棘孢曲霉液體發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶培養(yǎng)基的優(yōu)化

張玉千 周學(xué) 夏文靜 鄭丹 許曉風(fēng)

摘要：以棘孢曲霉為生產(chǎn)菌株進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分。采用單因素法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、碳氮比、磷酸鹽的含量及吐溫-80的濃度進(jìn)行初步探索，借助正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)法確定棘孢曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最優(yōu)培養(yǎng)基組成。結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到最優(yōu)的培養(yǎng)基成分為2%蔗糖、0.16%尿素、碳氮比為30 ∶1、0.2% KH2PO4、0.125%吐溫-80。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，β-葡萄糖苷酶的酶活力達(dá)到29.23 U/mL，是初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基產(chǎn)酶活力的8.21倍。通過對(duì)培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，大幅度提高了β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量，為β-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)提供了新的菌株，為提高槐角異黃酮的轉(zhuǎn)化研究提供了新的途徑及數(shù)據(jù)參考。

關(guān)鍵詞：棘孢曲霉;β-葡萄糖苷酶;培養(yǎng)基優(yōu)化;正交試驗(yàn);單因素試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）11-0208-05

收稿日期：2020-09-23

基金項(xiàng)目：江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃一般項(xiàng)目（編號(hào)：201913843026Y）;南京師范大學(xué)高等教育改革研究課題（編號(hào)：2018JG07042、2019JG09001）。

作者簡(jiǎn)介：張玉千（1985—），男，山東濟(jì)寧人，碩士研究生，講師，主要從事天然產(chǎn)物的分離純化及微生物轉(zhuǎn)化研究。E-mail：zqwl2000@163.com。

通信作者：許曉風(fēng)，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物保護(hù)、分子遺傳與分子生態(tài)方面的研究。E-mail：xuxiaofeng@njnu.edu.cn。

棘孢曲霉是曲霉屬真菌，具有球形或橢圓形的頂囊，分生孢子為淡褐色球狀，表面有刺突[1]。棘孢曲霉在自然界中分布廣泛，常見于糧食、植物和土壤中。棘孢曲霉具有豐富的酶系，可分泌淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、葡萄糖氧化酶、檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等產(chǎn)物，是一種重要的工業(yè)發(fā)酵微生物，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)工業(yè)酶制劑、產(chǎn)品發(fā)酵等方面[2-3]。

目前，關(guān)于棘孢曲霉的研究主要集中在產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，尤其是產(chǎn)果膠酶和柚苷酶的研究。何海燕等從蠶沙堆積地土壤中篩選出產(chǎn)果膠酶的優(yōu)良菌株，經(jīng)過微波誘變得到穩(wěn)定菌株，所產(chǎn)酶活性可達(dá)10.17 U/mL[4]。王聳等以柚皮為原料優(yōu)化棘孢曲霉產(chǎn)柚苷酶的固體發(fā)酵條件，產(chǎn)酶量提高了7.38倍[5]。據(jù)報(bào)道，棘孢曲霉所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶活性較強(qiáng)，在微生物轉(zhuǎn)化中尤其是對(duì)苷類物質(zhì)糖苷鍵的水解反應(yīng)中效果較好。Treebupachatsakul等發(fā)現(xiàn)棘孢曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶可以將糖轉(zhuǎn)化為乙醇，為工業(yè)生物乙醇的生產(chǎn)提供較好的途徑[6]。馬迎迎等發(fā)現(xiàn)，棘孢曲霉可以將甜菊糖苷轉(zhuǎn)化為甜菊醇，為甜菊醇的制備提供一種新的方法[7]。試驗(yàn)組在槐角黃酮苷的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)現(xiàn)，棘孢曲霉可以將染料木苷、槐角苷轉(zhuǎn)化為5，7，8，4′-四羥基異黃酮[8-9]，后者是一種高效的酪氨酸酶抑制劑[10-11]，在醫(yī)藥、美容、食品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[12]。在棘孢曲霉轉(zhuǎn)化槐角黃酮苷的過程中，β-葡萄糖苷酶是關(guān)鍵酶，提高該酶的產(chǎn)量可以增加產(chǎn)物得率。本試驗(yàn)在國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵研究，通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分提高β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

試驗(yàn)菌種為棘孢曲霉，筆者所在實(shí)驗(yàn)室篩選鑒定，菌種保藏號(hào)為CCTCC NO：M2011264。

斜面培養(yǎng)基（20%土豆、2%葡萄糖、2%瓊脂、pH值自然）、種子培養(yǎng)基[1% （NH4）2SO4、0.5% KH2PO4、0.1% MgSO4、6%葡萄糖]、發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基[2%蔗糖、0.16% （NH4）2SO4、0.2% KH2PO4、0.02% MgSO4、0.001% FeSO4·7H2O、0.05%吐溫-80、 pH值自然]。

水楊苷（湖北帝柏化工有限公司）、無水乙醇，苯酚亞硫酸氫鈉、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、冰醋酸、無水乙酸鈉均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上海有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

試驗(yàn)主要儀器有ZHJH-C1214B超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造有限公司）、MLS-3780高壓蒸汽滅菌器[致微（廈門）儀器有限公司]、FA2204電子分析天平（上海方瑞儀器有限公司）、HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱（太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）、WFZ UV-2000紫外可見分光光度計(jì)[尤尼柯（上海）儀器有限公司]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及發(fā)酵培養(yǎng)

將4 ℃保藏的菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，用無菌水沖洗斜面孢子，做成1×108 CFU/mL的孢子懸液，充分振蕩30 min。按10%接種量接入到100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃ 150 r/min搖床培養(yǎng)72 h。

取發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，取上清加無水乙醇，使乙醇濃度為70%～75%，放于4 ℃冰箱中沉淀過夜。10 000 r/min離心15 min，沉淀用0.2 mol/L pH值為4.6的乙酸-乙酸鈉的緩沖液重新溶解，即得酶液，測(cè)定酶活力。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.1.1 碳源的優(yōu)化

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中去掉碳源，分別加入2%的葡萄糖、蔗糖、麩皮、稻糠、玉米粉、麩皮+稻糠（1 ∶1）、麩皮+玉米粉（1 ∶1）作為唯一碳源，其他成分保持不變，配制液體培養(yǎng)基各100 mL，裝入250 mL錐形瓶中，滅菌，按10%接種量加孢子懸液，30 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)72 h，按“1.2.1”節(jié)方法提取酶液，測(cè)酶活力。

1.2.1.2 氮源的優(yōu)化

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中去掉氮源，分別以0.16%的硫酸銨（無機(jī)氮源）、酵母浸膏、豆粕粉、蛋白胨、尿素為氮源，其他成分保持不變，配制液體培養(yǎng)基各100 mL，裝入250 mL錐形瓶中，滅菌，按10%接種量加孢子懸液，30 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)72 h，按“1.2.1”節(jié)方法提取酶液，測(cè)酶活力。

1.2.1.3 碳氮比的優(yōu)化

以蔗糖為碳源，硫酸銨為氮源，控制碳氮比分別為5 ∶1、10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1，其他成分和發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基一致，配制液體培養(yǎng)基各100 mL，裝入250 mL錐形瓶中，滅菌，按10%接種量加孢子懸液，30 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)72 h，按“1.2.1”節(jié)方法提取酶液，測(cè)酶活力。

1.2.1.4 磷酸鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響

去除發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的磷酸鹽，分別加入KH2PO4，使質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，其他成分保持不變，配制液體培養(yǎng)基各100 mL，裝入250 mL錐形瓶中，滅菌，按10%接種量加孢子懸液，30 ℃，150 r/min 搖床培養(yǎng)72 h，按“1.2.1”節(jié)方法提取酶液，測(cè)酶活力。

1.2.1.5 吐溫-80對(duì)產(chǎn)酶的影響

去除發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的吐溫-80，分別加入吐溫-80，使質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.050%、0.075%、0.100%、0.125%、0.150%，其他成分保持不變，配制液體培養(yǎng)基各100 mL，裝入250 mL錐形瓶中，滅菌，按10%接種量加孢子懸液，30 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)72 h，按“1.2.1”節(jié)方法提取酶液，測(cè)酶活力。

1.2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定接種量為10%，裝液量為100 mL，選擇碳源、氮源、磷酸鹽用量、吐溫-80質(zhì)量分?jǐn)?shù)4個(gè)因素，按照表1所示的因素水平設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)組合，按照“1.2.1”節(jié)的方法進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)酶活力。

1.2.4 酶活力測(cè)定方法

根據(jù)文獻(xiàn)[13]的方法，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定β-葡萄糖苷酶酶活：取0.2 mL水楊苷加0.2 mL酶液，在60 ℃ 的水浴鍋里加熱10 min，取出，向反應(yīng)液里加入1 mL DNS試劑，放入沸水中加熱5 min，冷卻，定容至10 mL，540 nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

酶單位定義（U/mL）：在60 ℃、pH值=4.6的條件下，每1 mL酶液1 min水解底物產(chǎn)生1 μmol還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

葡萄糖苷酶活力單位（U/mL）=1 000×N×（D540 nm+0.012 8）/（180×0.816 9×0.2），N表示稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

碳源為微生物新陳代謝提供所需的能源和合成產(chǎn)物的碳骨架，是微生物正常生長(zhǎng)分裂的物質(zhì)基礎(chǔ)。碳源過多，在發(fā)酵過程中容易形成較低的pH值;碳源不足，容易使菌體過快衰老和自溶，不同的微生物所需要的碳源種類不同，需要通過試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)選用葡萄糖、蔗糖、麩皮、玉米粉、稻糠、麩皮+玉米粉（1 ∶1）、麩皮+稻糠（1 ∶1）等農(nóng)副產(chǎn)品為碳源進(jìn)行研究。由圖1可知，蔗糖作為碳源時(shí)，最有利于產(chǎn)酶，酶活力最高為12.09 U/mL，其次是葡萄糖和玉米粉。蔗糖作為碳源時(shí)，分解率等于利用率，沒有葡萄糖的積累，可以避免葡萄糖對(duì)β-葡萄糖苷酶的抑制作用。葡萄糖的效果僅次于蔗糖，可能是該菌體已經(jīng)部分解除了葡萄糖的抑制。以麩皮、稻糠及其組合為碳源的β-葡萄糖苷酶酶活力較低，說明在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)中，可溶性碳源容易被菌體吸收利用，見效較快。

2.2 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

氮源對(duì)微生物的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要意義，微生物利用它在細(xì)胞內(nèi)合成氨基酸和堿基，進(jìn)而合成蛋白質(zhì)、核酸等細(xì)胞成分[14]。氮源過多，會(huì)使菌體生長(zhǎng)過于旺盛，體系pH值偏高，不利于代謝產(chǎn)物的積累;氮源不足，則菌體繁殖量少，生物量少，產(chǎn)物的生產(chǎn)量減少。分別以尿素、硫酸銨（無機(jī)氮源）、蛋白胨、酵母浸膏、豆粕粉為氮源進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶。由圖2可知，在以硫酸銨為氮源時(shí)，測(cè)得的酶活力最高，為12.88 U/mL，因此優(yōu)選硫酸銨為氮源。

2.3 碳氮比對(duì)產(chǎn)酶的影響

碳氮比不當(dāng)會(huì)影響菌體按比例吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，直接影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成。碳氮比過高和過低均不利于細(xì)胞生長(zhǎng)和外源蛋白表達(dá)與積累，過低導(dǎo)致菌體提早自溶;過高導(dǎo)致細(xì)菌代謝不平衡，最終不利于產(chǎn)物的積累。一般碳源因?yàn)榧茸魈技苡肿髂茉?，因此用量要比氮多。由圖3可知，碳氮比為30 ∶1 時(shí)酶活力最高，為11.55 U/mL，因此優(yōu)選碳氮比為30 ∶1。

2.4 磷酸鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響

鉀和磷都是微生物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)素，培養(yǎng)基中的KH2PO4既能提供氮磷元素又可以緩沖發(fā)酵液的pH值，保持微生物生長(zhǎng)所需的酸堿度。本試驗(yàn)將KH2PO4濃度分別設(shè)為0.1% 、0.2% 、0.3% 、0.4% 、0.5%，結(jié)果如圖4所示，0.2%和0.3%這2個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的酶活力較高，當(dāng)磷酸鹽濃度為0.2%時(shí)，測(cè)得最大酶活力為12.55 U/mL。因此KH2PO4的濃度選擇0.2%。

2.5 吐溫-80對(duì)產(chǎn)酶的影響

吐溫-80為非離子型表面活性劑，可以增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，能促進(jìn)胞外酶的分泌，但濃度太大也會(huì)影響培養(yǎng)基中的溶氧，進(jìn)而影響菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。試驗(yàn)考查了不同吐溫-80濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響，由圖5可知，控制的碳氮源分別是蔗糖和硫酸銨，當(dāng)吐溫-80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.100%時(shí)，測(cè)得的酶活最大，為11.49 U/mL。

2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過表2對(duì)比4種因素對(duì)棘孢曲霉產(chǎn)酶的影響，結(jié)果表明RA>RC>RB>RD，碳源種類對(duì)棘孢曲霉產(chǎn)酶的影響最大，其次是磷酸鹽濃度、氮源，影響最小的是吐溫-80的濃度。通過比較k值，得到最優(yōu)水平為A2B1C2D3，即2%蔗糖、0.16%尿素、0.2%KH2PO4、0.125%吐溫-80。

2.7 重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)

為確定正交試驗(yàn)結(jié)果的優(yōu)劣及穩(wěn)定性，利用最優(yōu)培養(yǎng)基組分進(jìn)行3批重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，平均酶活力為29.23 U/mL，均高于正交試驗(yàn)表中的9個(gè)試驗(yàn)中的酶活力，相當(dāng)于初始培養(yǎng)基酶活力（3.56 U/mL）的8.21倍。因此，確定A2B1C2D3為最優(yōu)組合且具有一定的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論與討論

以前期篩選的棘孢曲霉為出發(fā)菌株，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化棘孢曲霉液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組分。結(jié)果表明，碳源、氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響最大，優(yōu)化得到的液態(tài)培養(yǎng)基的組分為2%蔗糖、0.16%尿素、0.2%KH2PO4、0.125%吐溫-80。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，β-葡萄糖苷酶活力為29.23 U/mL，是基礎(chǔ)初始培養(yǎng)基的酶活的8.21倍。

β-葡萄糖苷酶廣泛存在于植物、動(dòng)物、微生物中，其中來源于微生物的酶活性較高，研究報(bào)道較多。β-葡萄糖苷酶可水解β-D-糖苷鍵，解除纖維二糖對(duì)纖維素酶的抑制，在纖維素水解的過程中是關(guān)鍵的一步[15-17]，目前在生物能源、食品工程、過程轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[18]。在產(chǎn)纖維素酶的菌株中，β-葡萄糖苷酶含量普遍較低。但黑曲霉除外，目前工業(yè)中也主要利用黑曲霉生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，通過培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件的優(yōu)化及誘變育種等方法提高β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量[15]。棘孢曲霉可分泌淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、柚苷酶、鼠李糖苷酶等多種酶[2，4，19-20]，其中柚苷酶的研究較多，β-葡萄糖苷酶的研究較少。棘孢曲霉經(jīng)過優(yōu)化后β-葡萄糖苷酶的酶活力有了明顯提高，從而為β-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)提供了新的菌株。

槐角是一種常用的中藥材，富含黃酮異黃酮類化合物[21]，利用微生物的甲基化、羥基化、甲氧基化、水解等反應(yīng)可以提高活性成分的含量、獲得高附加值的代謝產(chǎn)物[22]。Wu等利用Schizophyllum commune轉(zhuǎn)化槐角苷得到羥基化、甲基化等多種有價(jià)值代謝產(chǎn)物[23]?；苯侵械娜玖夏拒蘸枯^高，但生物活性沒有苷元染料木素的活性高。Chang等以槐角粉末為原料利用黑曲霉和酵母聯(lián)合發(fā)酵培養(yǎng)，使染料木素的含量增加了34.45倍[20，24]。劉姜華利用米根霉LJH3將槐角苷轉(zhuǎn)化成染料木素，轉(zhuǎn)化率達(dá)80.2%[25]。在棘孢曲霉轉(zhuǎn)化槐角的過程中，β-葡萄糖苷酶水解染料木苷分子中的糖苷鍵生成染料木素和葡萄糖，染料木素又被細(xì)胞色素P450酶羥基化形成5，7，8，4′-四羥基異黃酮[8，26]。通過優(yōu)化棘孢曲霉產(chǎn)酶培養(yǎng)基提高酶活力，可提高染料木苷的轉(zhuǎn)化效率，最終提高5，7，8，4′-四羥基異黃酮的收率。

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