辣蓼黃酮提取物對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞內(nèi)免疫相關(guān)酶活性的影響

王良剛，成 靜，謝小東，季 露，孫鈺博，胡庭俊，韋英益，覃志彪

（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005）

南美白對蝦是一種甲殼類動物，缺乏完整的特異性免疫機(jī)制。當(dāng)南美白對蝦受到有害刺激時(shí)，機(jī)體的免疫應(yīng)答主要依靠非特異性免疫反應(yīng)完成[1]。南美白對蝦的甲殼和表皮構(gòu)成了第一道非特異性屏障，細(xì)胞免疫和體液免疫協(xié)同完成機(jī)體的免疫應(yīng)答。因南美白對蝦體內(nèi)缺乏免疫球蛋白，其體液免疫主要依靠非特異性的酶或者其他免疫因子共同完成[2-3]，南美白對蝦血淋巴細(xì)胞則承擔(dān)著十分重要的免疫保護(hù)職責(zé)。酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、酚氧化酶（PO）和超氧化物歧化酶（SOD）等是幾種典型的非特異性免疫酶，能夠反映細(xì)胞的免疫能力。辣蓼的主要化學(xué)成有黃酮類、揮發(fā)油、糅質(zhì)類、脂肪酸、三萜類、蒽醌、糖苷和蓼酸等。研究表明，辣蓼主要成分黃酮具有生物抗氧化性、清除自由基、殺蟲、抑菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛止血等多種生物活性[4]。本研究通過體外分離和培養(yǎng)南美白對蝦血淋巴細(xì)胞后，將不同濃度的辣蓼黃酮提取物添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中，觀察其對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞存活率的影響，并測定細(xì)胞內(nèi)ACP、AKP、PO和SOD等非特異性免疫酶的活性，探討辣蓼黃酮提取物對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

健康的南美白對蝦600尾，體長為12～15 cm，購自廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院南美白對蝦良種基地。

1.2 試驗(yàn)材料

辣蓼黃酮提取物，為廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室采用醇沉法提取后制成的制劑，測定其黃酮含量約為7.51%。

黃芪多糖，淡黃色粉末，購自北京生泰爾生物有限公司，總糖含量為70%。

1.3 試劑及儀器

胎牛血清購自Biological industries；DMEM購自Gibco公司；DMSO和左旋多巴（L-DOPA）購自北京索萊寶科技有限公司；酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶等試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）購自碧云天。

MCO-170AICDL-PC二氧化碳培養(yǎng)箱（Panasonic）、EnSpire多功能酶標(biāo)儀（Perkin Elmer）、CD-UPT-II-20L純水儀（成都越純科技有限公司）、5430R高速冷凍臺式離心機(jī)（EPPENDORF）。

1.4 試劑配制

1.4.1 DMEM完全培養(yǎng)液

DMEM按照說明書進(jìn)行配制后，加入胎牛血清（10%）、青霉素（1%）和鏈霉素（1%）。

1.4.2 不同濃度辣蓼黃酮提取物培養(yǎng)液

使用終濃度為0.5%DMSO溶解辣蓼黃酮提取物，然后使用DMEM完全培養(yǎng)液將其稀釋成濃度為1 600μg/mL的辣蓼提取物，15 000 r/min，離心30 min，棄去沉淀；濾過除菌后再加入DMEM完全培養(yǎng)液進(jìn)行倍比稀釋為不同濃度（800、400、200、100、50、25、12.5μg/mL）。

1.4.3 對照藥物培養(yǎng)液

使用DMEM培養(yǎng)液溶解黃芪多糖至濃度為1 600μg/mL，濾過除菌后再加入DMEM培養(yǎng)液倍比稀釋為 不 同 濃 度（800.0、400.0、200.0、100.0、50.0、25.0、12.5μg/mL）的黃芪多糖培養(yǎng)液。

1.4.4 0.5%DMSO培養(yǎng)液

向DMEM培養(yǎng)液中添加0.5%體積的DMSO。

1.5 南美白對蝦血淋巴細(xì)胞的體外分離與培養(yǎng)

取健康南美白對蝦，清洗體表，在0.01%的高錳酸鉀溶液中浸泡5 min，雙蒸水沖洗。用酒精棉球消毒頭胸甲與腹部交界處，使用無菌注射器吸取適量抗凝劑（5%檸檬酸三鈉），血竇采血，將其注射到15 mL無菌Ep管中（每管約盛10 mL），輕輕混勻，加少量抗凝劑調(diào)整配平；4℃條件下，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入DMEM完全培養(yǎng)液吹打均勻重懸沉淀細(xì)胞，稀釋細(xì)胞濃度至8×106個(gè)/mL。

1.6 辣蓼黃酮提取物對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞活性的影響

1.6.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，為避免邊緣效應(yīng)，將培養(yǎng)板外圍一圈每孔加入200μL PBS后使用。試驗(yàn)設(shè)置細(xì)胞對照組、DMSO對照組、辣蓼黃酮不同劑量組（1 600.0、800.0、400.0、200.0、100.0、50.0、25.0、12.5μg/mL）和黃芪多糖不同劑量組（1 600.0、800.0、400.0、200.0、100.0、50.0、25.0、12.5μg/mL）。各組每孔各加入200μL的細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)12 h左右（29℃，5%CO2），待細(xì)胞貼壁后小心棄去上清液。向細(xì)胞對照組加入200μL DMEM培養(yǎng)液；向各藥物組每孔加入200μL不同濃度的辣蓼黃酮提取物培養(yǎng)液或不同濃度的黃芪多糖培養(yǎng)液；向DMSO組加入200μL 0.5%DMSO對照培養(yǎng)液；每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

1.6.2 CCK8法測定細(xì)胞活力

將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱敷育24 h后棄去上清，使用PBS小心對細(xì)胞進(jìn)行3次洗滌。避光操作下，向每孔加入200μL DMEM培養(yǎng)液及20μL CCK8培養(yǎng)敷育1 h，在450 nm處檢測吸光值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞活力：

1.7 辣蓼黃酮提取物對南美白對蝦細(xì)胞內(nèi)免疫相關(guān)酶活性的影響

1.7.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用24孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每孔加入1.0 mL的細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)12 h（29℃，5%CO2）。待細(xì)胞貼壁后輕輕吸取并棄去上清液，空白對照組每孔加入1.0 mL DMEM培養(yǎng)液；對照藥物組每孔加入1.0 mL濃度為100μg/mL的黃芪多糖培養(yǎng)液；辣蓼藥物組每孔加入1.0 mL相應(yīng)濃度（12.5～100.0μg/mL）的辣蓼黃酮提取物培養(yǎng)液；將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)一段時(shí)間（4、8、12、24 h）。輕輕棄去上清，用PBS小心對細(xì)胞進(jìn)行3次洗滌，加入1.0 mL PBS溶液，仔細(xì)刮下細(xì)胞，收集備用。

1.7.2 ACP、AKP、PO和SOD酶活性的測定

細(xì)胞內(nèi)ACP、AKP和SOD等酶活性測定按照相應(yīng)試劑盒的操作說明進(jìn)行。細(xì)胞內(nèi)PO的活性測定參照Ashida[7]的方法進(jìn)行調(diào)整，依次向96孔板中加入100μL濃度為0.1 mol/L pH值6.0的磷酸鉀緩沖液、100μL待測液、100μL 0.01 mol/L的L-DOPA液，在490 nm處測定OD值，每2 min測定1次，連續(xù)測定20 min，以O(shè)D值增加0.001為1個(gè)酶活力單位。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣蓼黃酮提取物對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞活力的影響（見表1）

由表1可知，與細(xì)胞對照組相比，0.5%DMSO對照組的細(xì)胞活力無顯著差異（P＞0.05）；濃度為12.5～50μg/mL辣蓼黃酮提取物能顯著提高南美白對蝦血淋巴細(xì)胞活力，其中25μg/mL辣蓼黃酮提取物試驗(yàn)組差異顯著（P＜0.05），50μg/mL辣蓼黃酮提取物試驗(yàn)組差異極顯著（P＜0.01）；辣蓼黃酮提取物濃度為400～1 600μg/mL時(shí)，極顯著減弱對蝦血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞活力（P＜0.01）。而黃芪多糖藥物對照組的濃度為12.5μg/mL和200μg/mL時(shí)，與細(xì)胞對照組比較差異不顯著（P＞0.05），濃度為25～100μg/mL的黃芪多糖極顯著增強(qiáng)細(xì)胞活力（P＜0.01），黃芪多糖濃度為400～1 600μg/mL時(shí)，極顯著減弱細(xì)胞活力（P＜0.01）。結(jié)果表明，一定濃度的辣蓼黃酮提取物可提高南美白對蝦血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞活性，并選取濃度為12.5～100.0μg/mL的辣蓼黃酮提取物作為后續(xù)試驗(yàn)藥物濃度以及100μg/mL黃芪多糖作為后續(xù)試驗(yàn)藥物對照組的濃度。

表1 南美白對蝦血淋巴細(xì)胞活力的測定結(jié)果（n=5）Tab.1 Determination of blood lymphocyteactivity of Penaeusvannamei

2.2 辣蓼黃酮提取物對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞內(nèi)免疫相關(guān)酶活性的影響（見表2～表5）

由表2可知，與空白對照組相比，南美白對蝦血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)4 h后，12.5μg/mL辣蓼黃酮提取物能顯著提高細(xì)胞中的ACP活性（P＜0.05），濃度為50μg/mL時(shí)，極顯著提高細(xì)胞中的ACP活性（P＜0.01）；培養(yǎng)8 h后，100μg/mL的黃芪多糖和100μg/mL的辣蓼黃酮提取物能極顯著提高細(xì)胞中的ACP活性（P＜0.01）；培養(yǎng)12 h后，12.5μg/mL辣蓼黃酮提取物升高細(xì)胞中的ACP活性，但差異不顯著（P＞0.05），而25μg/mL和50μg/mL的辣蓼黃酮提取物能極顯著降低細(xì)胞內(nèi)ACP活性（P＜0.01）；培養(yǎng)24 h后，各試驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)ACP活性與對照組比較差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，一定濃度辣蓼黃酮提取物能提高南美白對蝦血淋巴細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶（ACP）的活性。

表2 辣蓼黃酮提取物對南美白對蝦淋巴細(xì)胞內(nèi)ACP活性的影響Tab.2 Effect of FPH on ACPactivity in lymphocytesof Penaeusvannamei 單位：U/g prot

由表3可知，與空白對照組相比，第4 h時(shí)，50μg/mL的辣蓼黃酮提取物能極顯著提高細(xì)胞內(nèi)AKP活性（P＜0.01）；第8 h時(shí)，25μg/mL辣蓼黃酮提取物能顯著提高細(xì)胞中的AKP活性（P＜0.05），50μg/mL和100μg/mL辣蓼黃酮提取物能極顯著提高細(xì)胞內(nèi)AKP活性（P＜0.01）；培養(yǎng)第12 h時(shí)，50μg/mL、100μg/mL辣蓼黃酮提取物能極顯著提高細(xì)胞內(nèi)AKP活性（P＜0.01），100μg/mL的黃芪多糖能顯著提高細(xì)胞內(nèi)AKP活性（P＜0.05）；第24 h時(shí)，100μg/mL的黃芪多糖和濃度為12.5～100μg/mL的辣蓼黃酮提取物均能極顯著提高細(xì)胞內(nèi)AKP活性（P＜0.01）。結(jié)果表明，辣蓼黃酮提取物能顯著提高南美白對蝦血淋巴細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（AKP）活性。

表3 辣蓼黃酮提取物對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞內(nèi)AKP活性的影響Tab.3 Effect of FPH on AKPactivities in lymphocytes of Penaeus vannamei 單位：U/g prot

由表4可知，與空白對照組相比，第4 h時(shí)，濃度為100μg/mL的黃芪多糖和12.5～100.0μg/mL的辣蓼黃酮提取物均能極顯著提高細(xì)胞內(nèi)PO活性（P＜0.01）；第8 h時(shí)，100μg/mL的黃芪多糖和50～100μg/mL的辣蓼黃酮提取物均能極顯著提高細(xì)胞內(nèi)PO活性（P＜0.01）；第12 h和24 h時(shí)，100μg/mL的黃芪多糖和12.5～100.0μg/mL的辣蓼黃酮提取物均能極顯著提高細(xì)胞中的PO活性（P＜0.01）。結(jié)果表明，辣蓼黃酮提取物能顯著升高細(xì)胞內(nèi)PO活性。

表4 辣蓼黃酮提取物對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞內(nèi)PO活性的影響Tab.4 Effect of FPH on POactivities in lymphocytes of Penaeus vannamei 單位：U/g prot

由表5可知，與空白對照組相比，第4 h時(shí)，100μg/mL的黃芪多糖和25μg/mL的辣蓼黃酮提取物均能顯著提高細(xì)胞內(nèi)SOD活性（P＜0.05）；第8 h時(shí)，100μg/mL的黃芪多糖能極顯著提高細(xì)胞中的SOD活性（P＜0.01），50μg/mL的辣蓼黃酮提取物均能顯著提 高 細(xì) 胞 內(nèi)SOD活 性（P＜0.05）；第12 h時(shí)，12.5～100.0μg/mL的辣蓼黃酮提取物均能極顯著提高細(xì)胞中的SOD活性（P＜0.01）；第24 h時(shí)，100μg/mL的黃芪多糖能顯著提高細(xì)胞中的SOD活性（P＜0.05），12.5～50.0μg/mL的辣蓼黃酮提取物均能極顯著提高細(xì)胞中的SOD活性（P＜0.01）。結(jié)果表明，辣蓼黃酮提取物能提高南美白對蝦血淋巴細(xì)胞內(nèi)SOD活性。

表5 辣蓼黃酮提取物對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞內(nèi)SOD活性的影響Tab.5 Effect of FPH on SOD activitiesin lymphocytesof Penaeusvannamei 單位：U/g prot

3 討論

南美白對蝦與其他無脊椎動物一樣，沒有獲得性免疫系統(tǒng)，它們僅靠由種系基因編碼而成的一種“模式識別受體”以及其相關(guān)的先天免疫系統(tǒng)來保護(hù)自身免受病原體侵害[3,5]。無脊椎動物的先天免疫系統(tǒng)是1個(gè)復(fù)雜的蛋白水解級聯(lián)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以由病原體的成分觸發(fā)[6]。南美白對蝦的免疫系統(tǒng)主要包括血淋巴中的細(xì)胞和體液免疫，其中包含的免疫分子參與了機(jī)體的防控機(jī)制，并可對環(huán)境波動作出反應(yīng)[7]。中草藥具有影響和調(diào)節(jié)動物機(jī)體免疫功能，且不易產(chǎn)生耐藥性，在蝦類養(yǎng)殖上已得到廣泛應(yīng)用[8]，例如在基礎(chǔ)飼料中分別添加甘草、板藍(lán)根和黃芪多糖復(fù)合物能有效提高蝦的生長性能、免疫功能以及改善肝胰腺組織結(jié)構(gòu)和功能[9]；茯苓能有效促進(jìn)對蝦的生長性能，而黃芪、板藍(lán)根、柴胡和甘草可以明顯提高對蝦抗病力和免疫力[10]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，DMSO對照組的南美白對蝦血淋巴細(xì)胞活力接近100%，表明以0.5%的DMSO溶液作為溶劑溶解辣蓼黃酮提取物不會對南美白對蝦細(xì)胞活性造成不利影響。而不同濃度辣蓼黃酮提取物（12.5～1 600.0μg/mL）添加至完全培養(yǎng)液后對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞活力的影響是隨藥物濃度的增加呈現(xiàn)先增加后下降變化，其中辣蓼黃酮提取物濃度在12.5～200.0μg/mL范圍內(nèi)不影響細(xì)胞活力，且濃度為25μg/mL和50μg/mL時(shí)能增強(qiáng)南美白對蝦細(xì)胞血淋巴細(xì)胞活力；在400～1 600μg/mL濃度范圍內(nèi)細(xì)胞活力均低于100%，結(jié)果表明，當(dāng)辣蓼黃酮提取物在此濃度范圍內(nèi)對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞活力具有抑制作用，且抑制作用隨藥物濃度的增高而增強(qiáng)。而不同濃度的黃芪多糖（12.5～1 600.0μg/mL）對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞活力影響也隨藥物濃度的增加出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，其中當(dāng)濃度為100μg/mL時(shí)對細(xì)胞活力的具有最顯著的增強(qiáng)作用，當(dāng)藥物濃度超過400μg/mL后，對細(xì)胞活力具有抑制作用。

已有研究表明，ACP、AKP、PO和SOD等防御酶在南美白對蝦的非特異性免疫系統(tǒng)中扮演了重要角色[11-12]。ACP是典型的溶酶體酶，能幫助消除和水解有害微生物，當(dāng)機(jī)體免疫系統(tǒng)受到侵襲時(shí)，機(jī)體內(nèi)的ACP活性會有所增強(qiáng)[13-14]。作為經(jīng)典的巨噬細(xì)胞溶酶體酶標(biāo)記物，ACP在細(xì)胞代謝中也起著重要作用，可催化磷蛋白的水解和磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移[15-16]。在本試驗(yàn)中，以濃度為12.5～100.0μg/mL辣蓼黃酮提取物對體外培養(yǎng)至4 h和8 h的南美白對蝦血淋巴細(xì)胞內(nèi)ACP活性具有一定程度的增強(qiáng)作用；當(dāng)培養(yǎng)至12、24 h時(shí)，各濃度的辣蓼黃酮提取物降低南美白對蝦血淋巴細(xì)胞內(nèi)ACP活性降低或與細(xì)胞對照組比較高差異不顯著，與匡娜等[17]通過在飼料中添加甘蓼復(fù)合微生態(tài)制劑能顯著提高對蝦血清ACP活性的研究結(jié)果一致。AKP是與代謝相關(guān)的調(diào)節(jié)酶，可被作為評估南美白對蝦免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)，AKP通過催化磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移而發(fā)揮其重要的生理功能[15]。在本試驗(yàn)中，濃度為12.5～100μg/mL辣蓼黃酮提取物試驗(yàn)組中南美白對蝦血淋巴細(xì)胞內(nèi)的AKP活性高約細(xì)胞對照組，其中50μg/mL的辣蓼黃酮提取物試驗(yàn)組差異極顯著。管振國等[18]在飼料中添加根瘤菌制劑可顯著提高南美白對蝦血清中AKP活性，本研究結(jié)果與其結(jié)果相一致。PO的活性與無脊椎動物的易感性呈負(fù)相關(guān)，是能體現(xiàn)動物免疫狀態(tài)的敏感指標(biāo)，亦可以作為評估南美白對蝦健康狀況的指標(biāo)。研究表明，中草藥具有增強(qiáng)PO活性、降低感染后死亡率的作用[13]。在本試驗(yàn)中，濃度為12.5～100.0μg/mL的辣蓼黃酮提取物試驗(yàn)組南美白對蝦血淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)至4、8 h，其細(xì)胞內(nèi)PO活性明顯升高。

在細(xì)胞正常的有氧代謝過程中，會產(chǎn)生氧自由基（ROS）和活性氧中間體（ROI）。正常情況下，機(jī)體的活性氧產(chǎn)生和消除處于相對平衡狀態(tài)[19]。過量ROS會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和丙二醛的積累，其中丙二醛具有很強(qiáng)的生物毒性并破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，還可能引起氧化應(yīng)激，而抗氧化酶（如SOD）能夠迅速清除ROS和ROI。因此，SOD也被廣泛作為甲殼類動物防御能力的評估指標(biāo)[20-22]。已有研究表明，在飼料中添加黃粉蟲蟲粉及其蟲皮[23]或根瘤菌[18]都能有效提高南美白對蝦細(xì)胞中的SOD活性。在本研究中，濃度為12.5～100.0μg/mL辣蓼黃酮提取物能升高南美白對蝦細(xì)胞內(nèi)SOD活性，從而提高對蝦機(jī)體的抗氧化能力。

4 結(jié)論

辣蓼黃酮提取物能提高體外培養(yǎng)的南美白對蝦血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞活性，并通過升高細(xì)胞內(nèi)免疫相關(guān)酶活性而增強(qiáng)對蝦的免疫功能，有望開發(fā)作為南美白對蝦的免疫增強(qiáng)劑。