借助機器視覺進行電化學發(fā)光檢測的開放實驗設(shè)計及教學探討

劉 根，王培龍，高 慧

(淮北師范大學 化學與材料科學學院，安徽 淮北 235000)

化學專業(yè)實驗作為化學理論課的重要支撐，是理論應(yīng)用于實踐的重要環(huán)節(jié)，目的在于培養(yǎng)學生嚴謹?shù)目茖W態(tài)度，提高學生分析解決問題的能力以及主動實踐能力[1]。開放實驗作為高等院校實驗課程的重要補充部分，往往能夠激發(fā)學生學習興趣，提高學生探索求知的能動性。就化學類開放實驗而言，往往承載提升學生實驗操作能力，培養(yǎng)學生獨立思考和設(shè)計實驗等科研素質(zhì)的重大任務(wù)[2-3]。

機器視覺就是用機器代替人眼來做測量和判斷。機器視覺系統(tǒng)是指通過機器視覺產(chǎn)品(工業(yè)相機或科研相機)將被攝取目標轉(zhuǎn)換成圖像信號，傳送給專用的圖像處理系統(tǒng)，根據(jù)像素分布和亮度、顏色等信息，轉(zhuǎn)變成數(shù)字化信號；圖像系統(tǒng)提取相關(guān)信息后進行分析應(yīng)用[4-5]。

電致化學發(fā)光(ECL)是指通過施加一定的電壓在電極的表面產(chǎn)生電生物質(zhì)，這些物質(zhì)彼此之間或與體系中某些組分(共反應(yīng)劑)之間以電子傳遞的方式形成激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的物質(zhì)返回基態(tài)釋放能量的同時產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象[6-8]。電致化學發(fā)光是化學發(fā)光與電化學技術(shù)相結(jié)合的一種分析方法，它在繼承二者的優(yōu)點的同時還具有獨特的優(yōu)勢。醫(yī)院對癌癥標志物進行免疫檢測，利用的就是在ECL羅氏技術(shù)，因為電致化學發(fā)光無需激發(fā)光源從而避免了外加光的干擾，并且由于檢測信號為光信號，這就排除了電化學反應(yīng)中電的干擾，具有接近于零的背景信號，提高了信噪比，從而具有高的選擇性、靈敏度[9-10]。關(guān)于電化學分析和光學分析的理論知識，大學生已在“儀器分析”課程中學習，但在大學生的基礎(chǔ)實驗中，很少有兩種方法相結(jié)合的分析檢測試驗。

在分析化學類專業(yè)中，開設(shè)機器視覺電化學發(fā)光檢測的開放實驗，將電化學和光學的理論知識與具體的實驗相結(jié)合，使學生深刻了解電化學發(fā)光的工作原理、材料的制備方法和ECL檢測過程。引導(dǎo)學生搜索、分析、篩選相關(guān)材料，自主設(shè)計電化學發(fā)光檢測平臺，進行實驗并根據(jù)實驗結(jié)果得出相關(guān)結(jié)論。實驗過程中，不僅可以讓學生掌握現(xiàn)代儀器分析的專業(yè)知識，了解電化學發(fā)光領(lǐng)域的研究熱點，還可以讓學生在實驗過程中具體學習到納米材料制備、表征及性能測試的方法，培養(yǎng)學生查閱文獻和論文寫作等方面能力。

本開放實驗適用于材料化學類，應(yīng)用化學類和化學師范類本科生，學生應(yīng)當了解當前ECL技術(shù)和光學成像技術(shù)的研究進展，熟悉ECL成像在現(xiàn)代分析化學領(lǐng)域的應(yīng)用。參與實驗的學生要掌握常見ECL探針的制備方法，能夠獨立設(shè)計簡單的納米材料并進行實驗室合成。機器視覺電化學發(fā)光檢測開放實驗的開設(shè)，能夠讓學生學會設(shè)計可視化ECL平臺，同時了解材料表征的常見方法，從而提高學生自主思考、自行設(shè)計實驗和分析解決問題的能力。

一、實驗具體教學要求

實驗教學要求具體有以下幾點：第一，了解電化學發(fā)光的工作原理、發(fā)展歷史及現(xiàn)階段研究趨勢；第二，掌握常見材料的合成方法和目標物檢測方式。學生通過收集相關(guān)文獻，討論并初步制定實驗方案和相關(guān)實驗步驟；第三，教師對學生的方案進行研判，指導(dǎo)學生優(yōu)化方案，提高實驗的可行性；第四，了解掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)等常規(guī)測試儀器的工作原理和用途，通過對所合成的材料進行表征，學生能夠?qū)Σ牧系钠焚|(zhì)進行描述和評判，進一步培養(yǎng)學生解決實際問題的能力；第五，待測物質(zhì)造成ECL信號的變化，從而實現(xiàn)對待測物質(zhì)的定性和定量分析。該過程中，訓(xùn)練學生自身的儀器操作能力，學以致用，獲得合理的實驗結(jié)果，提高學生對數(shù)據(jù)的分析能力。

二、開放實驗內(nèi)容

(一)生物酶功能化的大金球的合成

1 M H2SO4加入5g/L Na3Au(SO3)2溶液中，反應(yīng)十分鐘，大尺寸金球顆粒形成并沉淀到試管底部。然后，用二次去離子水反復(fù)洗滌沉淀物。緊接著，在37℃的溫度下，金球顆粒、磷脂酶D(PLD，5 U/mL)和葡萄糖氧化酶(COD，2 U/mL)一起孵育24小時。在Au-S的作用下，PLD和COD自組裝到金球表面。最后，使用二次去離子水對生物酶功能化的金球進行徹底沖洗，除去沒有吸附到金球上的PLD和COD。

圖1 金球的SEM圖(A)和TEM圖(B)

(二)材料表征

利用SEM和TEM對金球的形貌和性能進行表征。圖1(A)和(B)分別是金球的SEM和TEM圖，很容易看出，金球大小不一，尺寸分布在100 nm～2μm之間，而且金球表面粗糙，這表明本方法合成的金球有效表面積較大以及催化活性位點較多。通過SEM和TEM測試，使學生掌握表征材料形貌的方法，在實驗中提高了學生分析和評價材料性能的能力。

(三)機器視覺下磷脂酰膽堿的檢測

在含有發(fā)光劑L012和待測物磷脂酰膽堿(PdtCho)的溶液中，施加一定電壓，進行ECL圖像采集。學生在分析成像數(shù)據(jù)后，發(fā)現(xiàn)金球在發(fā)光時存在個體性差異，但金球群體的發(fā)光強度滿足統(tǒng)計學規(guī)律。如圖2(A)所示，金球在ECL場中基本上都發(fā)光，但發(fā)光強度不均一，如圖2(B)，發(fā)光強度在116.3 a.u.左右浮動。進一步考察平均ECL強度與金球數(shù)目的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)隨著金球數(shù)目增多，平均ECL強度趨于穩(wěn)定，30個及以上數(shù)目金球的平均ECL強度十分相近。因此，本實驗至少采集30個金球的平均ECL信號作為檢測信號。

圖2 在含有L012和PdtCho溶液中的金球的ECL圖(A)和ECL強度的表面3D偽彩圖(B)

優(yōu)化條件之后，對不同濃度的PdtCho進行檢測。檢測原理如下，金球表面吸附有PLD和COD，兩種酶協(xié)同催化PdtCho產(chǎn)生H2O2，H2O2又是ECL試劑L012的共反應(yīng)劑。因此，PdtCho濃度越大，金球表面產(chǎn)生的H2O2就越多，收集到ECL信號就越強，據(jù)此可以建立待測物PdtCho的濃度與ECL強度的關(guān)系，從而實現(xiàn)對PdtCho的檢測。本實驗中，隨著PdtCho濃度增加，30個金球的平均ECL強度增加，并且在0.5～10mM的濃度范圍內(nèi)滿足一定的線性關(guān)系，線性方程為I=20.23C+16.04，r=0.9916，檢出限為0.05mM。同學們通過ECL成像實驗獲得單個金球的ECL圖像，通過觀察和討論，發(fā)現(xiàn)金球發(fā)光的個體性差異和統(tǒng)計學規(guī)律，提高了學生自身的歸納總結(jié)的能力。對PdtCho進行定量分析，進一步驗證這種統(tǒng)計學規(guī)律的有效性，同時建立ECL成像檢測PdtCho的新方法。此過程有助于提高學生發(fā)現(xiàn)問題，分析問題，解決問題的能力。

三、討論和思考

實驗結(jié)束后，需討論、思考以下幾個問題：

問題一：常見的ECL試劑有哪些？為什么選擇L012作為成像試劑？

通過調(diào)研國內(nèi)外文獻，學生發(fā)現(xiàn)大多數(shù)ECL實驗利用的是含有共反應(yīng)劑ECL體系。該體系反應(yīng)過程涉及到電生物質(zhì)的產(chǎn)生、均相化學反應(yīng)的發(fā)生、激發(fā)態(tài)的形成以及激發(fā)態(tài)衰減時的光輻射等。其中，以三聯(lián)吡啶釕-三丙胺和魯米諾-過氧化氫的ECL體系最為經(jīng)典。近十年來，以量子點、類石墨相氮化碳和鈣鈦礦材料為代表ECL體系也得到了很大發(fā)展。L012是魯米諾的衍生物，具有魯米諾相似的發(fā)光特性，但其發(fā)光強度是魯米諾的100倍，且L012的生物毒性較低，有利于生物酶催化活性的保持，所以本實驗選擇L012作為成像試劑。

問題二：H2SO4和Na3Au(SO3)2的化學反應(yīng)方程式可能是什么？

Na3Au(SO3)2是非氰化學鍍領(lǐng)域的重要金源，學生通過分析試劑商提供的《化學品安全技術(shù)說明書》，得知Na3Au(SO3)2在強酸溶液中容易生成SO2和單質(zhì)金。所以可能的化學反應(yīng)為：2[Au(SO3)2]3-+4H+==2Au+3SO2+SO42-+2H2O

問題三：金球在成像過程中起到什么作用？

學生對這一問題進行分組討論，他們歸納了各種尺寸的金球的合成方法。根據(jù)文獻得知，納米級的金球比較常見，但大小普遍在100nm以下；大尺寸金球比較難以合成，微米級金球更是少見。由于本實驗是光學顯微成像，阿貝衍射極限要求金球的尺寸必須在200nm以上，而想獲得空間可分辨的成像效果，學生們選擇合成微米級金球。由于PLD和COD含有巰基，很容易形成Au-S鍵，使生物酶負載到金球上，這樣金球就成為ECL反應(yīng)的場所。

問題四：如何提高ECL強度？

增敏ECL的方法很多，和老師交流之后，學生了解到可以考慮電極表面“內(nèi)殼層”和“外殼層”催化的兩種形式。對于魯米諾-過氧化氫體系而言，重點是提高反應(yīng)過程中活性氧的產(chǎn)量，可以使用二茂鐵這樣的電生催化劑，也可以使用血紅素、碳納米管這樣的可以修飾到電極表面的催化劑。

問題五：如果不采用大量金球的平均ECL強度，而是使用單個金球的ECL強度作為檢測信號，對檢測結(jié)果將會產(chǎn)生什么樣的影響？

學生在明場和ECL場中考察了200個金球的成像情況，10個和20個金球的平均ECL強度相對較大，30個，50個，100個和200個金球的平均ECL強度十分相近，相對標準偏差低于10%。如果只收集單個金球的ECL信號，異質(zhì)性使得規(guī)律性不明顯，低濃度PdtCho的ECL強度有可能小于、等于甚至大于高濃度PdtCho的ECL強度。依靠單個金球建立準確的線性關(guān)系是非常困難的。

四、教學探討

開放實驗要求學生掌握和了解相關(guān)專業(yè)知識，理論與實踐相結(jié)合，拓寬學生的視野。適當增加實驗的難度，一方面增加學生對科研的興趣，另一方面讓學生深入?yún)⑴c探索求知的過程，積極發(fā)揮主觀能動性和創(chuàng)造力。

該實驗中，學生將機械視覺和材料科學相結(jié)合，借助于機器視覺對材料的發(fā)光情況進行分析，學生對一些現(xiàn)象進行歸納總結(jié)，建立起對磷脂酰膽堿的檢測的新方法。

但在開放實驗過程中，也存在一些問題：

第一，機器視覺檢測是分析化學中新興的檢測手段，大學教材中并未涉及，大學生缺乏對一些前沿的專業(yè)知識的了解。大學生調(diào)研文獻存在一定的盲目性，在設(shè)計實驗方案時，創(chuàng)新性明顯，但可行性較差。

第二，大多數(shù)學生的實驗記錄不夠規(guī)范，有些重要的實驗細節(jié)被忽略，在分析問題時缺乏可參考的實驗數(shù)據(jù)。

第三，在操作過程中，有些學生缺乏耐性，急于求成，獲得的實驗結(jié)果不理想。使用儀器時，對儀器的保護意識淡薄，存在超限使用的問題。

第四、機器視覺檢測的化學原理基本明確，但相關(guān)的視覺軟件代碼編寫存在困難，需要加強計算機相關(guān)技能學習，實現(xiàn)多學科知識的綜合應(yīng)用。

因此，在日后實驗過程中，指導(dǎo)老師應(yīng)當加強對專業(yè)性較強的理論知識的講授，引導(dǎo)學生關(guān)注前沿課題，抓住關(guān)鍵問題，設(shè)計出既有理論支持，又切合實際的實驗方案。發(fā)現(xiàn)問題，分析問題，解決問題是一個連貫性過程，實驗過程中每一個細節(jié)都有可能影響問題的分析與解決。因此，有必要要求學生認真做好實驗記錄，指導(dǎo)老師也要定時檢查學生的實驗數(shù)據(jù)，及時幫助學生分析問題，參與相關(guān)討論。分析化學講究的是“慢工出細活”，浮躁的情緒往往會影響實驗結(jié)果，學生在實驗過程中應(yīng)該懂得自我調(diào)整，加強科研素質(zhì)的培養(yǎng)。