miR-34a在宮頸病變組織中的表達(dá)及其意義

王洪玉，李瑩，李雪瓊

（南陽市社旗縣婦幼保健婦產(chǎn)科，河南 南陽 473300）

宮頸癌是臨床上較為常見的婦科惡性腫瘤，在所有惡性腫瘤患者中，宮頸癌導(dǎo)致的患者病死風(fēng)險比例具有逐年上升的趨勢[1]。臨床上的隨訪觀察發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者的年平均發(fā)病率可超過848/10萬人以上，同時在合并HPV18等高危型病毒感染的群體中，宮頸癌的發(fā)病率可持續(xù)上升[2]。在研究宮頸癌的發(fā)病機(jī)理的過程中，發(fā)現(xiàn)基因水平的改變，能夠通過影響到癌基因的激活，加劇癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控的異常，最終促進(jìn)宮頸柱狀上皮細(xì)胞的病變。微小RNA34a（miR-34a）是非編碼RNA家族成員，其能夠通過影響下游癌基因轉(zhuǎn)錄啟動子的激活程度，干擾癌基因的激活和抑癌基因的沉默，最終影響惡性腫瘤的發(fā)生[3]。相關(guān)的臨床研究背景中，可以發(fā)現(xiàn)有部分研究者探討了其他亞型RNA與宮頸癌的關(guān)系[4]，但缺乏對于miR-34a的分析。為了揭示miR-34a的表達(dá)與宮頸癌患者的病情關(guān)系，從而為臨床上宮頸癌的診療提供參考，本次研究選取2015年1月-2018年3月本院收集的80例宮頸癌組織標(biāo)本，探討了miR-34a的表達(dá)情況，報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2015年1月-2018年3月本院收集的80例宮頸癌組織標(biāo)本為宮頸癌組、80例宮頸上皮瘤變組織為CIN組、正常宮頸組織40例為對照組。宮頸癌組,年齡36～65歲,平均55.8±8.0歲；FIGO分期：Ⅰ期22例、Ⅱ期27例、Ⅲ期23例、Ⅳ期8例;腫瘤經(jīng)病理學(xué)檢查分化程度：高分化24例、中分化27例、低分化29例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例；腫瘤直徑≥3cm 38例、＜3cm 42例；肌層浸潤＞1/2 31例。CIN組,年齡36～62歲,平均54.1±7.5歲；CINⅠ級25例、CINⅡ級37例、CINⅢ級18例。對照組,年齡40～65歲，平均56.0±9.1歲。三組研究對象的年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) 診斷標(biāo)準(zhǔn)：宮頸癌、宮頸上皮瘤變的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會制定的標(biāo)準(zhǔn)[5]；納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴患者年齡65歲以內(nèi)；⑵經(jīng)病理學(xué)檢查確診；⑶既往無放化療病史、免疫性治療史；⑷對照組為正常宮頸組織；⑸本研究符合《赫爾透辛基宣言》相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理規(guī)定。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴其他部位惡性腫瘤；⑵類風(fēng)濕、免疫系統(tǒng)疾?。虎琴Y料缺失；⑷未經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)。

1.3 方法 采用組織研磨的方法進(jìn)行組織細(xì)胞中RNA的提取，在無酶的操作條件下加入焦炭酸二乙酯，測量RNA濃度后，逆轉(zhuǎn)錄成cRNA后進(jìn)行基因擴(kuò)增，采用primer 5軟件進(jìn)行檢測基因的合成和引物設(shè)計,采用GADPH作為內(nèi)參,miR-34a引物5’CAAGGACCAACTACAACC 3’:下游5’TGCCTCTT CTTTAATTG3’,經(jīng)歷45個循環(huán)后進(jìn)行曲線溶解,每個孔設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值，Bio-Rad iQ5實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國伯樂公司。以GAPDH為內(nèi)參，2－△△Ct法計算miR-34a的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 本研究中所有數(shù)據(jù)的分析均采用SPSS21.0版本,年齡、miR-34a表達(dá)水平采用s表示，組間比較采用單因素方差分析法，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同宮頸組織標(biāo)本中的miR-34a表達(dá)水平分析 宮頸癌組織、CIN組織中的miR-34a表達(dá)水平顯著低于對照組（P<0.05），宮頸癌組織中的miR-34a表達(dá)水平顯著低于CIN組織（P<0.05）。見表1。

表1 不同宮頸組織標(biāo)本中的miR-34a表達(dá)水平分析（，相對表達(dá)程度）

表1 不同宮頸組織標(biāo)本中的miR-34a表達(dá)水平分析（，相對表達(dá)程度）

組別 n宮頸癌組CIN組對照組P值80 80 40 miR-34a F值0.143±0.084 0.408±0.113 1.285±0.337 28.776 0.000

2.2 宮頸癌組織標(biāo)本中的miR-34a表達(dá)水平與病理學(xué)特征的關(guān)系 不同F(xiàn)IGO分期、不同分化程度及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中的miR-34a表達(dá)水平組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；不同病理學(xué)類型、不同腫瘤病灶大小、不同肌層浸潤程度的宮頸癌組織中的miR-34a表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；見表2。

表2 宮頸癌組織標(biāo)本中的miR-34a表達(dá)水平與病理學(xué)特征的關(guān)系（，相對表達(dá)程度）

表2 宮頸癌組織標(biāo)本中的miR-34a表達(dá)水平與病理學(xué)特征的關(guān)系（，相對表達(dá)程度）

因素 n miR-34a t值P值病理學(xué)類型鱗癌腺癌FIGO分期Ⅰ+Ⅱ期Ⅲ+Ⅳ期分化程度高+中低分化淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.412 0.681 73 7 0.145±0.080 0.132±0.076 3.320 0.001 49 31 0.173±0.084 0.109±0.084 2.431 0.017 51 29 0.159±0.079 0.117±0.065-5.013 0.000是否45 35 0.102±0.077 0.191±0.081腫瘤直徑（cm）≥3cm＜3cm肌層浸潤＞1/2≤1/2-0.464 0.644 38 42 0.138±0.078 0.146±0.076-0.885 0.379 31 49 0.133±0.080 0.149±0.078

2.3 不同CIN病變程度的CIN標(biāo)本中的miR-34a表達(dá)水平與病理學(xué)特征的關(guān)系CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級宮頸組織中的miR-34a表達(dá)水平組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；見表3。

表3 不同CIN病變程度的CIN標(biāo)本中的miR-34a表達(dá)水平與病理學(xué)特征的關(guān)系（，相對表達(dá)程度）

表3 不同CIN病變程度的CIN標(biāo)本中的miR-34a表達(dá)水平與病理學(xué)特征的關(guān)系（，相對表達(dá)程度）

CIN分組 n CINⅠ級CINⅡ級CINⅢ級P值25 37 18 miR-34a F值0.479±0.109 0.448±0.094 0.221±0.076 21.770 0.000

3 討論

在多次人工流產(chǎn)、多次妊娠病史或者長期宮頸HPV病毒感染的群體中，宮頸柱狀上皮細(xì)胞損傷-修復(fù)過程的反復(fù)發(fā)生，增加了早期癌細(xì)胞的形成風(fēng)險[6]。長期的損傷修復(fù)過程導(dǎo)致的癌細(xì)胞的蓄積，能夠加劇腫瘤組織學(xué)水平形成的風(fēng)險，促進(jìn)了惡性腫瘤的早期發(fā)生。臨床回顧性分析發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者的5年或者3年生存率均明顯的縮短，宮頸癌患者中晚期的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險較高[7,8]。對于宮頸癌患者臨床病理特征的評估，能夠為臨床上宮頸癌的治療或者隨訪提供一定的參考。雖然宮頸鱗狀上皮癌相關(guān)抗原，能夠在宮頸癌的診療過程中發(fā)揮作用，但依靠鱗狀上皮細(xì)胞癌相關(guān)抗原評估宮頸癌臨床病理特征的局限性仍然較為明顯，其對于宮頸癌臨床病理特征評估的符合率較低。本次研究的創(chuàng)新性在于探討了宮頸癌患者中miR-34a的表達(dá)，并分析了其與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系。其現(xiàn)實(shí)意義在于，能夠為臨床上宮頸癌的診療提供新的參考標(biāo)志物。

miR-34a是非編碼RNA家族成員，其對于癌基因信號通路的調(diào)控，能夠影響到下游腫瘤蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯活性?；A(chǔ)領(lǐng)域的研究認(rèn)為，miR-34a對于核轉(zhuǎn)錄DNA雙側(cè)磷酸結(jié)構(gòu)的修飾作用，能夠?qū)е掳┗駾NA擴(kuò)增風(fēng)險的改變，抑制了癌基因的復(fù)制過程[9,10]。miR-34a通過對于腫瘤細(xì)胞膜上糖蛋白配體的結(jié)合,能夠影響到癌細(xì)胞的浸潤和粘附過程,調(diào)控腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換過程[11,12]。有研究者探討了miR-34a在宮頸癌患者中的表達(dá)情況，認(rèn)為在宮頸癌患者中miR-34a基因擴(kuò)增水平明顯下降[13]，但對于miR-34a在不同宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）中的分析不足。

對于不同宮頸病變患者病灶組織中miR-34a的表達(dá)分析可見，在宮頸CIN或者宮頸癌患者病灶組織中，miR-34a基因的表達(dá)水平明顯的下降，其中宮頸癌病灶組織中miR-34a基因表達(dá)水平下降最為明顯，提示了miR-34a的表達(dá)缺失能夠影響到宮頸上皮病變過程。miR-34a的表達(dá)下降，對于宮頸癌的發(fā)生發(fā)展的影響，在于其能夠影響到腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因錯配切除修復(fù)能力，導(dǎo)致癌基因蓄積效應(yīng)的增強(qiáng)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的浸潤過程。有其他研究者也認(rèn)為，在宮頸癌病灶組織中，miR-34a基因的表達(dá)陽性率水平可隨著臨床分期的進(jìn)展而顯著下降，在局部晚期宮頸癌或者宮旁組織浸潤較為明顯的患者中，miR-34a基因的表達(dá)水平的下降更為顯著[14]。在不同的臨床病理特征的患者中，可以發(fā)現(xiàn)隨著臨床分期的進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，miR-34a的表達(dá)水平明顯的下降，同時在癌細(xì)胞分化程度較差的患者中，miR-34a的表達(dá)強(qiáng)度可進(jìn)一步下降，表明miR-34a的表達(dá)與宮頸癌患者的臨床病理特征密切相關(guān)。miR-34a對于臨床分期或者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響，主要由于miR-34a的表達(dá)強(qiáng)度的下降，影響到了腫瘤細(xì)胞的浸潤深度,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞粘附盆腔內(nèi)淋巴結(jié)組織能力的增強(qiáng);miR-34a對于癌細(xì)胞分化程度的影響,主要由于miR-34a能夠影響到腫瘤細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)成熟因子a的活性，最終促進(jìn)癌細(xì)胞的低分化過程[15,16]。在不同的CIN病灶組織中,可以發(fā)現(xiàn)隨著CIN病變級別的上升，miR-34a基因的表達(dá)濃度水平逐漸的下降,表明miR-34a的表達(dá)差別能夠顯著影響宮頸上皮內(nèi)瘤變過程。臨床上可以通過檢測miR-34a水平,進(jìn)而評估宮頸癌的臨床病理特征或者宮頸上皮內(nèi)瘤變病情。

在宮頸癌病灶組織中，miR-34a的表達(dá)強(qiáng)度明顯下降，同時miR-34a的表達(dá)還能夠影響到宮頸癌的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等過程，通過檢測miR-34a能夠評估宮頸上皮內(nèi)瘤變病情狀態(tài)。