尿促皮質(zhì)素同源肽誘導乳大鼠心肌細胞肥大作用的比較

梁春光，黃雷，佟彤

(1.錦州醫(yī)科大學護理學院；2.錦州市藥品檢驗檢測中心，遼寧 錦州 121000)

促尿皮質(zhì)素(UCN)是在1995年新發(fā)現(xiàn)的一個神經(jīng)肽，與UCNⅡ和UCNⅢ是促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing factor，CRF)的家族成員，通過與CRF受體結(jié)合而發(fā)揮其生理作用。UCN能夠與CRF受體1和2結(jié)合，而UCNⅡ和UCNⅢ與CRF受體2具有更高的結(jié)合能力。研究發(fā)現(xiàn)，UCN對心臟具有保護作用，是一個很重要的心血管活性肽[1]。UCN對心臟具有正性肌力作用、缺血再灌心肌的保護作用及促進心肌肥厚作用。而且大量實驗也表明，UCN的心血管作用與細胞內(nèi)Ca2+機制有關(guān)[2-3]，而且Ca2+信號在心肌肥厚和基因表達發(fā)揮著重要作用[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，L-型Ca2+通道阻滯劑維拉帕米能夠抑制異丙腎上腺素(ISO)誘導的心肌肥厚[6]。本實驗室曾經(jīng)多次報道了不同藥物對心肌細胞的肥大作用的作用機制[7-9]。而UCN同源肽誘導心肌細胞肥大與鈣離子之間的關(guān)系鮮有報道。

心肌肥厚是高血壓、心衰后心肌的一種代償性表現(xiàn)，是心臟病人猝死的一種重要的危險因素，所以心肌肥厚的相關(guān)研究受到了學者的重視。本研究將進一步探討尿皮質(zhì)素同源肽誘導心肌肥厚可能的作用機制，通過比較尿皮質(zhì)素同源肽誘導心肌細胞肥大，觀察尿皮質(zhì)素同源肽誘導心肌肥大與心肌細胞[Ca2+]i的關(guān)系。

1 實驗材料與方法

1.1 藥品與試劑

UCN，UCNⅡ，UCNⅢ及異丙腎上腺素(ISO)均為美國Sigma公司；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、小牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶為杭州四季青生物工程材料有限公司；ANP一抗：Millipore公司；[3H]亮氨酸為上海原子核研究所產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗動物

本實驗由錦州醫(yī)科大學實驗動物中心提供的出生2～4 d的SD大鼠的乳鼠完成，實驗動物雌雄不受限制。

1.3 心肌細胞培養(yǎng)

無菌環(huán)境下，將剛出生2～4 d的乳鼠心臟取出，然后放在Hanks液里面，反復沖洗3次，使用滅菌小剪刀迅速將心臟剪成小碎塊，再使用胰酶(0.8 g/L)在磁力攪拌下消化分散細胞，將分散后得的心肌細胞加入含84%DMEM培養(yǎng)基和15%小牛血清的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有100 mg/L鏈霉素和1×100 Ku/L青霉素雙抗。將細胞懸液經(jīng)過反復吹打，吹打均勻后將細胞以1×109/L的接種密度接種于24孔培養(yǎng)板上，放入通以95%空氣及5%CO2的孵箱中進行細胞培養(yǎng)。

1.4 分組及給藥方法

心肌細胞常規(guī)培養(yǎng)2 d后，進行細胞換液，換液降低血清濃度是為了減少血清成分對實驗結(jié)果的影響，更換的液體為含0.04% 小牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中按照實驗分組加入各種濃度的試劑。實驗分成正常對照組、ISO組(10 μmol/L)、UCN組(0.1 μmol/L)、UCNⅡ組(0.1 μmol/L)、UCNⅢ組(0.1 μmol/L)。各項指標的測定時間為給藥后48 h。

1.5 培養(yǎng)心肌細胞體積的測量

通過測量細胞直徑獲得培養(yǎng)的心肌細胞體積。取出培養(yǎng)板，將長滿心肌細胞的培養(yǎng)孔用D-Hanks液快速沖洗3次，然后每個培養(yǎng)孔中加入0.3 mL胰酶(1 g/L)，將培養(yǎng)板再次放入37 ℃恒溫箱中消化30 min，取出培養(yǎng)板終止消化，方法是在每個培養(yǎng)孔中加入0.2 mL含有0.1體積分數(shù)血清的培養(yǎng)基；將消化下來的細胞完全收集，注入底部放置一個經(jīng)硅化的蓋玻片的細胞室內(nèi)，硅化的蓋玻片可以防止心肌細胞貼壁；于倒置顯微鏡下觀察細胞，顯微鏡放大400倍，心肌細胞均呈圓球形。測量單個細胞的直徑，按照文獻方法計算出單個細胞的體積，每組檢測的細胞數(shù)見文獻[9]65-68。

1.6 測定心肌細胞蛋白質(zhì)的合成

將培養(yǎng)48 h 后已經(jīng)成活的心肌細胞，更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中含有37 TBq/L [3H]亮氨酸及不同濃度UCN等試劑。加藥后再培養(yǎng)48 h 。棄去培養(yǎng)液，冷Hank液沖洗細胞3 遍。使用1 mL SDS(10 g/L)溶解細胞，使用三氯醋酸(50 g/L)沉淀蛋白。應(yīng)用GF/C過濾，烘干濾膜，放置在含有體積分數(shù)為4×10-3PPO的二甲苯溶液的閃爍杯中。用液閃儀測量[3H] 亮氨酸的結(jié)合，分析蛋白的合成。每個孔的細胞計數(shù)及實驗結(jié)果的表示見文獻[10]。

1.7 測定心肌細胞蛋白質(zhì)的含量

棄掉培養(yǎng)板各孔中的培養(yǎng)液，用D-Hanks液快速沖洗3次后，加入0.5 mL SDS(10 g/L)溶解細胞。每孔細胞計數(shù)約為5×105個，使用Lowry方法測定每孔心肌細胞的蛋白含量。

1.8 Western蛋白印跡法測定心肌細胞ANP的表達

細胞加藥培養(yǎng)48 h后，取樣備用。取出樣品加入PMSF(10 g/L)，超聲裂解離心后取上清。應(yīng)用BCA法測定蛋白濃度。上樣緩沖液并煮沸。10 μL樣品以及蛋白質(zhì)標準物點樣。垂直電泳3～5 h，轉(zhuǎn)膜8～12 h；封閉，洗膜，稀釋后的兔抗大鼠ANP(1∶200)室溫反應(yīng)2 h，二抗(1∶1500)反應(yīng)1 h，顯影劑顯影。顯影條帶處理方式及實驗結(jié)果表示方式見文獻[9,11]65-68。

1.9 培養(yǎng)心肌細胞鈣離子瞬間變化([Ca2+]i)的測定

將生長有自發(fā)性搏動的心肌細胞的蓋玻片置于含有Fura-2/AM(3 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃水浴中避光孵育30 min后，取出蓋玻片，用HEPES緩沖液沖洗。將蓋玻片放于熒光顯微鏡下的灌流槽中，用恒溫37 ℃灌流速度為1 mL/min 的HEPES緩沖液灌流，并按照指定時間于灌流液中加入實驗用藥。TiLL陽離子測定系統(tǒng)為測定儀器。激發(fā)光波長分別為340 nm及380 nm，300 ms為采樣間隙。計算心肌細胞[Ca2+]i的方法見文獻[12]。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 UCN同源肽對心肌細胞體積的影響

與正常對照組相比，ISO、UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細胞體積分別增加了56.6%、32.9%、57.8%和31.4%，與ISO的肥大作用相比，UCNⅡ心肌細胞體積增加的程度更大，增加了57.8%。UCN及UCN Ⅲ組心肌細胞體積增加的程度相似，都比ISO組弱一些。UCN同源肽中UCNⅡ作用最強，見圖1。

藥物同時分別加入不同組別培養(yǎng)液中培養(yǎng)細胞個細胞；與對照組比較，##P<0.01

2.2 UCN同源肽對心肌細胞蛋白質(zhì)合成的影響

與正常對照組相比，ISO、UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細胞蛋白質(zhì)合成分別增加了77.02%、39.8%、47.3%和38.4%。與ISO的肥大作用相比，UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細胞蛋白質(zhì)合成增加的程度相似，都比ISO組弱一些。UCN同源肽中UCNⅡ作用最強，見圖2。

2.3 UCN同源肽對心肌細胞蛋白質(zhì)含量的影響

與正常對照組相比，ISO、UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細胞蛋白質(zhì)合成分別增加了56.2%、33.3%、17.6%和30.3%。與ISO的肥大作用相比，UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細胞蛋白質(zhì)含量增加的程度相似，都比ISO組弱一些。UCN同源肽中UCNⅡ作用最強，見圖3。

與對照組比較，##P<0.01

與對照組比較，##P<0.01

2.4 UCN同源肽對心肌細胞ANP表達含量的影響

與正常對照組相比，ISO、UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細胞ANP表達含量明顯增加了。與ISO的肥大作用相比，UCN、UCNⅡ及UCN Ⅲ組心肌細胞ANP表達含量增加的程度相似，都比ISO組弱一些。UCN同源肽中UCNⅡ作用最強，見圖4。

2.5 UCN同源肽對心肌細胞[Ca2+]i瞬間變化的影響

ISO及UCN同源肽均未明顯改變正常心肌細胞[Ca2+]i瞬間變化。ISO及UCN同源肽能夠增高心肌細胞內(nèi)鈣離子瞬間變化的幅度，但是基線水平?jīng)]有變化，增快了心肌細胞自發(fā)頻率，對心肌細胞內(nèi)靜息鈣的負荷均無影響，其中ISO的作用最強，見圖5。

A：ANP蛋白表達和β-actin 蛋白表達；B：ANP/β-actin 半定量結(jié)果；與對照組比較，#P<0.05

A：心肌細胞內(nèi)代表性Ca2+變化曲線，UCN同源肽對靜息[Ca2+]i 水平；B：Ca2+ 變化幅度；C：Ca2+的定量分析；D：頻率，與正常對照組比較，#P<0.05

3 討 論

心肌肥厚作用是心臟的一種很重要的調(diào)整機制，是心臟負荷過重時一種代償表現(xiàn)，是心肌細胞對高血壓、瓣膜病、急性心肌梗死等常見臨床疾病的一種基本反應(yīng)。以上心臟疾病的初始階段，心臟通過平衡應(yīng)激的增加改善心臟的功能使心肌肥厚，但是長時間的壓力會導致心肌持續(xù)性增厚，最終心臟功能會嚴重失衡從而發(fā)生心力衰竭，因此成為心血管病患者死亡的重要原因之一。因此研究心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過程中的信號轉(zhuǎn)導機制和確定此作用中的調(diào)節(jié)因子非常重要。

許多研究已經(jīng)表明，UCN同源肽是很重要的心血管活性肽。有研究說明UCN正性肌力作用的分子機制主要通過cAMP-PKA信號途徑介導[13]。許多研究表明，UCN具有心肌的保護作用，這種保護作用可以通過MAPK p42/44[2]568-571、PI3K-Akt[14]、PKCε[15]等信號途徑介導。許多研究已經(jīng)表明，[Ca2+]i變化是心肌肥大的一個信號。多種鈣調(diào)節(jié)酶傳導不同的作用信號從而出現(xiàn)[Ca2+]i的改變，其中Ca2+/CaMK家族中的鈣調(diào)素依賴蛋白激酶就是最重要的一種酶，在此過程中發(fā)揮重要作用[4,9]1314-1321,65-68。PKC是一種依賴Ca2+、磷脂的蛋白激酶，可以與Ca2+相互調(diào)節(jié)而達到基因表達和細胞增殖等長期反應(yīng)。

異丙腎上腺素是一個公認的誘導心肌細胞肥大的試劑，本實驗將UCN同源肽與異丙腎上腺素的致心肌細胞肥大作用進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在UCN同源肽中，UCNⅡ的致心肌細胞肥大作用最強，與文獻報道[16]結(jié)果一致。

綜上所述，UCN同源肽與異丙腎上腺素一樣能夠使心肌細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化。UCN同源肽使心肌細胞內(nèi)鈣離子瞬間變化幅度增高，但不影響基線水平，對心肌細胞內(nèi)靜息鈣負荷均無影響，使心肌細胞自發(fā)頻率加快，說明UCN同源肽致心肌細胞肥大可能通過影響細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)起作用。本實驗室曾報道UCN可以通過影響蛋白激酶A信號途徑，影響L-型鈣通道改變心肌細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)起到致心肌細胞肥大作用[17]。但是對于UCNⅡ及UCNⅢ引起鈣離子改變是首次研究。細胞內(nèi)鈣離子發(fā)生改變，可能由于細胞內(nèi)鈣釋放還能是細胞外鈣離子內(nèi)流，但是UCN同源肽引起心肌細胞內(nèi)鈣離子改變的具體機制尚未明了，還需要具體研究。UCN同源肽致心肌細胞肥大的作用機制研究曾發(fā)現(xiàn)它們是通過不同的信號通路完成的，那么它們引起細胞內(nèi)鈣離子改變是否通過不同的機制尚需要研究。