太芪培元顆粒對(duì)免疫低下小鼠T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞計(jì)數(shù)及巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響研究?

曾 琳， 馬秀蘭△， 馬建萍， 李靜茹， 張 穎， 艾合買提·阿布都熱依木

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院艾滋病研究室， 烏魯木齊 830000；2.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830000)

艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)，是一種由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的、以全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害為特征的傳染性疾病。太芪培元顆粒是新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)制劑，用于治療氣陰兩虛、肺腎不足型的艾滋病患者。該藥物自2008年起開始在臨床應(yīng)用，通過臨床療效觀察，該方可以明顯改善患者癥狀體征，提升部分患者的CD4+T細(xì)胞水平，提高生存質(zhì)量[1-5]。觀察太芪培元顆粒對(duì)免疫低下小鼠外周血T細(xì)胞亞群含量、自然殺傷細(xì)胞(NK)計(jì)數(shù)及巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響，初步探索該藥可能的作用機(jī)制。本研究已獲新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)2018-0013-01。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠120只，每只18～22 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(新)2018-0003。飼養(yǎng)期間室內(nèi)溫度22 ℃，濕度58%～70%之間，喂飼輻照滅菌BALB/c小鼠飼料，給藥前禁食12 h，自由飲水。

1.2 藥物制備

太芪培元顆粒用水煎、醇沉等現(xiàn)代工藝和方法制成浸膏，由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑室提供；黃芪顆粒(4 g×12袋，四川百利天恒藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20003380)；環(huán)磷酰胺(0.2 g×10瓶，山西普德藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H14023686)。

1.3 試劑與儀器

甲醇-丙酮固定液(1∶1，批號(hào)G2155)，索萊寶公司；吉姆薩染液(10×原液，批號(hào)G1015)，索萊寶公司；紅細(xì)胞裂解緩沖液(RBC Lysis Buffer)(1×)、溶血素,eBioscience公司；PE anti-mouse CD49b,pan-NK cells公司；FITC anti-mouse CD3、PerCP anti-mouse CD8a、APC anti-mouse CD4，biolegend公司。

LC-4016低速大容量離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；BriCyte E6流式細(xì)胞儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；Axio Observer A1熒光倒置顯微鏡(德國蔡司公司)；BSC-150恒溫恒濕箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；XS-800i全自動(dòng)血液分析儀(日本 Sysmex 公司)。

1.4 動(dòng)物模型建立

雄性實(shí)驗(yàn)小鼠120只，動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。其中20只小鼠正常飼養(yǎng)為對(duì)照組；其余100只小鼠均采用每只每天腹腔注射25 mg環(huán)磷酰胺注射液進(jìn)行造模；連續(xù)腹腔注射7 d后，隨機(jī)取空白對(duì)照和模型對(duì)照各10只，測血常規(guī)、脾臟和胸腺指數(shù)，以檢測造模成功與否。在灌服藥物期間，每周小鼠腹腔注射一次20 mg環(huán)磷酰胺注射液，以維持免疫低下狀態(tài)。

1.5 分組與給藥

將造模成功的90只小鼠隨機(jī)分為模型組、黃芪顆粒組、太芪培元顆粒高劑量組、太芪培元顆粒中劑量組、太芪培元顆粒低劑量組5組各18只。按照“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人按體表面積比等效劑量換算比率表”[6]，計(jì)算小鼠每日給藥劑量。依據(jù)人體質(zhì)量(60 kg)與實(shí)驗(yàn)小白鼠體表面積比換算和設(shè)定為小鼠的太芪培元顆粒中劑量。造模成功后開始給藥，具體給藥方式為：正常組、模型組小鼠給予等量生理鹽水進(jìn)行灌胃；中藥對(duì)照組黃芪顆粒用雙蒸水配成溶液，使用13.3 mg·kg-1·d-1水溶液進(jìn)行灌胃；藥物干預(yù)高、中、低劑量組大鼠給予太芪培元顆粒水煎液灌胃，劑量分別為33.26、16.63、8.32 g·kg-1·d-1，每日灌胃1次，連續(xù)28 d。

1.6 血常規(guī)檢測

隨機(jī)選取各組小鼠6只，使用l%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為40 mg/kg；采用眼球摘除法分別收集50 μL血液置EDTA抗凝采血管中進(jìn)行血常規(guī)檢測。

1.7 胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)檢測方法

隨機(jī)選取各組小鼠8只與流式細(xì)胞一起取材，暨收集外周血后處死小鼠立即稱體質(zhì)量、胸腺和脾臟質(zhì)量，計(jì)算如下指標(biāo)。胸腺系數(shù)=小鼠胸腺質(zhì)量 (mg)/小鼠體質(zhì)量 (g)，脾臟系數(shù)=小鼠脾臟質(zhì)量 (mg)/小鼠體質(zhì)量 (g) 。

1.8 流式細(xì)胞測定外周血T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞

隨機(jī)選取各組小鼠8只，使用l%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為40 mg/kg；采用眼球摘除法分別收集外周血50 μl置含EDTA抗凝采血管中，輕柔顛倒搖勻；每個(gè)流式檢測管分別加入100 μl全血標(biāo)本，加入相應(yīng)的流式抗體，避光孵育30 min，每管分別加入1 ml紅細(xì)胞裂解液顛倒混勻，室溫避光孵育5 min，1200 r/min低速離心5 min棄去上清；2 ml PBS緩沖液洗滌細(xì)胞1次，1200 r/min低速離心5 min，500 μl PBS緩沖液重懸細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞測定。

1.9 巨噬細(xì)胞吞噬能力測定

隨機(jī)選取各組小鼠4只，無菌注射器吸取3%硫代乙醇酸鈉3 ml，注射于小鼠腹腔內(nèi)；4 d后分別給各組小鼠腹腔注射1 ml 1%羊紅細(xì)胞懸液；1 h后頸椎脫臼法將小鼠處死，解剖暴露腹腔，于腹腔靠上部位用鑷子輕輕夾起腹膜，將腹膜剪一小口，用尖吸管注入5 ml預(yù)溫的PBS，同時(shí)反復(fù)揉搓腹腔約1～2 min，以便盡可能多地沖洗出小鼠腹腔的吞噬細(xì)胞。用尖吸管吸取腹腔液，置一潔凈試管內(nèi)吹打均勻；干凈的載玻片上滴加一滴生理鹽水，向其中滴加一滴腹腔液，37 ℃恒溫恒濕箱中孵育60 min；孵育完成后取出玻片，吸去液體；用1∶1丙酮、甲醇溶液固定5 min后，4%吉姆薩染液染3 min，清水沖洗晾干后顯微鏡觀察、拍照。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般情況

空白組大鼠未見異常, 體質(zhì)量逐日增加, 攝食量、飲水量增加，毛色有光澤。造模后第4天，造模小鼠均出現(xiàn)毛色發(fā)暗、脫毛、喜臥等現(xiàn)象，各給藥組在服藥后1周后一般情況均較模型組有所好轉(zhuǎn)。

2.2 各組小鼠血常規(guī)、脾臟和胸腺指數(shù)比較

表1示，與空白組比較，模型組淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；太芪培元顆粒各劑量組、黃芪顆粒組白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；太芪培元顆粒中劑量組與高劑量組淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明各治療組及黃芪顆粒組均有升高白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞的作用，與黃芪顆粒組比較，太芪培元顆粒高劑量組升高中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞更明顯。

表1 血常規(guī)、脾臟和胸腺指數(shù)比較

2.3 外周血T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

表2圖1示，外周血T細(xì)胞亞群結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組NK細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。太芪培元顆粒高劑量組CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)較模型組低，CD4+/CD8+比值顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表2圖2、3示，NK細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，各治療組NK細(xì)胞比例顯著高于模型組(P<0.05)，說明各治療組均有提高NK細(xì)胞的作用，與黃芪顆粒組比較，太芪培元顆粒高劑量組NK細(xì)胞升高更加明顯，而且能夠降低CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、升高CD4+/CD8+比值。

表2 各組間流式結(jié)果比較分析

圖1 外周血CD4+/CD8+ T細(xì)胞比例

圖2 NK細(xì)胞計(jì)數(shù)比例

圖3 (CD3-CD49+)NK細(xì)胞流式檢測圖

2.4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能測定

圖4示，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力檢測結(jié)果示，各組之間巨噬細(xì)胞吞噬能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能比較

3 討論

HIV病毒本身并不會(huì)引發(fā)任何疾病，而是將人體免疫系統(tǒng)中最重要的T細(xì)胞作為攻擊目標(biāo)，對(duì)其大量破壞，最終使免疫系統(tǒng)崩潰，使人體因喪失對(duì)各種疾病的抵抗力而發(fā)病。本研究采用環(huán)磷酰胺腹腔注射，也是造成小鼠免疫系統(tǒng)的破壞，并且在試驗(yàn)過程中維持給藥，造成免疫系統(tǒng)持續(xù)損害狀態(tài)，是目前公認(rèn)、合理、方便易行的免疫抑制小鼠造模方式。

T細(xì)胞表面CD4分子是HIV感染的天然受體，也是HIV攻擊的最主要靶細(xì)胞。HIV感染不僅造成外周血CD4+T細(xì)胞數(shù)量減少,并且導(dǎo)致其功能障礙,是HIV/AIDS的主要改變之一[7]。CD8+為抑制性T淋巴細(xì)胞 (Ts),其含量越高免疫抑制越強(qiáng), 機(jī)體的抵抗力越弱[15]。CD8+T細(xì)胞不僅在自然老化過程中累積增加，在無臨床癥狀的HIV成年人體內(nèi)顯著增加。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，除了T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞也經(jīng)歷了功能性極化。巨噬細(xì)胞對(duì)病毒的細(xì)胞毒性作用耐受能力很強(qiáng)[8-10]，因其在HIV-1感染中可以長久地存活并釋放病毒，成為重要的儲(chǔ)存庫部位。NK細(xì)胞是一類固有免疫細(xì)胞[11]，研究表明，NK細(xì)胞具有免疫清除作用，即細(xì)胞毒作用、誘導(dǎo)凋亡作用和抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用；同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)作用，NK細(xì)胞可通過識(shí)別和殺傷能夠逃避細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷作用的腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞,主要通過釋放干擾素、穿孔素、顆粒酶、補(bǔ)充細(xì)胞毒性T細(xì)胞等產(chǎn)生直接的細(xì)胞殺傷作用[12]。HIV感染后NK細(xì)胞與疾病進(jìn)展相關(guān)，HAART可部分恢復(fù)NK細(xì)胞，治療前NK細(xì)胞水平與HAART免疫應(yīng)答相關(guān)[13]。最近對(duì)猴免疫缺陷病毒感染的獼猴和 HIV 感染者的研究發(fā)現(xiàn)，存在B細(xì)胞濾泡中的NK細(xì)胞可抑制病毒復(fù)制、清除儲(chǔ)存庫，為病毒儲(chǔ)存庫的清除提供新的研究方向。隨著對(duì) NK 細(xì)胞研究的深入，其在HIV感染中發(fā)揮的作用也越來越受到重視。

太芪培元方即平艾合劑1號(hào)方，主要用于治療艾滋病證屬氣陰兩虛、肺腎不足者，臨床表現(xiàn)為低熱或五心煩熱或夜間潮熱、盜汗或自汗、乏力氣短等。方中以太子參、生地為君藥。太子參味甘微苦，歸脾、肺經(jīng)，補(bǔ)氣生津；生地味甘、苦、性寒，歸心、肝、肺經(jīng)，具有養(yǎng)陰生津、清熱涼血作用，兩藥重用共奏益氣養(yǎng)陰之功。該方為新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，臨床觀察發(fā)現(xiàn)，該藥物可以明顯改善患者的臨床癥狀，提高部分患者的CD4+T細(xì)胞水平和生存質(zhì)量[1-5]。但是體外試驗(yàn)顯示，該藥物體外抗HIV-1病毒的作用不明顯[14]。黃芪含多種有益成分，研究證實(shí)黃芪多糖類和黃芪皂苷類物質(zhì)具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用，改善生存質(zhì)量具有較好作用[15]，因此將黃芪顆粒選為陽性對(duì)照組。

本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，太芪培元顆粒能夠提高NK細(xì)胞數(shù)量及CD4+/CD8+比值，降低CD8+數(shù)量，提升白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量，且太芪培元顆粒高劑量組改善免疫及提升血常規(guī)含量明顯優(yōu)于其他各組。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力測定雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從圖片可以看出，太芪培元顆粒高劑量組對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的現(xiàn)象要高于空白組?；诖?，該藥物對(duì)提高免疫功能的改變，可能為通過抑制CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)及增加NK細(xì)胞數(shù)量而實(shí)現(xiàn)，但是相關(guān)影響機(jī)制仍需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究進(jìn)行論證。