抗新型冠狀病毒候選藥物研究現(xiàn)狀

羅丹，鄧永強，秦成峰

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，北京 100071

自2002年以來，β-冠狀病毒共導(dǎo)致了三次重大傳染病疫情的暴發(fā)，包括2002－2003年的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)和2012年的中東呼吸綜合征(MERS)，以及2019年底發(fā)現(xiàn)的由新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2，SARS-CoV-2)引起的新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)[1]。與SARS的病死率(10%)相比，COVID-19的病死率低，約為3.7%，但其傳染性高[2]。截至2021年4月19日，全球累計確診新冠肺炎1.4億例以上，累計死亡302.6萬例。目前還沒有針對COVID-19的特效藥，但已有多個候選藥物在臨床前或臨床研究階段獲得了樂觀的試驗結(jié)果[3]。本文主要總結(jié)了COVID-19的潛在治療藥物，并介紹它們的作用機(jī)制、安全性及有效性。

1 SARS-CoV-2的生物學(xué)特性

SARS-CoV-2屬于單正鏈RNA包膜病毒，通常為球形，直徑60～140 nm，外觀形似日冕[4]。SARS-CoV-2基因組由29 903個核苷酸組成[5]，且與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)基因組序列有79.6%的相似度[6]。SARS-CoV-2基因組分為非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)與結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)(圖1)，共編碼29種蛋白[5]。非蛋白編碼區(qū)編碼16種非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural proteins，NSP)，其中NSP7、NSP8及NSP12形成RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)，在病毒的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄周期中發(fā)揮重要作用；而NSP3、NSP5可使其他NSP從復(fù)制-轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(replication-transcription complex，RTC)中釋放出來，NSP3即木瓜蛋白酶(papain like protease，PLpro)，NSP5即3C蛋白酶(3C-like proteinase，3CLpro)或主蛋白酶(main protease，Mpro)。因此，RdRp、PLpro及3CLpro可作為抑制病毒復(fù)制的藥物靶標(biāo)。結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)主要編碼刺突(spike，S)蛋白、包膜(envelope，E)蛋白、膜(m e m b r a n e，M)蛋白及核衣殼(nucleocapsid，N)蛋白，4種結(jié)構(gòu)蛋白形成冠狀病毒外層，保護(hù)內(nèi)部的RNA。研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2依賴絲氨酸蛋白酶TMPRSS2啟動S蛋白[7]，利用S蛋白與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)結(jié)合[1]，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞[8]。近期發(fā)現(xiàn)，在ACE2存在的情況下，嗅上皮細(xì)胞與嗅神經(jīng)細(xì)胞上高表達(dá)另一種受體——神經(jīng)纖毛蛋白(neuropilin-1，NRP1)受體[9-10]，NRP1可通過與S蛋白亞單位S1結(jié)合，增強SARS-CoV-2感染宿主細(xì)胞的能力。因此，TMPRSS2、S蛋白、ACE2及NRP1同樣是抗SARS-CoV-2藥物研究的重要靶點。此外，SARS-CoV-2還編碼9種有助于改變胞內(nèi)環(huán)境、促進(jìn)病毒復(fù)制的輔助蛋白。

圖1 SARS-CoV-2基因編碼蛋白Fig.1 Proteins encoded by SARS-CoV-2 genome

2 病毒靶向藥物

2.1 阿比朵爾(arbidol) 阿比朵爾是一種血凝素抑制劑，可抑制流感病毒脂質(zhì)囊膜與宿主細(xì)胞膜的接觸、吸附及融合。目前包括回顧性隊列研究、病例報告在內(nèi)的證據(jù)都顯示，阿比朵爾單獨或聯(lián)合抗病毒藥物治療COVID-19有一定療效[11-14]，并能改善COVID-19患者的肺部CT影像，提高鼻咽拭子轉(zhuǎn)陰率[15]。

2.2 氯喹(chloroquine，CQ)及羥氯喹(hydroxychloroquine，HCQ) CQ及HCQ廣泛用于治療瘧疾及自身免疫性疾病，可作用于病毒囊膜發(fā)揮抗病毒活性。體外研究顯示，CQ、HCQ在SARS-CoV-2細(xì)胞進(jìn)入及進(jìn)入后階段均起作用[16]，其半最大效應(yīng)濃度(EC50)分別為2.71、4.51 μmol/L[17]。然而，有臨床研究發(fā)現(xiàn)，口服HCQ會使COVID-19患者的QT間期延長，患者出現(xiàn)心律不齊及心臟性猝死的風(fēng)險較高[18]。同時，另外幾項大型隨機(jī)對照試驗研究也證明CQ抗SARS-CoV-2的作用不明顯，且不良反應(yīng)多[19-20]。

2.3 S蛋白靶向藥物 S蛋白在病毒識別宿主受體、吸附及進(jìn)入細(xì)胞等過程中發(fā)揮重要作用。目前發(fā)現(xiàn)的幾種S蛋白靶向藥物見表1。

表1 S蛋白靶向藥物Tab.1 Drugs targeting spike protein

2.4 PLpro及3CLpro抑制劑

2.4.1 洛匹那韋/利托那韋(lopinavir/ritonavir，LPV-r) 研究發(fā)現(xiàn)，LPV-r可通過抑制冠狀病毒PLpro及3CLpro發(fā)揮抗病毒活性[29-30]，且有多項臨床證據(jù)表明，LPV-r可改善SARS或MERS重癥患者的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，從而改善患者預(yù)后[29,31-32]。最近一項回顧性隊列研究指出，LPV-r與阿比朵爾聯(lián)合治療可改善COVID-19患者的肺部CT影像學(xué)表現(xiàn)，對病毒轉(zhuǎn)陰也有促進(jìn)作用[15]。然而，其他臨床試驗則顯示，LPV-r治療并不能降低28 d內(nèi)死亡人數(shù)[33]，且LPV-r治療還會出現(xiàn)急性腎損傷及繼發(fā)性感染等嚴(yán)重并發(fā)癥[34]。

2.4.2 N3、11a及11b N3是一種Michael受體抑制劑，能與SARS-CoV-2的3CLpro形成共價鍵，是一種不可逆的3CLpro抑制劑。體外實驗表明，N3可顯著抑制SARS-CoV-2對Vero細(xì)胞的感染，其EC50為16.77 μmol/L[35]?；?CLpro的三維結(jié)構(gòu)，研究人員還設(shè)計合成了擬肽類化合物11a、11b，并通過空斑試驗測定出11a、11b對SRAS-CoV-2同樣具有較好的抑制作用，其EC50分別為0.53、0.72 μmol/L[36]。2.5 RdRp抑制劑

2.5.1 瑞德西韋(remdesivir) 瑞德西韋屬于核苷酸類似物，最初是為了控制埃博拉病毒而開發(fā)[37]，隨后證實其在體外可干擾病毒RdRp，具有抗SARSCoV、MERS-CoV等冠狀病毒的活性[38-39]。然而，目前瑞德西韋對COVID-19的療效仍存在爭議。有研究對53例采用瑞德西韋治療的重癥COVID-19患者進(jìn)行隨訪，發(fā)現(xiàn)在平均18 d的隨訪中，大部分患者的臨床癥狀有緩解或出院，僅有7例死亡，表明瑞德西韋治療COVID-19是有希望的[40]。但另一項涉及237例的研究則顯示，與安慰劑相比，瑞德西韋治療的COVID-19重癥患者在臨床癥狀消失時間、病死率及病毒清除時間等方面無明顯改善[41]。

2.5.2 法匹拉韋(favipiravir) 法匹拉韋具有廣泛的抗病毒活性，可通過抑制病毒RdRp而干擾病毒基因組的復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)，無論是采用定量RTPCR法還是免疫熒光法，法匹拉韋均可明顯抑制SARS-CoV-2在Vero E6細(xì)胞中的復(fù)制，其EC50為61.88 μmol/L[16]。此外，一項回顧性研究也表明法匹拉韋治療COVID-19中度感染患者在7 d恢復(fù)率及癥狀緩解時間方面優(yōu)于阿比朵爾[42]。但法匹拉韋單藥治療大樣本病例的有效性及安全性還需進(jìn)一步研究。

2.5.3 EIDD-2801 EIDD-2801是基于核苷酸類似物EIDD-1931而設(shè)計的新藥，該藥通過模擬核糖核酸結(jié)合到病毒RNA中，導(dǎo)致病毒在RNA合成過程中出現(xiàn)致死性突變，抑制病毒復(fù)制所需的RdRp。體外實驗顯示，EIDD-2801不僅對SARS-CoV、MERSCoV及SARS-CoV-2具有抑制作用，對其他冠狀病毒甚至瑞德西韋耐藥毒株也同樣具有較強的抗病毒活性，其對SARS-CoV-2的IC50為0.3 μmol/L[43-44]。

3 宿主靶向藥物

3.1 絲氨酸蛋白酶TMPRSS2抑制劑 SARS-CoV-2進(jìn)入細(xì)胞需要宿主TMPRSS2活化S蛋白。體外實驗證實，甲磺酸卡莫司他(camostat mesilate)可通過抑制TMPRSS2降低SARS-CoV-2對Calu-3細(xì)胞的感染[7]。另外，TMPRSS2抑制劑甲磺酸萘莫司他(nafamostat mesilate)對SARS-CoV-2感染也有抑制作用，其EC50為22.50 μmol/L[16]。

3.2 二氫乳清酸脫氫酶(dihydroorotate dehydrogenase，DHODH)抑制劑 S312與S416是兩個靶向宿主細(xì)胞DHODH的抑制劑，可通過抑制病毒基因組復(fù)制與免疫調(diào)節(jié)作用而發(fā)揮廣譜抗病毒活性。有研究將S312、S416與病毒在Vero細(xì)胞上共培養(yǎng)24 h，然后用定量RT-PCR法對細(xì)胞上清中的病毒RNA進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示S312、S416均具有高效抗SARSCoV-2活性，其EC50分別為1.56、0.017 μmol/L[45]，其中S416的選擇指數(shù)大于5882。

PTC299也是一種DHODH抑制劑。有研究用不同濃度的PTC299預(yù)處理Vero細(xì)胞24 h，然后再用感染復(fù)數(shù)(MOI)=0.05的SARS-CoV-2感染細(xì)胞48 h，最后用免疫熒光法定量檢測細(xì)胞內(nèi)的病毒蛋白，結(jié)果顯示，PTC299可使細(xì)胞內(nèi)的病毒載量明顯降低，呈劑量依賴關(guān)系，其EC50為1.96 nmol/L[46]。

3.3 免疫調(diào)節(jié)劑 巴瑞替尼(baricitinib)是一種酪氨酸激酶抑制劑，不僅可通過劫持細(xì)胞因子信號通路來阻止過度的免疫反應(yīng)，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)吞作用，阻止SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞[8,47-48]。托西珠單抗(tocilizumab)則可通過抑制白細(xì)胞介素-6，防止SARS-CoV-2導(dǎo)致的細(xì)胞因子風(fēng)暴引起過度免疫反應(yīng)[49-50]?；仡櫺匝芯勘砻?，托西珠單抗可緩解COVID-19患者發(fā)熱、低氧血癥等臨床癥狀及CT影像學(xué)表現(xiàn)，且未見明顯的不良反應(yīng)[51]。

3.4 輔助治療藥物

3.4.1 皮質(zhì)類固醇 皮質(zhì)類固醇可降低毛細(xì)血管通透性并抑制炎性細(xì)胞水平，從而減輕肺部炎癥反應(yīng)。一項回顧性研究發(fā)現(xiàn)，對于發(fā)生了ARDS的COVID-19患者，用甲潑尼龍治療可降低死亡風(fēng)險[52]。另一項大規(guī)模臨床試驗也顯示，地塞米松使COVID-19重癥患者的病死率降低了1/3[53]。然而，高劑量皮質(zhì)類固醇可能會導(dǎo)致繼發(fā)性感染、病毒清除延遲及病毒耐藥性的出現(xiàn)，因此必須謹(jǐn)慎使用。3.4.2 肝素 有研究發(fā)現(xiàn)，接受肝素抗凝治療的COVID-19重癥患者的預(yù)后更佳[54-55]，因此新型肝素類化合物的開發(fā)具有重要意義，但未來仍需要大樣本的臨床研究證實肝素對COVID-19的治療作用。

3.4.3 維生素 動物實驗證實，維生素C可保護(hù)肺屏障功能，并通過減輕炎癥反應(yīng)及凝固性改變來減輕肺血管損傷[56-57]；維生素D則通過誘導(dǎo)抗菌肽的產(chǎn)生、降低病毒復(fù)制速度從而阻止促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[58]。目前，維生素D治療COVID-19患者的臨床試驗正在進(jìn)行中。

4 總結(jié)與展望

COVID-19大流行是21世紀(jì)以來人類面臨的最大全球公共衛(wèi)生危機(jī)，但目前仍無安全有效的藥物應(yīng)用于臨床治療。當(dāng)前面臨的主要挑戰(zhàn)包括：(1)缺乏能夠完全模擬人類COVID-19患者疾病特征的動物模型，導(dǎo)致許多藥物的臨床前研究受限；(2)許多藥物雖在臨床前實驗中顯示出良好的抗病毒活性，但缺乏有說服力的臨床試驗數(shù)據(jù)；(3)老藥新用策略未在臨床試驗中顯示出明顯優(yōu)勢，沒有確切證據(jù)證實哪種現(xiàn)有藥物可提高病毒清除率；(4)由于不同地區(qū)的疫情嚴(yán)重程度不同，病例分散且數(shù)量較少的地區(qū)開展臨床試驗的可行性相對較低；(5)新型冠狀病毒易發(fā)生突變，增加了特異性藥物的研發(fā)難度。

就現(xiàn)有的抗新型冠狀病毒藥物研究結(jié)果而言，病毒靶向的中和抗體最有希望成為緩解COVID-19疫情的藥物，雖然SARS-CoV-2中和逃逸株的出現(xiàn)可能會限制抗體療效，但針對刺突蛋白不同位點的抗體雞尾酒療法有助于防止病毒產(chǎn)生耐藥性(表2)。

表2 抗新型冠狀病毒藥物研究現(xiàn)況Tab.2 Research status of candidate drugs against SARS-CoV-2

此外，研發(fā)宿主靶向藥物也是未來突破病毒耐藥問題不可或缺的方向。同時，高通量篩選、人工智能及計算機(jī)輔助藥物設(shè)計等多學(xué)科新興技術(shù)的結(jié)合運用，也將成為未來新藥研發(fā)的主流趨勢。