Z-沒藥甾酮經(jīng)ERK/MAPK通路對糖尿病大鼠皮膚潰瘍的祛腐生肌作用及機(jī)制

李洋，陳慶良，張帆

1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070；2天津市胸科醫(yī)院心血管外科，天津 300222；3河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院影像科，石家莊 050061

糖尿病是一組以慢性高血糖為特征的全身代謝性疾病，隨著病情進(jìn)展可出現(xiàn)各種并發(fā)癥，其中糖尿病足壞疽為常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，輕則致足部潰瘍，重則致殘[1]。糖尿病足是一種進(jìn)行性、慢性、涉及肢體血管與外周神經(jīng)的特殊疾病，在中醫(yī)學(xué)中歸為“脫疽”范疇，臨床表現(xiàn)為肢端疼痛、麻木、潰瘍、感染等。關(guān)于糖尿病足壞疽的治療方法，從總體來講是降血糖、控制感染、清創(chuàng)換藥，但從局部來講，皮膚潰瘍治療是炎性細(xì)胞與修復(fù)細(xì)胞等共同參與的復(fù)雜生理網(wǎng)絡(luò)過程[2]。歷代中醫(yī)學(xué)者對脫疽有深入研究，發(fā)現(xiàn)沒藥有祛瘀散血、消腫生肌、止痛活血的功效[3]。Z-沒藥甾酮(Z-guggulsterone，Z-GS)為其主要藥效物質(zhì)，有消炎、促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用[4]。本研究通過建立糖尿病皮膚潰瘍大鼠模型，進(jìn)一步觀察Z-GS治療皮膚潰瘍的作用并探討其可能機(jī)制，旨在為相關(guān)藥物的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 7周齡SPF級SD大鼠65只，雌雄各半，體重250～270 g，購自天津市中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院[動物實(shí)驗(yàn)許可證號：SCXK(津)2015-0003；批號：0079418]。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22±2) ℃，濕度55%～75%，12 h循環(huán)光照，自由攝食、飲水。實(shí)驗(yàn)過程符合國家及單位實(shí)驗(yàn)動物管理規(guī)定。

1.1.2 藥物、主要試劑及儀器 Z-G S(純度≥90%，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司)，鏈脲佐菌素(貨號S0130，上海佰世凱化學(xué)科技有限公司)，ERK抑制劑PD98059(貨號P215，北京百奧萊博科技有限公司)，復(fù)方磺胺嘧啶鋅凝膠劑(批號171203，成都第一藥物研究所有限公司)，白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫試劑盒(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)，兔抗鼠CD34單克隆抗體、酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，兔抗大鼠細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase1/2，ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷酸化MAPK(p-MAPK)、GAPDH單克隆抗體以及辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(北京百奧萊博科技有限公司)。HM-200電子天平(上海雙旭電子有限公司)，64R高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)，Model ELX800酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)，GELDOC2000凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 10只大鼠設(shè)為健康組，其余55只大鼠建立糖尿病皮膚潰瘍模型[5]，取0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液將鏈脲佐菌素配制成0.45%的溶液，按55 mg/kg體重進(jìn)行尾靜脈注射，72 h后測定血糖，若空腹血糖值為13.5～25.0 mmol/L，則正式納入皮膚潰瘍造模，即對大鼠腰背兩側(cè)去毛，以2 cm×2 cm印筐沾龍膽紫染色后印于皮膚，沿筐壁剪開皮膚，深入至淺筋膜，切除2 cm×2 cm面積的皮膚，造成缺損創(chuàng)面，每日涂抹50%冰醋酸，1周后形成缺損型的皮膚潰瘍大鼠模型。健康組經(jīng)尾靜脈注射等體積生理鹽水，腰背兩側(cè)除毛，不做其他處理，用于對比觀察55只大鼠是否造模成功。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：與健康組比較，造模成功大鼠形體偏瘦，毛色發(fā)黃，籠內(nèi)異味嚴(yán)重，進(jìn)食量、飲水量、排尿量等明顯增多，空腹血糖升高(>16.7 mmol/L)且高于健康組，符合糖尿病的體征與癥狀，不同時間點(diǎn)的創(chuàng)面發(fā)白，分泌物清稀、量少，肉芽生成少且愈合緩慢，符合中醫(yī)陰證瘡瘍的指征。造模期間死亡11只，建模成功44只，隨機(jī)分為模型組、Z-GS組、抑制劑+Z-GS組、陽性對照組(n=11)。

1.2.2 干預(yù)與取材 造模成功后檢測大鼠空腹血糖值，并于次日開始給藥，先以生理鹽水擦洗創(chuàng)面，拭去分泌物后清潔創(chuàng)面。模型組以凡士林紗條覆蓋創(chuàng)面，陽性對照組予以復(fù)方磺胺嘧啶鋅凝膠劑(對應(yīng)創(chuàng)面在紗條上涂抹3 g軟膏制劑)，Z-GS組予以Z-GS(Z-GS溶于10% DMSO，濃度20 mmol/L)10 μl，抑制劑+Z-GS組予以ERK抑制劑PD98059 300 μg/L+Z-GS 20 mmol/L共計10 μl。1次/d，連續(xù)用藥4周。在給藥1、2、3、4周分別使用透明膜覆蓋創(chuàng)面，以記號筆在邊緣描畫創(chuàng)面大小、形狀，方便計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率(%)=(給藥前創(chuàng)面面積－給藥后創(chuàng)面面積)/給藥前創(chuàng)面面積×100%。給藥4 周后以2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取創(chuàng)面0.2 cm×0.4 cm大小的肉芽組織，置入4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2.3 大鼠血清炎性因子含量測定 在給藥4周后，以2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈取血3 ml，室溫下1500 r/min離心15 min，離心半徑10 cm，取上清液，參考酶聯(lián)免疫試劑盒說明書檢測血清IL-8、TNF-α含量，采用酶標(biāo)儀在492 nm處測定IL-8、TNF-α的光密度值，計算血清IL-8、TNF-α水平。

1.2.4 大鼠潰瘍創(chuàng)面的組織病理學(xué)觀察 取已固定的肉芽組織標(biāo)本進(jìn)行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度5 μm。將切片脫蠟至水，浸入蘇木精液染色5 min，自來水沖洗，使切片藍(lán)化。蒸餾水沖洗，入伊紅染液復(fù)染，脫水、分化、透明、封固，鏡下觀察肉芽組織的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核被蘇木精染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)、結(jié)締組織、嗜酸性顆粒等被染為紅色。

1.2.5 免疫組化法檢測大鼠創(chuàng)面組織中的微血管含量(MVD) 石蠟包埋、切片(5 μm厚)、脫蠟、脫水步驟同上，PBS洗滌，滴加3% H2O2于切片上，室溫靜置10 min，PBS洗滌。切片浸入檸檬酸鹽修復(fù)液中，微波抗原修復(fù)。滴入一抗(兔抗鼠CD34單克隆抗體)，4 ℃過夜，滴加二抗(酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物)，DAB顯色、復(fù)染、脫水、封固，以PBS代替一抗作為陰性對照。參考微血管染色試劑盒說明書，染色后切片。光鏡下呈棕褐色或棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，隨機(jī)選6個視野(×100)，以背景有明確區(qū)別的任意棕褐色或棕黃色的細(xì)胞叢為一個血管數(shù)量，計算MVD。

1.2.6 Western blotting檢測大鼠潰瘍組織中ERK/MAPK通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 從-80 ℃冰箱中取出已固定的模型組、Z-GS組、抑制劑+Z-GS組大鼠肉芽組織標(biāo)本20 mg，加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液200 μl中研磨，移入1.5 ml EP管內(nèi)，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清，提取含組織總蛋白的蛋白溶液，置于-20 ℃保存。測定蛋白濃度，沸水浴變性10 min，上樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜。將PVDF膜置入5%脫脂奶粉中封閉，4 ℃過夜后加入一抗(1:1000的兔抗大鼠ERK1/2、p-ERK1/2、MAPK、p-MAPK、GAPDH單克隆抗體)，室溫孵育2 h，TBST洗膜，加入二抗(1:5000的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG)，室溫孵育2 h，TBST洗膜后進(jìn)行ECL顯色反應(yīng)，曝光、顯影、過水、定影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，均符合正態(tài)分布；經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，創(chuàng)面愈合率、血清炎性因子含量等數(shù)據(jù)方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；ERK/MAPK通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量數(shù)據(jù)方差不齊，采用Welch檢驗(yàn)，進(jìn)一步比較采用DunnettT3檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率比較 給藥1、2、3、4周，模型組、抑制劑+Z-GS組、Z-GS組、陽性對照組的皮膚創(chuàng)面愈合率均持續(xù)升高，組間、時間、交互比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在給藥1、2、3、4周時，與模型組比較，抑制劑+Z-GS組、Z-GS組、陽性對照組皮膚創(chuàng)面愈合率較高(P<0.05)；與陽性對照組比較，抑制劑+Z-GS組、Z-GS組皮膚創(chuàng)面愈合率較低(P<0.05)；與Z-GS組比較，抑制劑+Z-GS組皮膚創(chuàng)面愈合率較低(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率比較(%，±s，n=11)Tab.1 Comparison of the healing rate of skin wound of rats in each group (%, ±s, n=11)

表1 各組大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率比較(%，±s，n=11)Tab.1 Comparison of the healing rate of skin wound of rats in each group (%, ±s, n=11)

GS. Z-沒藥甾酮；F組間=16.399，P組間<0.001；F時間=25.695，P時間<0.001；F交互=34.785，P交互<0.001；與模型組比較，(1)P<0.05；與陽性對照組比較，(2)P<0.05；與Z-GS組比較，(3)P<0.05；與1周比較，(4)P<0.05；與2周比較，(5)P<0.05；與3周比較，(6)P<0.05。

組別1周2周3周4周FP模型組4.14±0.1610.77±2.1623.97±2.7241.75±2.79607.703＜0.001陽性對照組19.18±1.22(1)30.37±2.16(1)(4)42.75±3.94(1)(4)(5)70.78±4.29(1)(4)(5)(4)(6)541.125＜0.001 Z-GS組10.89±0.75(1)(2)19.56±2.48(1)(2)(4)34.78±3.41(1)(2)(4)(5)51.47±3.14(1)(2)(4)(5)(6)496.821＜0.001抑制劑+Z-GS組6.98±0.24(1)(2)(3)15.34±2.28(1)(2)(3)(4)29.25±2.47(1)(2)(3)(4)(5)46.69±2.88(1)(2)(3)(4)(5)(6)675.968＜0.001

2.2 大鼠血清炎性因子水平變化 大鼠血清IL-8、TNF-α水平組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中，與模型組比較，抑制劑+Z-GS組、Z-GS組、陽性對照組IL-8、TNF-α水平明顯降低(P<0.05)；與陽性對照組比較，抑制劑+Z-GS組、Z-GS組IL-8、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)；與Z-GS組比較，抑制劑+Z-GS組IL-8、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)(表2)。

表2 各組血清炎性因子水平(pg/g，±s，n=11)Tab.2 Serum levels of inflammatory factors of rats in each group (pg/g, ±s, n=11)

表2 各組血清炎性因子水平(pg/g，±s，n=11)Tab.2 Serum levels of inflammatory factors of rats in each group (pg/g, ±s, n=11)

Z-GS. Z-沒藥甾酮；與模型組比較，(1)P<0.05；與陽性對照組比較，(2)P<0.05；與Z-GS組比較，(3)P<0.05。

組別IL-8TNF-α模型組258.15±7.9580.21±7.45陽性對照組177.56±5.18(1)50.45±2.12(1)Z-GS組204.11±6.71(1)(2)61.48±3.64(1)(2)抑制劑+Z-GS組233.18±8.48(1)(2)(3)73.16±4.26(1)(2)(3)F 260.10882.646 P<0.001<0.001

2.3 大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面的病理學(xué)觀察結(jié)果 模型組大鼠新生表皮菲薄，真皮有大量炎性細(xì)胞浸潤，散見成纖維細(xì)胞，毛細(xì)血管、膠原纖維少見。與模型組比較，陽性對照組新生皮膚結(jié)構(gòu)近完整，炎性細(xì)胞浸潤少見，毛細(xì)血管含量豐富，膠原纖維較粗；抑制劑+Z-GS組、Z-GS組表皮明顯增厚，創(chuàng)面覆蓋較厚痂皮，炎性細(xì)胞浸潤減少，毛細(xì)血管含量豐富，膠原纖維細(xì)少；與陽性對照組比較，抑制劑+Z-GS組、Z-GS組新生皮膚欠完整，炎性細(xì)胞浸潤相對較多，毛細(xì)血管、膠原纖維欠豐富(圖1)。

圖1 大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面病理學(xué)觀察(HE ×40)Fig.1 Pathology of skin ulcer wounds of rats (HE ×40)

2.4 大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面中的MVD CD34為常用的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物，表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。給藥4周后，模型組、抑制劑+Z-GS組、Z-GS組、陽性對照組大鼠創(chuàng)面MVD分別為(3.33±0.67)條/mm2、(5.14±0.48)條/mm2、(8.63±0.47)條/mm2、(14.78±0.49)條/mm2，呈逐漸增高趨勢(P<0.05，圖2)。

圖2 大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面中的MVD(免疫組化染色 ×100)Fig.2 Microvessel density in rat skin ulcer wounds (Immunohistochemistry ×100)

2.5 大鼠皮膚潰瘍組織中E R K/M A P K 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 大鼠創(chuàng)面組織中ERK1/2、M A P K 蛋白相對表達(dá)量組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，抑制劑+Z-GS組、Z-GS組p-ERK1/2、p-MAPK蛋白表達(dá)水平較高(P<0.05)；與Z-GS組比較，抑制劑+Z-GS組p-ERK1/2、p-MAPK蛋白表達(dá)水平較低(P<0.05)(表3、圖3)。

圖3 Western blotting檢測大鼠皮膚潰瘍組織ERK/MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.3 Protein expression of ERK/MAPK pathway in rats' skin ulcer tissue by Western blotting

表3 各組大鼠皮膚潰瘍組織中ERK/MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平(±s，n=11)Tab.3 Expression levels of ERK/MAPK pathway related proteins in skin ulcer tissues of rats in each group (±s, n=11)

表3 各組大鼠皮膚潰瘍組織中ERK/MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平(±s，n=11)Tab.3 Expression levels of ERK/MAPK pathway related proteins in skin ulcer tissues of rats in each group (±s, n=11)

與模型組比較，(1)P<0.05；與Z-GS組比較，(2)P<0.05。

組別ERK1/2p-ERK1/2MAPKp-MAPK模型組0.75±0.110.22±0.030.56±0.150.12±0.03 Z-GS組0.71±0.110.42±0.06(1)0.52±0.090.35±0.05(1)抑制劑+Z-GS組0.74±0.150.35±0.04(1)(2)0.51±0.110.24±0.02(1)(2)F 0.31083.6590.418152.908 P 0.818<0.0010.741<0.001

3 討 論

慢性皮膚潰瘍多因手術(shù)切口、意外創(chuàng)傷、糖尿病、下肢靜脈曲張等引起，屬于臨床難治性疾病。近年來，伴隨糖尿病發(fā)生率的增高，糖尿病所致并發(fā)癥——皮膚潰瘍也隨之增多，國外報道糖尿病患者一生中有25%的概率并發(fā)糖尿病足壞疽，是導(dǎo)致患者截肢的主要原因[6]。糖尿病足壞疽與下肢遠(yuǎn)端神經(jīng)異常、周圍血管病變相關(guān)，病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制涉及細(xì)胞、分子、基因等，但其具體機(jī)制目前尚不清楚，目前多認(rèn)為與骨質(zhì)異常、外周神經(jīng)疾病、傷口微循環(huán)障礙、傷口愈合有關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)等有關(guān)[7]。對于中藥促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制，目前多從促進(jìn)創(chuàng)面血液循環(huán)、創(chuàng)面修復(fù)、細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路等方面進(jìn)行探索。Z-GS為中藥沒藥的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、改善血管內(nèi)皮功能等作用，應(yīng)用前景廣闊，已證實(shí)其在局灶性腦缺血、缺血性腦卒中的治療中有促進(jìn)新生血管網(wǎng)絡(luò)建立等作用，因此推測將其用于皮膚潰瘍的治療具有一定可行性[8]。

本研究采用注射鏈脲佐菌素+皮膚缺損的方法建立糖尿病皮膚潰瘍大鼠模型，其癥狀表現(xiàn)、創(chuàng)面愈合率變化(呈時間依賴性)基本符合慢性皮膚潰瘍的造模要求。在實(shí)驗(yàn)的不同時間點(diǎn)，從模型組到抑制劑+Z-GS組、Z-GS組，大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率依次升高，提示Z-GS可促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面的愈合。HE染色結(jié)果顯示，與模型組比較，Z-GS組潰瘍處新生表皮厚度、結(jié)構(gòu)及炎癥浸潤等明顯改善，進(jìn)一步提示Z-GS在創(chuàng)面愈合中具有祛腐生肌的作用。IL-8、TNF-α是促炎癥反應(yīng)中最活躍的細(xì)胞因子，在創(chuàng)面修復(fù)乃至機(jī)體生存中均具有重要作用[9-10]。IL-8主要生物學(xué)功能為將中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞趨化到病灶部位，發(fā)揮促炎作用。TNF-α是誘發(fā)感染性疾病的重要炎癥機(jī)制，其生物學(xué)活性廣泛，既可殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞，亦可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的吞噬功能，刺激IL-8分泌，引發(fā)惡病質(zhì)、感染性休克等[11]。強(qiáng)烈、持續(xù)的炎癥反應(yīng)可殺傷正常細(xì)胞，阻礙創(chuàng)面修復(fù)。本研究結(jié)果顯示，Z-GS組大鼠血清IL-8、TNF-α水平均低于模型組，提示Z-GS可通過降低炎性因子水平促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合[12]。創(chuàng)面愈合是一個連續(xù)、復(fù)雜的過程，肉芽組織形成是創(chuàng)面修復(fù)愈合的關(guān)鍵步驟，因此創(chuàng)面新生血管生成具有重要意義[13]。CD34是血管內(nèi)皮的標(biāo)志物，選擇性表達(dá)于小血管內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)免疫組化實(shí)驗(yàn)可標(biāo)記創(chuàng)面肉芽組織切片中的微血管[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，Z-GS組皮膚創(chuàng)面MVD高于模型組，提示Z-GS可促進(jìn)創(chuàng)面微血管生成，加速肉芽組織生長，改善微循環(huán)，從而發(fā)揮去腐生肌的作用。

ERK/MAPK通路是炎性因子、生長因子、細(xì)胞因子等多種因子發(fā)揮作用的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂的信號網(wǎng)絡(luò)核心[15]。MAPK廣泛存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，是高度保守的一類絲氨酸蛋白酶，是多種細(xì)胞因子向核內(nèi)傳導(dǎo)信號的公共途徑，調(diào)控機(jī)體的諸多生理活動，參與細(xì)胞分化、增殖、分裂與凋亡等過程。ERK是MAPK家族中的一員，其觸發(fā)因素包括多種蛋白、激酶、細(xì)胞因子、生長因子等[16]。ERK1/2是以脯氨酸為導(dǎo)向的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有廣泛的催化活性，激活后可進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化底物，促進(jìn)細(xì)胞增殖。肖敏等[17]發(fā)現(xiàn)，慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面長期不愈合與炎癥反應(yīng)、ERK/MAPK通路有關(guān)。近年來，ERK/MAPK通路在潰瘍發(fā)病過程中的作用備受關(guān)注，彭海娟等[18]發(fā)現(xiàn)，ERK信號通路可促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸上皮細(xì)胞的分化與增殖，并抑制凋亡，提示ERK信號通路與潰瘍愈合有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，從模型組到抑制劑+Z-GS組、Z-GS組，大鼠創(chuàng)面組織中p-ERK1/2、p-MAPK蛋白表達(dá)水平依次升高，提示Z-GS可能是通過激活ERK/MAPK通路來治療皮膚潰瘍的。

綜上所述，Z-GS可能通過激活ERK/MAPK通路對糖尿病大鼠皮膚潰瘍發(fā)揮祛腐生肌作用。因條件受限，本研究樣本量較小，且僅檢測了ERK/MAPK通路蛋白的表達(dá)，皮膚潰瘍的病理機(jī)制及Z-GS的治療機(jī)制均較復(fù)雜，該藥物治療皮膚潰瘍是否通過其他信號通路，仍有待進(jìn)一步深入研究。