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    HPLC法一測(cè)多評(píng)法對(duì)補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑中人參、三七的含量測(cè)定研究

    2021-07-29 21:11:50牟娟李健田毛子春
    云南中醫(yī)中藥雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:HPLC法含量測(cè)定

    牟娟 李健田 毛子春

    摘要:目的 創(chuàng)建應(yīng)用HPLC法對(duì)“補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑” 中含有的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1(后文稱“4種皂苷”)進(jìn)行含量測(cè)定的方法。方法 采用HPLC法。色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus C18(長(zhǎng)度:250 mm,直徑:4.6 mm,孔徑:5μm),P.N.959990—902。柱溫:30℃。流速:1.0 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng):203nm。進(jìn)樣量:10μL。流動(dòng)相:水(A)—乙腈(B),程序洗脫。結(jié)果 三七皂苷R1:線性關(guān)系在0.0829—2.0454μg范圍內(nèi)良好(R=0.9995)。平均加樣回收率為:95.17%(RSD為0.65%,n為6)。人參皂苷Rg1:線性關(guān)系在0.2944—5.1263μg范圍內(nèi)良好(R=0.9999)。平均加樣回收率為:96.81%(RSD為1.17%,n為6)。人參皂苷Rf:線性關(guān)系在0.0039—0.0586μg范圍內(nèi)良好(R=0.9993)。平均加樣回收率為:104.05%(RSD為1.78%,n為6)。人參皂苷Rb1:線性關(guān)系在0.2350—3.5256μg范圍內(nèi)良好(R=0.9999)。平均加樣回收率為:96.61%(RSD為1.33%,n為6)。結(jié)論 創(chuàng)建了應(yīng)用HPLC法對(duì)“補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”中含有的4種皂苷進(jìn)行含量測(cè)定的可信度較高的方法。

    關(guān)鍵詞:三七皂苷R1;含量測(cè)定;人參皂苷Rg1;人參皂苷Rf;補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑;人參皂苷Rb1;HPLC法

    中圖分類號(hào):R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1007-2349(2021)05-0073-05

    “補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”系醫(yī)院多年使用協(xié)定處方,臨床效果顯著。方中使用了“三七”、“人參”兩味藥材;具有“活血益氣,補(bǔ)肝腎”等功效。《中國(guó)藥典》(2015年版)一部收載的“三七”藥材,載有“散瘀止血,消腫止痛”等功效;“人參”載有“生津養(yǎng)血”等功效[1]?!把a(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”目前在標(biāo)準(zhǔn)制訂研究階段,使用HPLC法對(duì)補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑中人參、三七含有的4種皂苷進(jìn)行含量測(cè)定。對(duì)“補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”作進(jìn)質(zhì)量控制。對(duì)色譜條件、提取方法等進(jìn)行考察,來(lái)確保實(shí)驗(yàn)方法的可靠性、準(zhǔn)確性。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器 高效液相色譜儀(四元泵,DAD檢測(cè)器,自動(dòng)進(jìn)樣器),Agilent1260化學(xué)工作站;萬(wàn)分之一分析天平(賽多利斯BP211D-OCE)。

    1.2 試藥 補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑(醫(yī)院自制);人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào):110703-201128,中國(guó)食品藥品檢定研究院,含量以91.1%計(jì));人參皂苷Rf標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):110719-201505,中國(guó)食品藥品檢定研究院);人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):110704-201726,中國(guó)食品藥品檢定研究院,含量以92.4%計(jì))三七皂苷R1標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):110745-201128318,中國(guó)食品藥品檢定研究院,含量以94.0%計(jì));乙腈、甲醇(色譜純);其他化學(xué)試劑為分析純;水為超純水。

    2 方法條件選擇與結(jié)果

    2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 需要檢測(cè)的補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑中含有的這4種皂苷主要來(lái)自處方中的三七和人參,本實(shí)驗(yàn)方法的檢測(cè)波長(zhǎng)確定為203nm。是參考《中國(guó)藥典》(2015年版)一部収載的用HPLC法測(cè)定“三七”、“人參”中這4種皂苷的含量的方法。

    2.2 色譜條件的確定

    2.2.1 流動(dòng)相 本次實(shí)驗(yàn)首先參考《參考《中國(guó)藥典》(2015年版)一部収載的“三七”、“人參”標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定時(shí)的流動(dòng)相。開(kāi)展后對(duì)梯度洗脫的流動(dòng)相比例以及比例轉(zhuǎn)化時(shí)間進(jìn)行了一系列的探索[11],最終篩選出適合此次實(shí)驗(yàn)的如“表1”所示的梯度洗脫程序。使用其他條件洗脫程序,出現(xiàn)樣品中目標(biāo)物質(zhì)的吸收峰均分不開(kāi),有相鄰的吸收峰合并等問(wèn)題。

    2.2.2 柱溫 設(shè)置25、27、30℃進(jìn)行篩選[10],25、27℃目標(biāo)物質(zhì)的分離度小于1.5。柱溫為30℃時(shí),分離度才達(dá)到要求,柱溫確定30℃。

    2.2.3 色譜柱 多次實(shí)驗(yàn)確定使用ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色譜柱,分離效果好達(dá)到要求。

    3 溶液的配制

    3.1 樣品溶液的準(zhǔn)備 使用不同的溶劑如三氯甲烷、乙醚、水飽和的正丁醇等提取,采取大孔樹(shù)脂柱、氨試液等方法洗脫雜質(zhì)。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)反復(fù)對(duì)比、優(yōu)化最終確認(rèn)樣品制備方法如下。

    精密量取樣品10 mL,用三氯甲烷萃取3次,每次10 mL,棄去三氯甲烷液。再用水飽和的正丁醇萃取3次,每次20 mL;合并水飽和的正丁醇液,再用氨試液60 mL萃取,棄去氨試液;再取適量水飽和的正丁醇來(lái)洗滌分液漏斗,收集洗滌液。合并水飽和的正丁醇液于蒸發(fā)皿中,在水浴鍋上蒸干。殘?jiān)眉状既芙庵?0 mL容量瓶,甲醇定容至刻度、搖勻、濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

    3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的準(zhǔn)備 分別精密稱取一定質(zhì)量4種皂苷的標(biāo)準(zhǔn)品,加甲醇使其溶解于適當(dāng)?shù)娜萘科俊T儆眉状级ㄈ葜量潭?,制成一定濃度的“單一成分?biāo)準(zhǔn)品溶液”。精密量取一定體積上述“單一成分標(biāo)準(zhǔn)品溶液”于同一適當(dāng)?shù)娜萘科?,甲醇定容至刻度。作為“混合?biāo)準(zhǔn)品溶液”。。

    3.3 陰性對(duì)照溶液的準(zhǔn)備 根據(jù)“補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”的處方。只去除“三七”、“人參”藥材。其他的條件不變。按“補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”的制作方法制作。制成“缺三七和人參的補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”。按“3.1”項(xiàng)制備,來(lái)作為陰性對(duì)照溶液。

    4 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性

    色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus C18(長(zhǎng)度: ?[LL]250 mm,直徑:4.6 mm,孔徑:5μm),P.N.959990—902。柱溫:30℃。流速:1.0 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng):203nm。進(jìn)樣量:10μL。流動(dòng)相:水(A)—乙腈(B)。按“表1”中程序進(jìn)行梯度洗脫。三七皂苷R1的保留時(shí)間為32.75 min。人參皂苷Rg1的保留時(shí)間為44.91 min。人參皂苷Rf的保留時(shí)間為69.85 min。人參皂苷Rb1的保留時(shí)間為87.41 min。分離度均大于1.5。缺三七、缺人參的補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑作為陰性對(duì)照。在32.75、44.91、69.85、87.41 min處無(wú)吸收峰干擾。如“圖1”所示。

    5 方法學(xué)研究

    5.1 專屬性考察 按照上述色譜條件,分別取3.1、3.2、3.3項(xiàng)下溶液進(jìn)樣,采集色譜圖(見(jiàn)圖1),由圖可知,陰性對(duì)照色譜(缺三七、人參)在對(duì)照品相應(yīng)出峰位置上處無(wú)干擾峰,對(duì)測(cè)定干擾小,系統(tǒng)誤差小;對(duì)照品、樣品色譜圖(Rt=32.75、44.91、69.85、87.41 min)分離效果良好,本實(shí)驗(yàn)方法專屬性強(qiáng)。

    Ⅰ:4種皂苷的混合對(duì)照.Ⅱ:補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑樣品.Ⅲ:缺三七和人參的補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑.

    5.2 線性關(guān)系考察 用 上述確定的色譜條件。測(cè)定不同濃度的混合對(duì)照品。以三七皂苷R1標(biāo)準(zhǔn)品的含量作為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8-10]。結(jié)果如“表2”、“圖2”所示。以人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品的含量作為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如“表3”、“圖3”所示。以人參皂苷Rf標(biāo)準(zhǔn)品的含量作為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如“表4”、“圖4”所示。以人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品的含量作為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如“表5”、“圖5”所示?;貧w方程為:三七皂苷R1:y=407.18x-3.6129,線性關(guān)系在0.0829—2.0454μg范圍內(nèi)良好(R=0.9995)。人參皂苷Rg1:y=504.32x+31.652,線性關(guān)系在0.2944—5.1263μg范圍內(nèi)良好(R=0.9999)。人參皂苷Rf:y=498.04x+1.4303,線性關(guān)系在0.0039—0.0586μg范圍內(nèi)良好(R=0.9993)。人參皂苷Rb1:y=429x+0.1306,線性關(guān)系在0.2350—3.5256μg范圍內(nèi)良好(R=0.9999)。

    5.3 穩(wěn)定性考察 用準(zhǔn)備好的同一樣品溶液,用上述的色譜條件。分別在0、2、4、8、24h進(jìn)樣。來(lái)測(cè)定樣品中含有的4種皂苷的峰面積。計(jì)算4種皂苷峰面積的RSD如“表6”所示。依次為:三七皂苷R1為1.44%。人參皂苷Rg1為0.49%。人參皂苷Rf為1.53%。人參皂苷Rb1為0.69%。說(shuō)明了樣品溶液在24h內(nèi)比較穩(wěn)定。

    5.4 精密度試驗(yàn) 用“混合對(duì)照品溶液”。按上述的色譜條件。測(cè)定4種皂苷的吸收峰面積。連續(xù)測(cè)定6次。然后計(jì)算4種皂苷的峰面積RSD如“表7”所示。依次為:三七皂苷R1為0.86%。人參皂苷Rg1為0.57%。人參皂苷Rf為1.41%。人參皂苷Rb1為0.62%。說(shuō)明了使用“2.1”的色譜條件。該儀器的精密度比較良好。

    5.5 重復(fù)性考察 用準(zhǔn)備好的同一批次的6份樣品溶液,用上述的色譜條件。檢測(cè)4種皂苷的峰面積。計(jì)算他們的平均含量及RSD值如“表8”所示。結(jié)果依次為:三七皂苷:含量=0.0847 mg/mL,RSD=1.45%。人參皂苷Rg1:含量=0.3246 mg/mL,RSD=0.98%。人參皂苷Rf:含量=0.0033 mg/mL,RSD=1.49%。人參皂苷Rb1:含量=0.3087 mg/mL,RSD=0.97%。說(shuō)明此次實(shí)驗(yàn)的方法具有比較良好的重復(fù)性。

    5.6 加樣回收率考察 精密量取5 mL已知含量的樣品于分液漏斗中。再精密量取適量的“混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液”加入其中。按“3.1”樣品溶液的準(zhǔn)備方法,準(zhǔn)備6份溶液。作為加樣回收試驗(yàn)的溶液。用上述的色譜條件。進(jìn)行吸收峰面積的檢測(cè)。然后計(jì)算平均加樣回收率如“表9”、“表10”、“表11”、“表12”所示。

    5.7 供試品含量測(cè)定 用3個(gè)批次的樣品按“3.1”樣品溶液的準(zhǔn)備方法,各準(zhǔn)備2份樣品溶液。采用上述的色譜條件。對(duì)樣品中含有的4種皂苷峰面積進(jìn)行了2次檢測(cè)。然后計(jì)算出他們的平均含量如“表13”所示。

    6 結(jié)論

    本試驗(yàn)采用DAD UV HPLC色譜法測(cè)定樣品中 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1的含量,本檢驗(yàn)方法得到的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線相關(guān)系數(shù)為0.9999,精密度的RSD值小于1.5%,重復(fù)性的RSD值0.4%,加標(biāo)回收率在95.0%~105.0%間。該方法適用“補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”中含有4種皂苷的含量測(cè)定??尚哦容^高,對(duì)“補(bǔ)氣養(yǎng)血合劑”的標(biāo)準(zhǔn)起草及質(zhì)量控制有著重要的意義。

    7 討論

    對(duì)處方中同時(shí)調(diào)配三七和人參2味中藥情況,無(wú)論是在制劑還是臨床方劑中不多見(jiàn)。在常見(jiàn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中三七含量測(cè)定成分為人參皂甙Rb1、Rg1、三七皂甙R1三者總和,三七皂甙R1為三七鑒別的專屬性指標(biāo)成分;人參含量測(cè)定成分為人參皂甙Rg1、Rb1、Re三者總和,人參皂甙Rf為人參鑒別的專屬性指標(biāo)成分。本次實(shí)驗(yàn)研究在選取含量測(cè)定控制指標(biāo)性成分時(shí)選定三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf 四個(gè)對(duì)照物質(zhì)進(jìn)行控制,便于對(duì)處方中的三七和人參質(zhì)量控制。但因在同一方法中控制指標(biāo)多,在樣品分離度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性等方面要求高、難度較大;對(duì)檢測(cè)設(shè)備的性能要求較高。

    對(duì)樣品提取環(huán)節(jié)也有要求,皂苷類物質(zhì)在溶液中穩(wěn)定性不高容易發(fā)生分解。在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究階段可以通過(guò)精細(xì)控制達(dá)到不同批次樣品差異性不大。但在中試及大生產(chǎn)過(guò)程中不易控制,須在藥品研發(fā)生產(chǎn)工藝時(shí)總體控制調(diào)節(jié):如調(diào)節(jié)溶液pH值、在提取環(huán)節(jié)進(jìn)一步純化中間品等,進(jìn)一步改善藥品的穩(wěn)定性。

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