利多卡因抑制ERK信號通路激活降低甲狀腺癌細胞TPC-1的增殖能力

吳毅，劉付寧，嚴穎哲，楊浩杰，謝乾

研究及臨床實踐表明，局部麻醉和局麻藥可能提高腫瘤患者的預后［1-5］。利多卡因由于其起效快、毒性作用小而廣泛應用于體表手術［6］。多項研究發(fā)現，利多卡因可影響TRPM7（transient receptor potential melastatin-subfamily member 7）的功能，TRPM7可能是利多卡因在某些類型腫瘤中的靶點，例如，膠質瘤、乳腺癌等［7，8］。另有文獻報道，利多卡因和羅哌卡因可抑制TNF-α（TumourNecrosis Factor-alpha）激活的SRC信號通路降低肺癌轉移能力［9］。也有研究證實，利多卡因可通過EGFR（epidermal growth factor receptor）信號通路抑制結腸癌的增殖，促進其凋亡［10］。還有研究表明，利多卡因可能通過抑制NF-κB通路進而抑制細胞粘附因子表達并抑制肝癌細胞粘附于血管內皮細胞［11］。

生理情況下，細胞外信號調節(jié)激酶ERK（extracellular regulated MAP kinase）信號通路在發(fā)育和免疫中發(fā)揮重要作用［12，13］。而在腫瘤進程中，它通常處于被激活和上調狀態(tài)，可以促進腫瘤的增殖、分化、運動等［14］，所以ERK是許多藥物抑制腫瘤的重要靶點［15，16］。多項研究證實，甲狀腺癌的增殖轉移能力與ERK信號通路激活有關［17，18］。然而，利多卡因對甲狀腺腫瘤細胞的影響及其機制仍不清楚。本項研究中，我們通過體內外實驗檢測了利多卡因對甲狀腺癌細胞增殖能力的影響。此外，我們探究了利多卡因影響腫瘤增殖的潛在機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 TPC-1細胞購自中科院細胞庫（上海，中國）。

1.1.2 試劑 RPMI1640培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；胎牛血清購自GIBCO；鏈霉素和青霉素購自Sigma；細胞裂解液購自碧云天；磷酸酶蛋白酶抑制劑、Erk1/2、p-Erk1/2、GAPDH一抗，二抗購自Cell Signaling Technology；周期試劑盒購自凱基生物；CCK8購自日本同仁；利多卡因購自鄭州卓峰制藥有限公司；

1.1.3 儀器設備 Western Blot機器購自Bio-rad；酶標儀購自Thermo Fisher Scientific；0.45μm PVDF膜購自Merck。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) RPMI1640培養(yǎng)基加入10%胎牛血清，100 U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素，混勻，4℃冰箱存儲備用。TPC-1細胞在含有5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 CCK8 將對數生長期的TPC-1細胞用胰蛋白酶消化種在96空板，約5000個細胞，6 h后加入含有PBS、10μM、100μM利多卡因的培養(yǎng)基200 mL，分別在處理24 h、48 h、72 h后使用CCK8試劑檢測TPC-1增殖情況，詳細步驟見試劑盒說明書。本項研究所使用的利多卡因的濃度參考既往發(fā)表的文獻［8，10］。

1.2.3 周期實驗 將對數生長期的TPC-1細胞用胰蛋白酶消化種在6空板，約1.5×105，6 h后換成不含血清的培養(yǎng)基，24 h后細胞密度約為50%～60%，分別加入含有PBS、10μM、100μM利多卡因的培養(yǎng)基200 mL。孵育48 h，消化細胞，離心，將細胞在4℃的75%酒精中混勻，流式細胞儀檢測。

1.2.4 Western Blot 使用含蛋白酶磷酸酶抑制劑的細胞裂解液在冰上孵育細胞30 min，刮取細胞，收集在1.5 mL EP管中，4℃下12 000 g離心30 min；吸取上清液，檢測蛋白濃度，加入loading buffer和H2O，配成每管15μg蛋白樣品；分別取蛋白進行電轉膜，一抗（1∶1000）孵育12 h，TBST液中漂洗3次，10 min/次；孵育二抗，2 h，漂洗條件同上；條帶上加曝光液在曝光機曝光。

1.2.5 數據分析 使用SPSSstatistic19分析實驗數據，CCK8、細胞周期實驗、Western Blot實驗至少重復三次，數據用均數±均數的標準誤差表示。P＜0.05則認為有統計學差異。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

1.2.6 皮下成瘤實驗動物實驗 得到了中山大學動物倫理委員會批準；BALB/C裸鼠購自中山大學東校區(qū)動物實驗中心，4～6周雄鼠，隨機分為兩組（n=6），用來檢測利多卡因對TPC-1增殖的影響。6×106個細胞重懸在150μL的PBS中，皮膚消毒后使用1 mL的胰島素針注射在裸鼠的背部，種植7天后腫瘤塊的直徑約2 mm。成瘤的第5天，兩組裸鼠分別以100μL/10 g的量在腫瘤周圍注射PBS和利多卡因（濃度10 mg/mL），隔天注射1次，總計注射5次，注射的當天使用游標卡尺檢測腫瘤塊的長徑和橫徑，每3天量一次，總計10次［19］。

2 結果

2.1 利多卡因抑制TPC-1細胞的增殖

為研究利多卡因對甲狀腺癌細胞增殖的影響，本研究采用PBS和10μM、100μM利多卡因處理TPC-1細胞24 h、48 h、72 h。CCK8結果顯示，10μM、100μM利多卡因均可抑制TPC-1細胞的增殖能力，且100μM利多卡因抑制作用強于10μM的利多卡因（圖1-A）。流式細胞學結果顯示10μM、100μM利多卡因處理TPC-1細胞48 h后，S期細胞比值降低，G0/G1期細胞比值增加（圖1-B）。Western Blot結果顯示，10μM、100μM利多卡因處理TPC-1細胞48 h后P21、P27蛋白表達量升高，ERK蛋白表達量下調，100μM利多卡因處理組p-ERK蛋白表達下調較顯著（圖1-C）。

圖1 利多卡因抑制甲狀腺癌TPC-1細胞增殖 A：CCK8實驗檢測不同濃度的利多卡因對TPC-1細胞增殖的影響；B：流式細胞學實驗檢測不同濃度利多卡因對TPC-1細胞周期的影響；C：Western blot實驗檢測不同濃度利多卡因對周期相關蛋白及ERK信號通路的影響。Student t test，one-way ANOVA，*P＜0.05，**P＜0.001；每組實驗至少重復3次

2.2 利多卡因抑制TPC-1細胞移植瘤增殖

為了進一步探討利多卡因在動物體內對TPC-1細胞增殖的影響，我們使用BALB/C裸鼠建立甲狀腺癌移植瘤模型（圖2-A）。我們將利多卡因注射在腫瘤周圍，實驗結束后麻醉處死裸鼠取出腫瘤塊拍照（圖2-B），實驗期間記錄腫瘤塊的大小變化（圖2-C）。實驗結果表明，利多卡因可抑制TPC-1細胞在裸鼠體內生長。

圖2 利多卡因抑制BALB/C裸鼠移植瘤生長 A：第37天處死裸鼠取出背部腫瘤；B：PBS和利多卡因注射腫瘤周圍后瘤體體積變化曲線。n=6，Student t test，one-way ANOVA，*P＜0.05

3 討論

局部麻醉藥利多卡因浸潤復合術中鎮(zhèn)靜是甲狀腺癌手術的麻醉方式之一，因其可減少對患者呼吸循環(huán)系統的抑制、降低患者費用，縮短住院時間而受到推崇［19-21］。既往研究報道利多卡因等其他局麻藥可以抑制乳腺癌等惡性腫瘤細胞的進程［22，23］。但是，目前關于利多卡因對甲狀腺腫瘤細胞的影響鮮有報道。因此，研究利多卡因對甲狀腺腫瘤的影響及其機制可對麻醉醫(yī)師做出最佳選擇提供理論依據。

為了探究利多卡因對甲狀腺癌細胞的影響，本研究檢測利多卡因對甲狀腺癌細胞TPC-1增殖的影響，又對其可能機制進行初步探究。本研究在10μM、100μM利多卡因處理甲狀腺癌細胞TPC-1后，利用CCK8實驗檢測利多卡因對TPC-1細胞增殖能力的影響，結果顯示利多卡因在兩種濃度下均可抑制TPC-1細胞增殖，且100μM利多卡因抑制作用強于10μM。之后，利用流式細胞學檢測處理后細胞周期，結果顯示利多卡因兩種濃度處理后均有S期細胞比值降低，G0/G1期細胞比值增加。為了探究利多卡因抑制TPC-1細胞增殖的機制，我們對利多卡因處理后TPC-1細胞表達的蛋白進行Western Blot實驗，結果顯示利多卡因兩種濃度處理后均有p21、p27蛋白表達量升高，ERK及其磷酸化水平降低，表明利多卡因抑制TPC-1細胞增殖的機制可能與ERK信號通路相關。裸鼠皮下成瘤實驗檢測利多卡因對皮下移植TPC-1細胞的影響，結果顯示利多卡因可抑制腫瘤細胞在裸鼠體內生長。

綜上所述，利多卡因處理甲狀腺癌細胞可抑制其增殖能力，這可能與抑制ERK信號通路有關。