游離長(zhǎng)鏈非編碼RNA TUG1在結(jié)直腸癌的表達(dá)及其對(duì)化療敏感性的影響

崔瑛，王曉輝，劉艷霞

（許昌市人民醫(yī)院1.質(zhì)控辦；2.血液腫瘤科；3.護(hù)理部，河南 許昌 461000）

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤,其發(fā)病與遺傳因素、飲食運(yùn)動(dòng)等生活方式和老齡化密切相關(guān)，近年來隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、環(huán)境污染加劇和人口老齡化，其發(fā)病率亦呈上升趨勢(shì)[1]。結(jié)直腸癌治療以手術(shù)切除為主,對(duì)于手術(shù)無法根治的患者采用術(shù)后輔助化療作為一線治療方案，然而很多患者在化療幾個(gè)周期后會(huì)出現(xiàn)耐藥情況，嚴(yán)重影響到治療和預(yù)后[2,3]。牛磺酸上調(diào)基因1(Taurine up-regulated gene 1，TUG1)是長(zhǎng)鏈非編碼RNA的一種，既往研究發(fā)現(xiàn)TUG1與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，它能通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展[4-6]。本研究通過測(cè)定結(jié)直腸癌患者血清游離TUG1表達(dá)與體外癌細(xì)胞下調(diào)TUG1對(duì)化療敏感性的變化，來探討TUG1的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者病情和化療耐藥的關(guān)系，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2018年5月-2019年4月本院收治的結(jié)直腸癌患者137例作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均接受了手術(shù)切除治療，均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為結(jié)直腸癌。其中男性為73例，女性64例，年齡為32～87歲，平均為63.21±4.27歲。另收集100例同期在本院體檢健康者血清作為對(duì)照，其中男性52例，女性48例，年齡為33～85歲，平均為62.89±5.13歲。結(jié)直腸癌組患者與健康體檢者年齡和性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），一般資料具有可比性。本研究已通過倫理委員會(huì)審查。

1.2 試劑與儀器 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW620購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)液選用Leibovitz’s L-15培液（添加10%胎牛血清），購(gòu)自上海玉博生物科技有限公司。R1200總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。PCR引物合成在生工生物完成，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒與RTqPCR試劑盒均購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。TUG1抑制劑Smart Silencer-TUG1（ss-TUG1）及陰性對(duì)照ss-NC購(gòu)自廣州銳博生物科技公司；CCK8試劑盒購(gòu)自南京固與生物；順鉑（Cisplatin，DDP）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

恒溫恒濕箱采用無錫瑪瑞特科技有限公司LRH-150HC，酶標(biāo)儀選用賽默飛世爾科技FC型酶標(biāo)儀，RT-qPCR儀采用美國(guó)Applied Biosystems公司的ABI7500。

1.3 研究方法

1.3.1 結(jié)直腸癌患者和體檢健康人群血清TUG1相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定 結(jié)直腸癌患者入院接受手術(shù)治療前采血后立即分離血清，采用RNA提取試劑盒提取血清中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行RT-qPCR，讀取Ct值，采用2–ΔΔCT計(jì)算TUG1相對(duì)表達(dá)量，采集到的健康體檢者靜脈血亦采用同樣的方法測(cè)定血清TUG1相對(duì)表達(dá)量。TUG1基因的上游引物為5'-GGCUUCUAUUCUGAAUCCU-3'，下游引物為5'-AGGAUUCAGAAUAGAAGC-3'；內(nèi)參基因選用β-actin。

1.3.2 細(xì)胞系DDP敏感性與TUG1表達(dá)關(guān)系的測(cè)試 將SW620細(xì)胞系于溫度37℃，含有5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（5×104/ml）100μl/孔接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)24h后，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書分別采用TUG1抑制劑（Smart Silencer-TUG1，ss-TUG1）和陰性對(duì)照（Smart Silencer-negative control，ss-NC）轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞系,構(gòu)建TUG1低表達(dá)SW6 20-TUG1組和正常表達(dá)SW620-NC組。兩組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)5～6h，置換新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，采用RT-qPCR檢測(cè)兩組細(xì)胞TUG1的表達(dá)量，每組各檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔并重復(fù)檢測(cè)3次。

同時(shí)將轉(zhuǎn)染后的兩組細(xì)胞懸液按照1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，每孔100μl，各4板，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。次日分別給予0mg/L（空白）、10mg/L、25mg/L、50mg/L、75mg/L和100mg/L的順鉑（DDP）處理，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，在DDP處理的0h、24、48與72 h，各取出1板加入CKK8溶液于37℃孵育2h，酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm處吸光度值（OD值），上述測(cè)量值均重復(fù)測(cè)量3次。

1.4 觀察指標(biāo)TUG1表達(dá)與結(jié)直腸癌病情的關(guān)系：對(duì)比結(jié)直腸癌患者和體檢健康人群血清TUG1含量的差異，并分析結(jié)直腸癌患者TUG1表達(dá)量與患者的臨床病理特征的關(guān)系。

TUG1表達(dá)與結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)DDP敏感度的關(guān)系：對(duì)比轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后SW620-NC與SW620-TUG1兩組細(xì)胞TUG1相對(duì)表達(dá)量，采用Graph-PadPrism5.0計(jì)算72h時(shí)半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentration of 50%，IC50），比較10mg/L的DDP用藥后不同時(shí)間點(diǎn)OD值的變化，計(jì)算10mg/L DDP的生長(zhǎng)抑制率=（加藥-空白）/空白×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件，結(jié)直腸癌患者血清TUG1與臨床病理特征關(guān)系的分析采用單因素分析中的卡方檢驗(yàn)（χ2），血清及細(xì)胞系TUG1表達(dá)量（）采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，組間不同時(shí)間點(diǎn)比較先采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，再采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者和體檢健康人群血清TUG1相對(duì)表達(dá)量的比較 結(jié)直腸癌患者血清TUG1相對(duì)表達(dá)量為6.11±0.23，體檢健康人群血清TUG1相對(duì)表達(dá)量為2.76±0.24，結(jié)直腸癌患者血清TUG1相對(duì)表達(dá)量高于體檢健康人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=114.151，P＜0.05）。

2.2 結(jié)直腸癌患者血清TUG1與臨床病理特征的關(guān)系 以結(jié)直腸癌患者血清TUG1相對(duì)表達(dá)量的平均值6.11為界，將結(jié)直腸癌患者分為高表達(dá)組（TUG1相對(duì)表達(dá)量＞6.11）和低表達(dá)組（TUG1相對(duì)表達(dá)量＜6.11）。結(jié)果顯示，血清TUG1表達(dá)高低與性別、年齡和腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），與癌組織分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），見表1。

表1 結(jié)直腸癌患者血清TUG1與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 SW620-NC與SW620-TUG1細(xì)胞TUG1相對(duì)表達(dá)量的比較ss-TUG1和ss-NC轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞系構(gòu)建SW620-TUG1細(xì)胞與SW620-NC細(xì)胞后，采用RT-qPCR檢測(cè)TUG1相對(duì)表達(dá)量，顯示SW620-TUG1細(xì)胞中TUG1相對(duì)表達(dá)量為1.19±0.28；明顯低于SW620-NC細(xì)胞3.07±0.35，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.265，P=0.001），表示通過轉(zhuǎn)染成功下調(diào)了TUG1表達(dá)。

2.4 SW620-NC與SW620-TUG1細(xì) 胞IC50的 比較DDP處理72h后軟件計(jì)算得到兩組細(xì)胞的IC50，SW620-TUG1組的IC50為23.18±2.19mg/L，SW620-NC組為75.29±3.72mg/L,SW620-TUG1組的IC50低于SW620-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.908，P＜0.001）。

2.5 SW620-NC與SW620-TUG1細(xì)胞用藥后不同時(shí)間點(diǎn)OD值的變化DDP用藥后0h、24h、48h和72h，SW620-TUG1組OD值均明顯低于SW620-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著時(shí)間的推移，兩組細(xì)胞間OD值的差異越來越大，見表2和圖1。

表2 SW620-NC與SW620-TUG1細(xì)胞10mg/L的DDP用藥后不同時(shí)間點(diǎn)OD值

圖1 10mg/L DDP用藥后不同時(shí)間點(diǎn)OD值的比較

2.6 SW620-NC與SW620-TUG1細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)生長(zhǎng)抑制率的比較48h和72h測(cè)得SW620-TUG1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率明顯高于SW620-NC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著時(shí)間的推移，兩組間差異越來越大，見表3、圖2。

圖2 DDP用藥后不同時(shí)間點(diǎn)生長(zhǎng)抑制率的比較

表3 SW620-NC與SW620-TUG1細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)生長(zhǎng)抑制率的比較

3 討論

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，據(jù)WHO最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率在惡性腫瘤中高居第四，致死率高居第三，嚴(yán)重危害人類生命健康[7]。結(jié)直腸癌具有很強(qiáng)異質(zhì)性，個(gè)體基因的改變可能與其病理組織學(xué)特征及對(duì)化療藥物的敏感度都密切相關(guān)，因此對(duì)結(jié)直腸癌患者化療前檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)其選擇治療方案和預(yù)后的改善都能起到一定幫助[8]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA雖然不編碼蛋白質(zhì)，但其在各種生物活動(dòng)和疾病進(jìn)展中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，包括癌細(xì)胞的耐藥性[9]。TUG1作為長(zhǎng)鏈非編碼RNA的一種,近年來也逐步受到臨床和科研的廣泛關(guān)注。既往研究表明,TUG1呈高表達(dá)的食管鱗癌患者對(duì)化療敏感性較差，胃癌組織中TUG1通過沉默P57表達(dá)從而促進(jìn)胃癌發(fā)生與進(jìn)展，TUG1還能通過介導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[10-12],故推測(cè)結(jié)直腸癌患者癌癥的發(fā)展和對(duì)化療敏感性也可能與TUG1的表達(dá)有關(guān)。血清游離TUG1與組織TUG1表達(dá)呈正相關(guān)[13]，且樣本容易獲取，還能實(shí)現(xiàn)表達(dá)狀態(tài)的監(jiān)測(cè)，因此本研究采用血清TUG1水平反映患者癌組織TUG1的表達(dá)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者血清TUG1表達(dá)量明顯高于健康體檢者,且其表達(dá)的高低與癌組織分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均有關(guān)。低分化癌組織中TUG1表達(dá)量高于高分化癌組織，癌細(xì)胞浸潤(rùn)程度高的TUG1表達(dá)量高于浸潤(rùn)程度較低的，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者TUG1表達(dá)高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的TUG1表達(dá)高于近端轉(zhuǎn)移。總之癌癥病情越嚴(yán)重，組織病理學(xué)分級(jí)越高，TUG1表達(dá)量越高，這與姚凱、Jiang L等人[6,10]通過對(duì)結(jié)直腸癌患者組織中TUG1表達(dá)和患者臨床病理特征之間關(guān)系進(jìn)行分析得出的研究結(jié)果相符。Qin CF等人[13]對(duì)結(jié)直腸癌患者血清與組織中的TUG1含量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，確實(shí)呈現(xiàn)明顯正相關(guān)關(guān)系，且血清與組織中的TUG1含量均與患者術(shù)前TNM分期顯著相關(guān),提示術(shù)前血清TUG1亦可一定程度上反映結(jié)直腸癌的病情的嚴(yán)重程度，這將為后續(xù)結(jié)直腸癌術(shù)前診斷帶來便利。TUG1在癌癥的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著作用，調(diào)控機(jī)制可能與TUG1的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用有關(guān),它可以促進(jìn)一系列微小RNA調(diào)控的靶蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑的活性和下游基因轉(zhuǎn)錄的核定位,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的的增殖，通過激活內(nèi)皮-間充質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)，增加癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，從而促進(jìn)癌癥進(jìn)展[14,15]。

DDP是一種鉑類抗癌藥物,屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，能夠通過干擾DNA復(fù)制殺死無限增殖的腫瘤細(xì)胞,是包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種癌癥一線化療藥物。通過體外細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行DDP敏感性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SW620-TUG1細(xì)胞系中TUG1的表達(dá)受到抑制，DDP用藥前OD值已明顯低于SW620-NC細(xì)胞，說明TUG1的表達(dá)與癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖活性呈 正 相 關(guān)。DDP用 藥 后24h、48h、72h，SW620-TUG1細(xì)胞與SW620-NC細(xì)胞OD值差異隨著時(shí)間增加而增大；相比TUG1高表達(dá)的SW620-NC細(xì)胞，TUG1低表達(dá)的SW620-TUG1細(xì)胞經(jīng)DDP處理72h的IC50明顯降低，且生長(zhǎng)抑制率明顯升高,下調(diào)TUG1的表達(dá)能增強(qiáng)DDP對(duì)癌細(xì)胞的抑制率，揭示了TUG1高表達(dá)介導(dǎo)了結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)DDP抗性,這可能同樣與TUG1介導(dǎo)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān),與DDP藥物作用形成了競(jìng)爭(zhēng)性拮抗關(guān)系，同時(shí)TUG1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使得腫瘤細(xì)胞獲得了腫瘤干細(xì)胞特性,從而減弱了DDP對(duì)細(xì)胞周期干擾效果[10]。Fukuda Y等人研究[16]指出腫瘤細(xì)胞的耐藥性與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族介導(dǎo)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)改變有關(guān)，而近期Li C等學(xué)者研究[17,18]表明TUG1是通過mir-186/cpeb2軸介導(dǎo)結(jié)直腸癌的甲氨蝶呤化療抵抗，亦有Niu Y等學(xué)者研究[12]指出，TUG1能在非小細(xì)胞肺癌中通過招募相關(guān)因子，促進(jìn)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，誘導(dǎo)LIMK2b基因啟動(dòng)子甲基化從而抑制其轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其化療抵抗，但其在結(jié)直腸癌中的具體調(diào)控信號(hào)通路是否也與肺癌中一致,仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。此外，結(jié)果中還可以發(fā)現(xiàn)DDP作用48h和72h后SW620-TUG1細(xì)胞與SW620-NC細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率差異顯著，SW620-NC細(xì)胞隨著時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)DDP的敏感性降低，進(jìn)一步說明了高表達(dá)的TUG1與癌細(xì)胞對(duì)DDP耐藥相關(guān)。

綜上，TUG1在結(jié)直腸癌患者血清中表達(dá)上調(diào)，與患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示下調(diào)TUG1能增加癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性，從而增強(qiáng)DDP的細(xì)胞毒性。本研究可為結(jié)直腸癌化療藥物DDP敏感性測(cè)試提供新的靶點(diǎn),也為日后化療的個(gè)體化用藥提供一定參考意義,未來可能通過監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌患者血清TUG1表達(dá)量選擇或及時(shí)調(diào)整其術(shù)后化療方案。