白術(shù)對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶和抗氧化能力的影響

翟春梅,薛迎鳳,郭鵬飛,白晨曦,石雅維,孟永海,高利權(quán)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

本文采用穿梭實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)，考察白術(shù)對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的影響，再結(jié)合體質(zhì)量、臟器指數(shù)及血清SOD、GSH-Px，CAT和T-AOC活力等指標(biāo)，系統(tǒng)闡述白術(shù)對(duì)衰老產(chǎn)生的學(xué)習(xí)記憶能力影響特征，從而進(jìn)一步揭示白術(shù)的抗衰老作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

CT15RE型高速粉碎離心機(jī)(日本日立); OSB-2200型水浴鍋(上海愛朗儀器有限公司); AL 204電子天平(美國(guó)METTLER TOLEDO公司); KQ-5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); EVOLUTION260型紫外分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛公司); ZH-CSC型穿梭實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)Shuttle box system(徐州利華電子科技發(fā)展有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

超氧化物歧化酶試劑盒(批號(hào)：20190519)，谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒(批號(hào)：20190621)，總抗氧化能力試劑盒(批號(hào)：20190519)，過氧化氫酶試劑盒(批號(hào)：20190723)，以上均試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司；抗壞血酸(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)：20191125); D-半乳糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180125)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取KM小鼠36只(雄性)，隨機(jī)分至空白組、模型組、白術(shù)水提取液高、中、低劑量組和陽(yáng)性藥組。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，晝夜12 h交替照明。

2 實(shí)驗(yàn)方法及觀察指標(biāo)

2.1 灌胃藥液制備

稱取2.4 kg白術(shù)生品粉碎成小塊，加10倍量水浸泡2 h，煎煮3 h，將濾液濃縮后旋蒸干溶劑，得到白術(shù)干膏，出膏率為35%，將浸膏溶于一定量蒸餾水，得到灌胃藥液。

2.2 D-半乳糖致衰老模型的建立

D-半乳糖模型組、白術(shù)高、中、低劑量組和抗壞血酸陽(yáng)性藥組小鼠每日腹腔注射250 mg·kg-1的D-半乳糖溶液，空白組小鼠每日腹腔注射等量的生理鹽水。造模同時(shí)陽(yáng)性藥組每日給予抗壞血酸100 mg·kg-1，高劑量組每日給予干膏2.80 g·kg-1，中劑量組每日給予藥液1.68 g·kg-1，低劑量組每日給予藥液0.56 g·kg-1。造模并給藥共計(jì)5周[13-17]。

2.3 一般狀態(tài)觀察

觀察各組小鼠日常狀態(tài)，包括飲水、攝食、糞便、活動(dòng)度、毛皮光澤度變化等方面，進(jìn)行組間比較。從第0周開始每周記錄小鼠體質(zhì)量。

2.4 臟器指數(shù)測(cè)定

各組小鼠禁食12 h后，稱取各組小鼠的空腹質(zhì)量，將經(jīng)過采血處理后的小鼠脫頸處死，在冰上進(jìn)行解剖，依次取出小鼠脾臟、肝臟組織，在冷的生理鹽水中漂洗除去血液后，剝離脂肪組織和結(jié)締組織，濾紙吸干表面水分，稱重記錄，計(jì)算臟器指數(shù)。

三相并網(wǎng)逆變器的MPDPC策略如圖3所示,不同的電壓矢量產(chǎn)生不同的有功和無功功率變化,因此,存在多種方式去選擇合適的開關(guān)狀態(tài)去控制有功和無功功率。采樣三相電網(wǎng)電壓和電流,分別在8個(gè)矢量的作用下計(jì)算出下一周期的功率預(yù)測(cè)值,將預(yù)測(cè)值代入式(9),根據(jù)誤差最小化原則,選取最優(yōu)矢量。p*由直流電壓外環(huán)PI調(diào)節(jié)器的輸出與直流電壓的乘積給定,q*通常設(shè)為0,以實(shí)現(xiàn)單位功率因數(shù)運(yùn)行。

2.5 行為學(xué)評(píng)價(jià)

在給藥及造模的最后1周，進(jìn)行穿梭箱實(shí)驗(yàn)。將小鼠置于穿梭箱中，小鼠適應(yīng)5 min消除探索反射，給予嗡鳴刺激5 s后,隨即給予電刺激10 s，每次訓(xùn)練間隔10 s，共訓(xùn)練30次，共3 d，通過小鼠主動(dòng)躲避次數(shù)和被動(dòng)躲避次數(shù)與無反應(yīng)次數(shù)考察D-半乳糖致衰小鼠灌服白術(shù)提取液后習(xí)得能力。

2.6 血清抗氧化能力測(cè)定

D-半乳糖腹腔注射造模5周后，在最末次給藥后12 h，摘取小鼠眼球取血，取出的小鼠血液于冰上靜置1 h，離心10 min(3 500 r·min-1)，吸取上層血清，于-80 ℃冰箱中保存。按照超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，總抗氧化能力(T-AOC)和過氧化氫酶(CAT)試劑盒說明進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)觀察結(jié)果

對(duì)小鼠進(jìn)行日常觀察，總結(jié)小鼠日常狀態(tài)觀察表如表1所示。模型組小鼠在攝食、飲水方面出現(xiàn)了減少，毛皮晦暗不順滑、無光澤，并出現(xiàn)掉毛現(xiàn)象，精神狀態(tài)差，活動(dòng)不活躍，出現(xiàn)了便溏的現(xiàn)象，提示經(jīng)過D-半乳糖腹腔注射的小鼠出現(xiàn)了一系列衰老現(xiàn)象。與空白組小鼠對(duì)比，陽(yáng)性藥組小鼠整體活躍、活動(dòng)靈敏、飲水多、毛皮光亮順滑。給藥組小鼠在造模前期出現(xiàn)了便溏，提示可能D-半乳糖導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生全身性的衰老，腸道滲水利濕能力不足，藥效短期內(nèi)不顯著。隨著給藥日期的延長(zhǎng)，給藥組小鼠逐漸恢復(fù)正常排便。

表1 小鼠一般狀態(tài)觀察表(n=6)

小鼠0至5周體質(zhì)量測(cè)量見表2。結(jié)果顯示，當(dāng)連續(xù)通過腹腔注射給予KM小鼠D-半乳糖(250 mg·kg-1)溶液5周，模型組小鼠體質(zhì)量較高劑量組、中劑量組、陽(yáng)性藥組小鼠產(chǎn)生極顯著性(P<0.01)降低；低劑量組小鼠第5周平均體質(zhì)量較模型組小鼠發(fā)生顯著性(P<0.05)回調(diào)。當(dāng)給予給藥組小鼠白術(shù)水提取物后，在體質(zhì)量方面，第5周各組小鼠平均體質(zhì)量從大到小依次為：陽(yáng)性藥組>高劑量組>空白組>中劑量組>低劑量組>模型組，結(jié)果表明，連續(xù)給予小鼠5周白術(shù)水提取液，可改善由于D-半乳糖致亞急性衰老伴隨的體質(zhì)量減輕現(xiàn)象。

表2 小鼠5周內(nèi)體質(zhì)量變化表

小鼠內(nèi)臟指數(shù)見表3。通過各組小鼠內(nèi)臟指數(shù)表可以得出：模型組小鼠脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)升高，通過解剖發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠存在內(nèi)臟粗糙、質(zhì)地略硬、臟器淤血等情況，提示腹腔注射D-半乳糖可導(dǎo)致小鼠臟器的衰老。陽(yáng)性藥組脾臟指數(shù)最高，其次為高劑量給藥組，較模型組具有顯著性差異(P<0.05)，提示給予小鼠白術(shù)水提取液可抵抗D-半乳糖導(dǎo)致的亞急性衰老與亞急性炎癥，提高機(jī)體抵抗力。

表3 小鼠內(nèi)臟指數(shù)

3.2 白術(shù)對(duì)小鼠穿梭實(shí)驗(yàn)行為學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果

各組小鼠主動(dòng)逃避次數(shù)、被動(dòng)逃避次數(shù)、無反應(yīng)次數(shù)的行為學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果圖1～3，數(shù)學(xué)模型檢驗(yàn)結(jié)果見表4。表明經(jīng)過3 d的訓(xùn)練，模型小鼠主動(dòng)躲避次數(shù)增加幅度較小，提示給予小鼠D-半乳糖5周后，出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)能力下降現(xiàn)象。穿梭實(shí)驗(yàn)行為學(xué)研究結(jié)果表明：給予小鼠白術(shù)水提取液后可改善D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)能力下降與反應(yīng)能力下降的現(xiàn)象。

表4 白術(shù)對(duì)衰老小鼠穿梭實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶能力的影響次)

圖1 白術(shù)對(duì)衰老小鼠穿梭實(shí)驗(yàn)主動(dòng)躲避次數(shù)對(duì)比圖

圖2 白術(shù)對(duì)衰老小鼠穿梭實(shí)驗(yàn)被動(dòng)逃避次數(shù)對(duì)比圖

3.3 對(duì)衰老小鼠血清SOD活力測(cè)定結(jié)果

小鼠血清SOD活力影響數(shù)據(jù)及分析，見表5。結(jié)果表明：SOD活力測(cè)定結(jié)果，高劑量組略大于空白組且大于陽(yáng)性藥組(P<0.01)，與模型組小鼠血清SOD活力相比具有極顯著性差異；中劑量與低劑量組均大于模型組小鼠血清SOD活力(P<0.05)，具有顯著性差異，白術(shù)給藥提高小鼠SOD活性并呈現(xiàn)劑量依賴性影響，結(jié)果顯示白術(shù)可有效提高衰老小鼠血清SOD活力，提升小鼠血清超氧化物歧化酶活性。

表5 小鼠血清SOD活力測(cè)定

3.4 小鼠血清測(cè)定結(jié)果

小鼠血清GSH-Px活力影響數(shù)據(jù)及分析，見表6。GSH-Px活力測(cè)定結(jié)果顯示，空白組與陽(yáng)性藥組小鼠血清GSH-Px活力相差不大，高劑量組略大于空白組與陽(yáng)性藥組小鼠血清GSH-Px活力，且大于陽(yáng)性藥組。高劑量組、中劑量組、陽(yáng)性藥組、空白組與模型組小鼠血清GSH-Px活力相比具有極顯著性差異(P<0.01)；低劑量組小鼠血清GSH-Px活力大于造模組(P<0.05)，具有顯著性差異，提示白術(shù)水提取液可有效提高小鼠血清GSH-Px活力，提升谷胱甘肽過氧化物酶活性。

表6 小鼠血清GSH-Px活力測(cè)定

3.5 小鼠血清CAT活力測(cè)定結(jié)果

小鼠血清CAT活力影響數(shù)據(jù)及分析，見表7。CAT活力測(cè)定結(jié)果顯示，高劑量組CAT活力大于空白組且大于陽(yáng)性藥組小鼠血清CAT活力，高劑量組、中劑量組、陽(yáng)性藥組、空白組小鼠與模型組小鼠血清CAT活力相比具有極顯著性差異(P<0.01)；低劑量組與模型組相比，CAT活力大于模型組，具有顯著性差異(P<0.05)，提示白術(shù)水提取液可有效提高小鼠血清CAT活力，提升過氧化氫酶活性。

表7 小鼠血清CAT活力測(cè)定

3.6 小鼠血清T-AOC活力測(cè)定結(jié)果

小鼠T-AOC活力影響數(shù)據(jù)及分析，見表8。各組T-AOC活力測(cè)定結(jié)果顯示，高劑量組T-AOC活力大于陽(yáng)性藥組且大于空白組T-AOC活力，中劑量與低劑量組T-AOC活力均大于造模組。高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽(yáng)性藥組小鼠血清T-AOC活力與模型組相比，具有極顯著性差異(P<0.01)；空白組血清T-AOC活力大于模型組小鼠血清T-AOC活力，具有顯著性差異(P<0.05)，提示白術(shù)水提取液可有效提高小鼠血清T-AOC活力，提升總抗氧化能力。

表8 小鼠血清T-AOC活力測(cè)定

4 討論與小結(jié)

機(jī)體衰老過程涉及許多內(nèi)外因素，活性氧自由基(ROS)是在衰老過程中最常見的內(nèi)源性生化因子。生物體在生長(zhǎng)過程中，ROS在機(jī)體內(nèi)不斷積累，過量ROS搶奪細(xì)胞蛋白分子的電子，使蛋白質(zhì)接上支鏈發(fā)生烷基化，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷。而機(jī)體相關(guān)抗氧化酶類如SOD、GSH-Px和CAT等活性的下降使機(jī)體清除自由基的能力下降。機(jī)體內(nèi)脂褐素含量為衰老的客觀依據(jù)之一，其形成與脂質(zhì)自由基有關(guān)，衰老生物體內(nèi)血清脂質(zhì)自由基水平顯著增高，組織內(nèi)脂褐素含量增多?；钚匝跄芘c生物膜中不飽和脂肪酸形成過氧化脂質(zhì)，引起神經(jīng)元細(xì)胞損傷，導(dǎo)致機(jī)體功能下降，產(chǎn)生如阿爾茨海默病、帕金森病等相關(guān)衰老性疾病[18]。

D-半乳糖造成的動(dòng)物衰老模型接近于自然衰老特征，是當(dāng)前世界公認(rèn)的應(yīng)用衰老和腦老化動(dòng)物模型。D-半乳糖在體內(nèi)代謝能產(chǎn)生大量的ROS，是其導(dǎo)致衰老的一個(gè)重要機(jī)制，D-半乳糖可使其代謝產(chǎn)生的過量氧自由基導(dǎo)致過氧化產(chǎn)物MDA升高，氧自由基的過量積累也會(huì)使致腦組織中清除自由基酶類活性下降，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙[17]。

本實(shí)驗(yàn)中小鼠亞急性衰老模型由腹腔注射D-半乳糖溶液的方法建立，同時(shí)進(jìn)行給藥與造模共5周，給予陽(yáng)性藥組小鼠抗壞血酸溶液。伴隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組小鼠出現(xiàn)了便溏、食欲減退、行動(dòng)不活躍、毛皮無光澤且掉毛的衰老現(xiàn)象，當(dāng)給予白術(shù)水提取液時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，陽(yáng)性藥組小鼠與給藥組小鼠的便溏得到了充分緩解，食欲增強(qiáng)，體質(zhì)量增加，逐漸改善掉毛現(xiàn)象，毛皮逐漸變得順滑光澤。在行為學(xué)考察中，如圖1～圖3所示，經(jīng)過3 d的訓(xùn)練，模型小鼠主動(dòng)躲避次數(shù)增加幅度較小，提示給予小鼠D-半乳糖5周后，出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)能力下降現(xiàn)象，出現(xiàn)衰老認(rèn)知功能障礙。給與高、中劑量白術(shù)藥物組及陽(yáng)性藥物組的無反應(yīng)次數(shù)較少(P<0.01)，而主動(dòng)逃避次數(shù)較多(P<0.05)，結(jié)果表明白術(shù)可改善D-半乳糖致衰老導(dǎo)致的記憶減退與學(xué)習(xí)能力、反應(yīng)能力下降，體現(xiàn)抗衰老作用。

圖3 白術(shù)對(duì)衰老小鼠穿梭實(shí)驗(yàn)無反應(yīng)次數(shù)對(duì)比圖

在模型動(dòng)物抗氧化研究中，高劑量白術(shù)組小鼠血清中SOD活力略大于空白組與陽(yáng)性藥組小鼠血清SOD，中劑量與低劑量小鼠血清SOD活力均大于模型組；空白組小鼠血清GSH-Px活力與陽(yáng)性藥組活力相近，高劑量組小鼠血清GSH-Px活力略大于空白組與陽(yáng)性藥組，且大于低性藥組，中劑量與低劑量組小鼠血清GSH-Px活力均大于造模組；高劑量組小鼠血清CAT活力大于空白組且大于陽(yáng)性藥組小鼠血清CAT活力，中劑量與低劑量組小鼠血清CAT活力均大于造模組；高劑量組小鼠血清T-AOC活力大于陽(yáng)性藥組且大于空白組小鼠血清T-AOC活力，中劑量與低劑量組小鼠血清T-AOC活力均大于造模組?？寡趸芯勘砻靼仔g(shù)對(duì)D-半乳糖導(dǎo)致的亞急性衰老顯示出非常好抗氧化活性，可顯著提高機(jī)體SOD、GSH-Px、CAT及T-AOC活力，對(duì)抗ROS對(duì)機(jī)體細(xì)胞的損傷，從而改善模型小鼠的記憶等認(rèn)知功能的障礙。

本研究對(duì)白術(shù)的改善學(xué)習(xí)記憶能力及抗衰老作用進(jìn)行了初步研究，結(jié)果提示白術(shù)是通過清除機(jī)體內(nèi)活性氧、抵抗氧化應(yīng)激造成的機(jī)體損傷這一機(jī)制來發(fā)揮抗衰老作用。表明白術(shù)可通過提高機(jī)體抗氧化功能而改善D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知障礙。本研究為白術(shù)作為具有改善學(xué)習(xí)記憶能力的抗衰老藥物應(yīng)用于臨床提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。