The treatment group was given conventional Chinese medicine treatment plus Quxie Capsules， and the control group was given placebo capsules on the basis of the same treatment as the treatment group. Stool samples and peripheral blood samples of patients at baseline were collected and tested. According to the survival outcome of the three-year follow-up of the enrolled patients and the criteria for determining the dominant group of Chinese medicine treatment of mCRC， the patients were divided into a dominant group and a non-dominant group of traditional Chinese medicine treatment. The difference and correlation of intestinal flora and TB lymphocyte subgroups between the 2 groups were analyzed.Results：The Alpha diversity analysis of the intestinal flora showed that the Chinese medicine in the treatment of non-beneficiaries populations had a higher SOBS index than the Chinese medicine beneficiaries populations group and there was a significant statistical difference （115.17±19.25 vs. 81.96±36.79， P=0.005）. Chinese medicine beneficiaries populations group had a higher proportion of Bacteroides （30.6% vs. 23.9%， P=0.33） and Prevotella （5.7% vs.3.9%， P=0.69）; the analysis of TB lymphocyte subsets found that the Chinese medicine beneficiaries populations group had a higher absolute value of double-negative T cells （89.6±82.0 vs. 37.1±16.5， P=0.01） and non-HLA dependent group than the other group （83.0±43.6 vs.28.4±18.3），P=0.01）; the absolute value of HLA-dependent cytotoxic T cells was significantly negatively correlated with Anaerostipes （P=0.04）. Conclusion：there are significant differences in the distribution of intestinal flora and the characteristics of TB lymphocyte subgroups between the dominant and non-advantaged groups of Chinese medicine treatment of mCRC， which provide a necessary scientific basis for further explaining the characteristics of the dominant group of traditional Chinese medicine and the mechanism of efficacy.

Keywords Metastatic colorectal cancer; Traditional Chinese medicine; Dominant population; Intestinal flora; Lymphocyte subsets

中圖分類號：R273文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.09.008

2021年國家癌癥中心最新數(shù)據(jù)顯示，2015年結(jié)直腸癌發(fā)病率為17.81%，居全部惡性腫瘤發(fā)病率第4位，結(jié)直腸癌死亡率為8.12%，居全部惡性腫瘤死亡率第5位，且發(fā)病率及死亡率呈上升趨勢[1]。近十年來隨著靶向治療及免疫治療的進(jìn)展，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（Metastatic Colorectal Cancer，mCRC）患者的總生存期不斷被延長，目前臨床研究顯示mCRC中位生存期可達(dá)3年[2]。盡管目前循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明以化放療、靶向及免疫治療為基礎(chǔ)的腫瘤規(guī)范化治療能夠?yàn)閙CRC帶來最大的臨床獲益，但上述現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療方法在帶來療效的同時(shí)，也增加了產(chǎn)生不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，降低患者總體生命質(zhì)量，帶來個(gè)人及家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，從而影響患者對治療的依從性及耐受性。真實(shí)世界數(shù)據(jù)表明，RAS突變、右半結(jié)腸、高齡、體質(zhì)差、經(jīng)濟(jì)狀況差和治療意愿不強(qiáng)的患者較難從西醫(yī)規(guī)范治療中獲益，且這部分人群所占比例高達(dá)40%以上[3]。因此，臨床試驗(yàn)及指南推薦與實(shí)際臨床中所面臨問題之間的差異是目前我國mCRC綜合治療領(lǐng)域中亟待正視與解決的困境之一。

近年來多項(xiàng)研究表明中西醫(yī)結(jié)合治療在延長mCRC患者生存期的同時(shí)也能夠改善其生命質(zhì)量，因此我國所特有的中西并重方案有望能夠幫助更多患者得到獲益[4-5]。在這一過程中，積極探索中醫(yī)治療mCRC的優(yōu)勢人群并闡釋其特征及療效機(jī)制，才能夠與現(xiàn)有臨床指南及規(guī)范化治療方案優(yōu)勢互補(bǔ)，從而形成精準(zhǔn)、個(gè)體化的診療策略。本團(tuán)隊(duì)經(jīng)過10余年來的不懈努力，通過前期隨機(jī)對照試驗(yàn)（Randomized Controlled Trial，RCT）及隊(duì)列研究初步明確mCRC中醫(yī)治療優(yōu)勢人群特征為：女性、KRAS基因突變、右半結(jié)腸以及高齡患者[6]。此外，本團(tuán)隊(duì)對基于真實(shí)世界注冊研究基礎(chǔ)上的120例mCRC患者進(jìn)行長期隨訪，通過病例對照研究方法對其中具有明確基因分型的68例患者進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)優(yōu)勢人群與非優(yōu)勢人群在KPS、是否有黏液血便史、是否接受靶向治療以及口服中藥湯藥時(shí)間長短方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[7]。通過上述研究我們得出結(jié)論，認(rèn)為mCRC中醫(yī)治療優(yōu)勢人群特征與那些難以從西醫(yī)規(guī)范化診療獲益的人群具有一定重合性。這進(jìn)一步說明在mCRC的中西并重診療體系中，中醫(yī)藥能夠?qū)Ω嗟膍CRC患者起到“雪中送炭”的寶貴作用。

在進(jìn)一步探討中醫(yī)治療mCRC優(yōu)勢人群的療效機(jī)制過程中，腸道菌群與宿主免疫調(diào)節(jié)的平衡是本團(tuán)隊(duì)較為關(guān)注的研究方向[8]?，F(xiàn)已有大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展與某些細(xì)菌菌株和腸道菌群失調(diào)有關(guān)[9]，如糞腸球菌、志賀菌、脆弱擬桿菌、核梭桿菌等能夠產(chǎn)生毒素和超氧化物，增加宿主炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)癌癥發(fā)生[10]。相反地，另一些細(xì)菌也具有保護(hù)作用，如雙歧桿菌、乳酸菌、脆弱類桿菌等[11-12]，研究證明這些有益菌保護(hù)結(jié)直腸癌的機(jī)制是通過與病原菌的競爭、代謝和遺傳調(diào)節(jié)等功能實(shí)現(xiàn)的[13]。而中藥在人體內(nèi)的吸收、代謝同樣有賴于腸道菌群的作用，因此結(jié)直腸癌、中藥、腸道菌群3者之間存在一定必然的聯(lián)系[14]。前期研究顯示，以祛邪膠囊為代表的中藥復(fù)方能夠通過FOXP3家族調(diào)控機(jī)體T輔助細(xì)胞，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，其與腸道菌群間的相互關(guān)系有待進(jìn)一步明確[15]?；谏鲜鲅芯考袄碚摶A(chǔ)，我團(tuán)隊(duì)依托2015年度國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目，通過小樣本中藥干預(yù)RCT研究以及3年生存結(jié)局隨訪，希望從腸道菌群分布及宿主免疫特征角度分析mCRC中醫(yī)治療優(yōu)勢人群特征，為進(jìn)一步闡釋中醫(yī)治療mCRC的療效機(jī)制以及優(yōu)勢人群的客觀判別標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3月至2019年3月期間在中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院腫瘤科門診或住院診治的Ⅳ期結(jié)直腸癌患者40例作為研究對象。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司《中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范》晚期結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)。臨床分期采用國際公認(rèn)的TNM分期[美國癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第八版]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 1）經(jīng)病理學(xué)診斷明確的結(jié)直腸癌患者;2）經(jīng)影像學(xué)或病理明確TNM分期診斷為Ⅳ期，且無法對轉(zhuǎn)移病灶進(jìn)行手術(shù)切除;3）年齡18～80歲，性別不限;4）已結(jié)束化療、盆腔放療、靶向治療、免疫治療至少1個(gè)月及以上;5）預(yù)計(jì)生存期大于半年;6）簽署知情同意書，并且依從性好的患者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 1）既往或合并其他原發(fā)惡性腫瘤病史;2）合并嚴(yán)重心血管系統(tǒng)并發(fā)癥、嚴(yán)重肝腎功能異常;3）已出現(xiàn)腸梗阻不能口服藥物治療，需要靜脈內(nèi)高能營養(yǎng);4）患有嚴(yán)重吸收不良或其他影響胃腸道吸收的疾病;5）在入組治療開始前特定期間內(nèi)接受下列任何治療的受試者：a.在2周內(nèi)曾接受抗生素口服或靜脈輸液治療;b.正在接受腸道菌群調(diào)節(jié)劑（如培菲康、乳酸菌素片等）治療。

1.5 研究方法

臨床部分采取隨機(jī)雙盲安慰劑對照臨床試驗(yàn)研究方法。臨床研究方案于2016年6月通過了中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)第一次倫理審查（倫理審批號：2016XLA122-1）。2018年3月8日提交倫理修正（修正臨床研究方案版本號1.4，版本日期2018-03-01，修正知情同意書版本號1.4，版本日期2018-03-11，修正案會(huì)議倫理審批號：2016XLA122-4）。本研究最終方案已在中國臨床試驗(yàn)注冊中心完成注冊（注冊號：ChiCTR2000029599）。

觀察組采用常規(guī)治療加用祛邪膠囊，該藥是由中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院制劑科加工生產(chǎn)，每次0.05 g/kg體質(zhì)量，2次/d口服，連服20 d，停用10 d，30 d為1個(gè)療程。治療1個(gè)療程，贈(zèng)藥（祛邪膠囊）1個(gè)療程。對照組在同觀察組相同的常規(guī)治療的基礎(chǔ)上服用安慰劑膠囊。安慰劑膠囊由北京食品藥物研究所加工生產(chǎn)，外觀、重量、顏色與祛邪膠囊一致。每次0.05 g/kg體質(zhì)量，2次/d口服，連服20 d，停用10 d，30 d為1個(gè)療程。干預(yù)1個(gè)療程，贈(zèng)藥（祛邪膠囊）1個(gè)療程。

常規(guī)治療包括單純中醫(yī)綜合治療和中西醫(yī)結(jié)合綜合治療，后者是在中醫(yī)綜合治療基礎(chǔ)上加用西醫(yī)對癥治療，包括止痛、營養(yǎng)治療等。其中，中醫(yī)綜合治療包括中藥湯劑、口服中成藥、靜脈中成藥等，治則治法以扶正為主。

患者入組后，在祛邪膠囊干預(yù)1個(gè)月及贈(zèng)藥1個(gè)月后進(jìn)行隨訪，此后每3個(gè)月對所有入組患者進(jìn)行電話、網(wǎng)絡(luò)、門診或住院隨訪，隨訪內(nèi)容主要是患者生存結(jié)局情況。

1.6 中醫(yī)治療優(yōu)勢人群分組標(biāo)準(zhǔn)及根據(jù)隨訪結(jié)果的篩選

1）中醫(yī)治療優(yōu)勢人群與非優(yōu)勢人群分組標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)團(tuán)隊(duì)前期研究基礎(chǔ)以及專家共識，對本研究“中醫(yī)治療優(yōu)勢人群”定義如下：口服中藥≥3個(gè)月且截至患者死亡或最后一次隨訪時(shí)間達(dá)到較長的Ⅳ期生存期，其中基因全野生型>30個(gè)月;RAS突變型>24個(gè)月;BRAF突變型或未行基因檢測>18個(gè)月。2）3年隨訪生存結(jié)局情況。截至2021年2月末次隨訪，40例入組晚期結(jié)直腸癌患者中位隨訪時(shí)間為（19.7±10.2）個(gè)月，其中出現(xiàn)結(jié)局事件（各種原因所致死亡）18例（占45%）。本研究根據(jù)上述定義以及入組患者基線資料、隨訪結(jié)果（Ⅳ期生存時(shí)間），進(jìn)一步劃分中醫(yī)治療優(yōu)勢人群及非優(yōu)勢人群。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 糞便樣本采集及腸道菌群檢測

患者入組開始治療前采集新鮮糞便，要求患者在糞便采集前2周之內(nèi)避免口服抗生素，采集3 d內(nèi)避免進(jìn)食酸奶及發(fā)酵食物。將患者新鮮糞便利用OMNIgene-GUT OME-200試管儲(chǔ)存（DNA Genitek Inc.Ottawa，Canada，批號：22001702552108，該試管能夠常溫穩(wěn)定DNA達(dá)60 d。糞便樣本由中國上海美吉生物公司采用16srRNA分析方法進(jìn)行質(zhì)檢及檢測，具體過程：1）DNA抽提和PCR擴(kuò)增：根據(jù)E.Z.N.A. soil試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明書進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量;用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物對V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min（PCR儀：ABI GeneAmp，型號：9700）。擴(kuò)增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mM dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶;10 ng DNA模板。2）Illumina Miseq測序使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST（Promega，USA）進(jìn)行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)（Illumina MiSeq platform TruSeqTM DNA Sample Pre Kit Illumina，SanDiego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫。構(gòu)建文庫步驟：1）連接“Y”字形接頭;2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段;3）利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集;4）氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測序（Illumina MiSeq platform TruSeqTM DNA Sample Pre Kit Illumina，SanDiego，USA）。數(shù)據(jù)處理原始測序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接：1）設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20 bp，從窗口前端位置截去該堿基后端所有序列，之后再去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列;2）根據(jù)重疊堿基Overlap將兩端序列進(jìn)行拼接，拼接時(shí)Overlap之間的最大錯(cuò)配率為0.2，長度需大于10 bp。3）根據(jù)序列首尾兩端的Barcode和引物將序列拆分至每個(gè)樣本，Barcode需精確匹配，引物允許2個(gè)堿基的錯(cuò)配，去除存在模糊堿基的序列。使用UPARSE軟件（Version 7.1 http：//drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行OTU聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫（SSU123），設(shè)置比對閾值為70%。

1.7.2 TB淋巴細(xì)胞亞群檢測

患者入組開始治療前取空腹靜脈血5 mL，由中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院血液實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測，具體過程：經(jīng)標(biāo)本處理后，進(jìn)行免疫分子檢測，T、B淋巴細(xì)胞亞群，Th1/Th2，NK細(xì)胞等。具體如下：在離心管內(nèi)加入體積比為1∶2的淋巴細(xì)胞分離液和肝素化的新鮮稀釋血液，離心20 min（400×g），吸取界面層（一層白膜）單個(gè)核細(xì)胞，Hanks液洗滌2次，每次離心10 min（500×g），逐層冷凍至-80 ℃，1 d后移入液氮保存待測。

1.7.3 其他信息采集 1）中醫(yī)證型評分（中醫(yī)脾虛量表）：基于前期研究基礎(chǔ)及相關(guān)文獻(xiàn)，制定結(jié)直腸癌中醫(yī)脾虛量表，其中患者自評問題8項(xiàng)，程度從1至5。2）生命質(zhì)量評分：采用埃德蒙頓癥狀評定量表（Edmonton Symptom Assessment Scale，ESAS），共包括11個(gè)問題，每個(gè)問題按程度分為0～10。

2 研究結(jié)果

2.1 晚期結(jié)直腸癌中醫(yī)優(yōu)勢人群臨床特征分布

40例入組患者均接受口服中藥治療>3個(gè)月，其中根據(jù)Ⅳ期生存時(shí)間或截至末次隨訪時(shí)間，判定出中醫(yī)治療優(yōu)勢人群28例，中醫(yī)非優(yōu)勢人群12例。在中醫(yī)優(yōu)勢人群中，符合Ⅳ期生存期，基因全野生型>30個(gè)月共8例，RAS突變型>24個(gè)月共9例，BRAF突變型或未行基因檢測>18個(gè)月共11例。

2.1.1 腫瘤相關(guān)臨床特征差異

40例晚期結(jié)直腸癌患者中，女性、年齡≥65歲、原發(fā)部位為右半結(jié)腸患者在中醫(yī)治療優(yōu)勢人群所占比例較高，且中醫(yī)治療優(yōu)勢人群中存在更少的死亡結(jié)局事件。見表1。

2.1.2 中醫(yī)脾虛癥狀分布差異

在8項(xiàng)中醫(yī)脾虛癥狀中，中醫(yī)治療優(yōu)勢人群較非優(yōu)勢人群存在更高“我吃涼東西后會(huì)腸鳴”（32% vs. 8%，P=0.17），“我有白天出汗、活動(dòng)后加重的現(xiàn)象”（25% vs. 8%，P=0.6），“我感到?jīng)]有力氣說話”（18% vs. 0%，P=0.51）的出現(xiàn)頻率;而中醫(yī)治療非優(yōu)勢人群較優(yōu)勢人群存在更高的“我感到食欲不好”（25% vs. 7%，P=0.25），“我吃飯后肚子脹”（17% vs. 11%，P=0.92）。見圖1。

2.1.3 臨床癥狀（ESAS量表癥狀）分布差異

在10項(xiàng)臨床癥狀中，中醫(yī)治療優(yōu)勢人群較非優(yōu)勢人群存在更高“焦慮”（1.6±2.2 vs. 0.92±2.23，P=0.37）、“瘙癢”（1.79±2.17 vs. 0.83±2.04，P=0.2）程度;而中醫(yī)治療非優(yōu)勢人群較優(yōu)勢人群存在更高的“抑郁”（1.75±2.09 vs. 1.29±2.14，P=0.53）、“食欲差”（3.25±2.60 vs. 2.82±2.31，P=0.61）程度。見圖2。

2.2 中醫(yī)治療優(yōu)勢與非優(yōu)勢人群腸道菌群分布差異

納入分析40例患者中共39例完成了糞便樣本采集，共包含4 022 818條DNA序列。利用美吉生物云平臺(tái)（http：//cloud.majorbio.com）進(jìn)行生物信息分析。OUT物種分析顯示所有樣本中共包含微生物物種門水平13種，綱水平21種，目水平37種，科水平74種，屬水平246種，種水平552種，OUT水平863種。Rank-Abundance曲線提示，所有樣本中種類較豐富。見圖3。Pan/Core曲線分析提示曲線平滑，所觀察樣本量充足。見圖4。

2.2.1 Alpha多樣性

在OUT水平進(jìn)行Alpha多樣性分析顯示，中醫(yī)治療非優(yōu)勢人群相比優(yōu)勢人群具有更高的sobs指數(shù)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（115.17±19.25 vs. 81.96±36.79，P=0.005）。見圖5。稀釋曲線分析提示各種樣本多樣性指數(shù)變化曲線平滑，提示樣本量充分。見圖6。

2.2.2 物種組成分析

在屬（Genus）水平對中醫(yī)治療優(yōu)勢及非優(yōu)勢人群進(jìn)行物種組成韋恩圖分析，結(jié)果顯示2組共有196個(gè)共同菌種，中醫(yī)治療優(yōu)勢人群組具有26種特殊菌種、非優(yōu)勢人群具有24種特殊菌種。見圖7。

對不同組間樣本中優(yōu)勢物種組成及豐度利用群落Bar圖進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，各組樣本中優(yōu)勢物種在屬的水平均包含擬桿菌屬（Bacteroids），厚壁菌屬（Feacalibacterium），普雷沃屬（Prevotella）以及志賀菌屬（Escherichia-Shigella）。其中中醫(yī)治療優(yōu)勢人群較非優(yōu)勢人群具有更高比例的擬桿菌屬（31.1%vs.24.8%），而非優(yōu)勢人群具有更高比例的志賀菌屬（9.7% vs. 6.9%）。在門水平上，中醫(yī)治療優(yōu)勢人群厚壁菌門與擬桿菌門比值（F/B值）為0.84，中醫(yī)治療非優(yōu)勢人群F/B值為1.16。見圖8。

2.2.3 Beta多樣性

利用主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）對中醫(yī)治療優(yōu)勢及非優(yōu)勢人群腸道菌群β多樣性進(jìn)行分析，2組樣本中物種第一主成分（PC1解釋度為41.16%）出現(xiàn)一定程度的分離，而在第二主成分（PC2，解釋度22.65%）分離不顯著。見圖9。

2.2.4 物種差異分析

進(jìn)一步對中醫(yī)治療優(yōu)勢及非優(yōu)勢人群樣本的物種差異性采用student-t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，中醫(yī)治療優(yōu)勢人群具有更高比例的擬桿菌屬（30.6% vs. 23.9%，P=0.33），普雷沃氏菌屬（5.7% vs. 3.9%，P=0.69），而中醫(yī)治療非優(yōu)勢人群具有更高比例的志賀菌屬（9.4% vs. 7.2%，P=0.74），Ruminococcaceae_UCG-014（2.1% vs. 0.5%，P=0.02）。見圖10。

采用LEfSe多級物種差異性判別分析方法，從屬水平到屬水平分析不同組間菌群差異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，真桿菌屬（Eubacterium）在中醫(yī)治療優(yōu)勢人群組中較為優(yōu)勢，而放線菌門（Actinobacteria）、瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）在中醫(yī)治療非優(yōu)勢人群組中較為優(yōu)勢。見圖11。

2.3 中醫(yī)治療優(yōu)勢與非優(yōu)勢人群TB淋巴細(xì)胞亞群

2.3.1 TB淋巴細(xì)胞亞群分析

比較2組TB淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)治療優(yōu)勢人群組較非優(yōu)勢人群組具有更高的雙陰T細(xì)胞絕對值（89.6±82.0 vs. 37.1±16.5，P=0.01），以及非HLA依賴細(xì)胞毒性T細(xì)胞（83.0±43.6 vs. 28.4±18.3），P=0.01）。

2.3.2 TB淋巴細(xì)胞亞群與腸道菌群環(huán)境因子

為探討不同組間腸道菌群物種分布是否與TB淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)，將TB淋巴細(xì)胞亞群中DNT（CD4、CD8雙陰性）T細(xì)胞、非HLA依賴細(xì)胞毒性T細(xì)胞絕對值作為環(huán)境因子，在屬（Genus）水平利用RDA分析法對環(huán)境因子與中醫(yī)治療優(yōu)勢、非優(yōu)勢人群樣本及物種之間關(guān)系進(jìn)行解釋。結(jié)果顯示，DNT、非HLA依賴細(xì)胞毒性T細(xì)胞與不同組間樣本及物種之間的相關(guān)性顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.14，0.24），但具有相關(guān)性趨勢。見圖12。對DNT（CD4、CD8雙陰性）T細(xì)胞、非HLA依賴細(xì)胞毒性T細(xì)胞絕對值與物種之間相關(guān)性進(jìn)行屬（Genus）水平的Heatmap分析，結(jié)果顯示HLA依賴細(xì)胞毒性T細(xì)胞絕對值與糞厭氧棒狀菌（Anaerostipes）顯著負(fù)相關(guān)性（P=0.04）。見圖13。

3 討論

3.1 針對mCRC中醫(yī)治療優(yōu)勢人群特征及其概念的再探討

本研究通過對本團(tuán)隊(duì)一項(xiàng)中藥復(fù)方祛邪膠囊干預(yù)mCRC的RCT研究入組患者的3年隨訪以及中醫(yī)治療優(yōu)勢人群的劃分，發(fā)現(xiàn)其主要臨床特征包括女性、年齡≥65歲、腫瘤原發(fā)部位為右半結(jié)腸，且中醫(yī)治療優(yōu)勢人群中存在更少的死亡結(jié)局事件。此外，中醫(yī)治療優(yōu)勢人群與非優(yōu)勢人群在具體的癥狀負(fù)擔(dān)及中醫(yī)證型分布方面存在著一定的差異。上述結(jié)果與本團(tuán)隊(duì)前期在晚期結(jié)直腸癌中醫(yī)優(yōu)勢人群特征的研究結(jié)果相一致，為中醫(yī)治療優(yōu)勢人群的判別提供了更進(jìn)一步的臨床特征依據(jù)，并再次提示中醫(yī)對通過西醫(yī)常規(guī)治療難以獲益的mCRC人群治療中可能存在更為明顯的優(yōu)勢，并能夠幫助患者獲得一定程度上的生存獲益。

3.2 腸道菌群對mCRC中醫(yī)治療優(yōu)勢人群的預(yù)測價(jià)值和療效機(jī)制闡釋

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)中醫(yī)優(yōu)勢人群及非優(yōu)勢人群在腸道菌群多樣性、物種組成方面均存在一定的差異，如中醫(yī)治療優(yōu)勢人群與中醫(yī)治療非優(yōu)勢人群相比有更高比例的擬桿菌屬，而非優(yōu)勢人群具有更高比例的志賀菌屬。腸道菌群的組成和多樣性受個(gè)體因素如年齡、性別、免疫系統(tǒng)和環(huán)境因素包括飲食習(xí)慣和藥物使用的影響[16]。研究表明，與結(jié)直腸癌患者相比，健康人群中厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門占有更明顯的優(yōu)勢，表明上述細(xì)菌物種是CRC的保護(hù)因素[17]。其中擬桿菌屬是居住在人類胃腸道中最大的革蘭陰性菌，在維持健康腸道平衡穩(wěn)定、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收代謝等方面發(fā)揮重要的作用[18]。因此擬桿菌屬的分布比例可能是mCRC中醫(yī)治療優(yōu)勢人群的特征性生物標(biāo)志物，也可能是中藥治療晚期結(jié)直腸癌潛在治療靶點(diǎn)。而非優(yōu)勢人群中所占比例較高的志賀菌屬是革蘭陰性、不活動(dòng)兼厭氧病原體，與大腸桿菌密切相關(guān)且具有極強(qiáng)的毒性，是導(dǎo)致胃腸道感染和急性痢疾的主要病原體之一[19]。有研究表明，志賀菌屬通過M細(xì)胞穿過結(jié)腸上皮層，從基底外側(cè)面入侵結(jié)腸上皮細(xì)胞從而造成感染[20]，在穿過結(jié)腸黏膜時(shí)產(chǎn)生多種去調(diào)節(jié)機(jī)制導(dǎo)致促炎環(huán)境啟動(dòng)，伴隨大量免疫細(xì)胞的死亡，包括巨噬細(xì)胞焦磷酸癥以促進(jìn)其在上皮內(nèi)成活和沿結(jié)腸上皮擴(kuò)散[21]。這一結(jié)果提示中醫(yī)治療非優(yōu)勢人群其腸道內(nèi)仍存在炎癥感染，且腸道內(nèi)志賀菌屬豐度上升可能與中藥治療干預(yù)療效負(fù)相關(guān)。上述結(jié)果提示，通過16sRNA技術(shù)檢測mCRC患者腸道中富集的菌株、進(jìn)而分析特定菌群標(biāo)志物，有可能為評估晚期結(jié)直腸癌患者是否能從中醫(yī)治療中獲益提供客觀評估和參考依據(jù)。

3.3 TB淋巴細(xì)胞與腸道菌群在中醫(yī)治療優(yōu)勢人群中的相互作用

在外周血TB淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)治療優(yōu)勢人群組較非優(yōu)勢人群組具有更高比例的DNT細(xì)胞以及非HLA依賴細(xì)胞毒性T細(xì)胞。DNT細(xì)胞被認(rèn)為是非傳統(tǒng)的T細(xì)胞，近年來一些研究表明DNT有很強(qiáng)的抗腫瘤作用[22]，并且擴(kuò)增的DNT在體外產(chǎn)生高水平的干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）[23]，對惡性腫瘤有積極的治療作用。非HLA依賴細(xì)胞毒性T細(xì)胞是既表達(dá)自然殺傷細(xì)胞又表達(dá)T細(xì)胞相關(guān)受體的一類特殊的T淋巴細(xì)胞亞群，具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性，可通過多種途徑直接殺傷腫瘤細(xì)胞[24]，并且自然殺傷性T細(xì)胞（Natural Killer T Cell，NKT細(xì)胞）細(xì)胞激活后可分泌細(xì)胞因子，從而激活免疫細(xì)胞起到抗腫瘤免疫的作用[25]。惡性腫瘤患者外周血中I型NKT細(xì)胞比例增高與良好的治療效果有關(guān)[26]，這與本研究的結(jié)果相一致。因此我們認(rèn)為，中醫(yī)藥干預(yù)mCRC的療效機(jī)制很可能與調(diào)控NKT細(xì)胞參與機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)相關(guān)，其比例的增高有可能是中醫(yī)治療優(yōu)勢人群治療療效的標(biāo)志。對DNT細(xì)胞、非HLA依賴細(xì)胞毒性T細(xì)胞絕對值與物種之間相關(guān)性分析提示非HLA依賴細(xì)胞毒性T細(xì)胞絕對值與糞厭氧棒狀菌（Anaerostipes）呈顯著負(fù)相關(guān)性。目前已知糞厭氧棒狀菌具有預(yù)防和治療相關(guān)炎癥疾病的作用，但其具體與NKT細(xì)胞的相關(guān)作用尚未有文獻(xiàn)報(bào)道，還需進(jìn)一步的研究探討。

3.4 局限性與結(jié)論

本研究存在以下局限性：首先，研究中患者糞便標(biāo)本均在基線采集，而在患者長期隨訪過程中其腸道菌群多樣性及物種分布也可能發(fā)生一定的變化，因此下一步研究需將患者腸道菌群進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測，從而能夠?yàn)橹嗅t(yī)治療優(yōu)勢的預(yù)測提供更為翔實(shí)的參考依據(jù)。其次，本研究患者均參與了RCT研究入組，盡管干預(yù)時(shí)間僅一個(gè)月，但仍存在祛邪膠囊觀察組及安慰劑組之間的療效與菌群調(diào)節(jié)差異[27]，需要在今后的研究中控制這些可能的影響因素。此外，腸道菌群宏基因組技術(shù)能夠?qū)Σ煌M間患者腸道菌群的基因功能、基因組含量和差異進(jìn)行分析，可為進(jìn)一步明確微生物群在中醫(yī)藥治療晚期結(jié)直腸癌患者治療過程中的潛在作用機(jī)制提供更為深入的研究方法。目前研究基于外周血淋巴細(xì)胞亞群與腸道菌群多樣性進(jìn)行相關(guān)分析，并不能代表腸道菌群在結(jié)直腸固有層中遇到的全部淋巴細(xì)胞亞群，可通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對腸道局部菌群的標(biāo)本進(jìn)行采集和分析。另外，本研究是基于前期臨床研究進(jìn)行的隨訪且樣本量較小，還需擴(kuò)大樣本量來進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證，從而不斷完善中醫(yī)優(yōu)勢人群特征。盡管如此，研究首次提出mCRC中醫(yī)治療優(yōu)勢人群與非優(yōu)勢人群在腸道菌群分布以及TB淋巴細(xì)胞亞群特征方面存在顯著差異且具有一定相關(guān)性，并為進(jìn)一步闡釋中醫(yī)優(yōu)勢人群特征及療效機(jī)制提供了必要的客觀科學(xué)依據(jù)。

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（2021-03-10收稿 責(zé)任編輯：徐穎）