針藥結(jié)合對腦卒中肢體痙攣大鼠大腦皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa受體表達的影響?

劉未艾， 岳增輝， 謝志強， 謝莉娜， 郭 斌， 王彭漢， 黃麟荇

(1.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院， 長沙 410005；2.湖南中醫(yī)藥大學， 長沙 410208；3.郴州市第一人民醫(yī)院， 湖南 郴州 423000；4.長沙市第三醫(yī)院， 長沙 410000)

肢體痙攣在腦血管病中的發(fā)生率高達80%[1]，嚴重影響偏癱肢體的功能康復。如何有效地預防和緩解肢體痙攣，是提高卒中患者生活質(zhì)量迫切需要解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF) 通過與其高親和力的酪氨酸蛋白激酶受體B(tyrosine kinase receptor b，TrkB)結(jié)合可促進γ-基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)的釋放表達，而外源性BDNF增加了GABA能中間神經(jīng)元的興奮性。GABA與GABAa受體在突觸后膜相結(jié)合后，可抑制過度神經(jīng)元放電，從而防止痙攣的發(fā)生[2]。目前針藥結(jié)合療法是臨床治療腦卒中后肢體痙攣狀態(tài)的有效手段。課題組在前期臨床研究中證實，經(jīng)筋刺法結(jié)合加味芍藥甘草湯能更好地緩解腦卒中后偏癱患者的肌張力，改善其運動功能，提高生活自理能力[3]。本實驗擬進一步探討電針結(jié)合加味芍藥甘草湯改善腦卒中后肢體痙攣狀態(tài)可能的作用機制，為臨床篩選有效的治療方案提供客觀的實驗依據(jù)。本研究已通過湖南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查，倫理審查編號LLBH-20171103。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

SPF級健康SD大鼠，月齡3～4個月，體質(zhì)量240～280 g，實驗動物合格證號SCXK(湘)2016-0002，由湖南斯萊克景達動物實驗有限公司提供。普通飼料投喂，室溫20～25 ℃，相對濕度50%～70%，自然光照，自由進食飲水。動物適應性喂養(yǎng)1周后編號，通過2次隨機篩選出的63只SD大鼠分為空白組、假手術組、模型組、電針組、中藥組、針藥組和西藥組共7組各9只。

1.2 藥物及其制備

加味芍藥甘草湯水煎劑組成：白芍30 g，甘草10 g，炙黃芪30 g，當歸15 g，川芎15 g，地龍10 g，雞血藤15 g，木瓜10 g，桑枝30 g，伸筋草10 g，山茱萸10 g，枸杞子10 g，中藥飲片購自湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院中藥房，按比例配方取藥，煎汁將藥物濃縮至含生藥10 g/ml，置 4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩０吐确宜芤褐谱鳎簩吐确移?福安藥業(yè)集團寧波天衡制藥有限公司，批號 180503C01，10 mg/片)研成細粉末，溶于蒸餾水中，配制成為0.27 mg/ml溶液的備用。

1.3 主要試劑及儀器

NMDA受體(M3262)，美國 Sigma 公司；Rabbit GABAa抗體(BioswampBioswamp，武漢貝茵萊生物科技有限公司，bs-1232 R)；Rabbit BDNF抗體(ab108319)，英國abcam公司；Rabbit TrkB抗體(ab18987)，英國abcam公司。

大鼠腦立體定位儀(SN-2型號，日本成茂公司)；牙科鉆(MF4G型號，南京金恒川電子有限公司)；微量注射器(5 μl，上海科曉科學儀器有限公司)；熒光定量 PCR 儀(CFX-Connect96型號，美國 Bio-Rad 公司)；PCR 儀(GE48527型號，杭州柏恒科技有限公司)；電泳儀(miniprotean3cell 型號，美國Bio-Rad 公司)；全自動化學發(fā)光分析儀(Tanon-5200型號，上海天能科技有限公司)；電針儀(SDZ-V，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)及華佗牌針灸針(0.30×13 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。

1.4 模型制備

采用改良Zea Longa線栓法+內(nèi)囊注射NMDA受體法制作腦卒中肢體痙攣大鼠模型[4]。麻醉后，大鼠仰臥固定在手術臺上，備皮消毒鋪巾；沿頸部正中偏右切口，暴露并鈍性分離大鼠右側(cè)頸總動脈和迷走神經(jīng)，依次向上暴露頸總動脈分叉處、頸內(nèi)動脈與頸外動脈；分別在頸總動脈遠心端、頸內(nèi)動脈近心端、頸外動脈近心端備用6-0絲線，結(jié)扎、夾閉頸內(nèi)動脈；在離頸總動脈分叉膨大5 mm處剪一小切口，將栓線經(jīng)切口插入頸內(nèi)動脈，松開動脈夾。插線完畢后將頸內(nèi)動脈近心端和栓線一起結(jié)扎，逐層縫合切口；大鼠清醒后納入Zea Longa評分1～3分的大鼠第二天再行內(nèi)囊注射NMDA法[5]。麻醉后，大鼠俯臥固定于大鼠腦立體定位儀上，備皮消毒鋪巾；沿大鼠顱頂矢狀縫作縱行切口，逐層分離暴露前囟，暴露右側(cè)頂骨和額骨交界骨縫；按《大鼠立體定位圖譜》[6]確定內(nèi)囊位置，選擇前囟后 1.4 mm，矢狀縫右側(cè) 2.4 mm，定位用記號筆進行標記；用牙科鉆在標記點上鉆一直徑約2 mm小孔，將微量注射器垂直插入7 mm，緩慢注射5ulNMDA，注射時間維持5 min。完畢后拔出微量注射器壓迫止血、消毒，逐層縫合切口。術后均給予以抗感染、防止腦水腫，給予單籠飼養(yǎng)，保持呼吸道通暢。大鼠蘇醒后，Ashworth肌張力評分1分，Zea Longa評分1～3分，說明腦卒中后肢體痙攣模型成功。

1.5 分組干預方法

空白組正常飼養(yǎng)；假手術組同模型組一樣麻醉，頸部切口，但僅分離不結(jié)扎，也不插線，第2天內(nèi)囊注射生理鹽水；各治療組從造模成功后第1天起開始施以相應治療方法，每日1次，均治療5 d。在施以相應治療措施的同時，除空白組外，各組均同電針組一樣行捆綁束縛30 min，假手術組、模型組和電針組均灌服等量生理鹽水。

電針組取雙側(cè)曲池、陽陵泉。穴位定位參照郭義主編的《實驗針灸學實驗指導》，并結(jié)合解剖學方法進行大鼠穴位定位[7]。陽陵泉：距后三里(在膝關節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處)上外側(cè)5 mm，直刺6 mm。曲池：橈骨近端的關節(jié)外側(cè)前方的凹陷中，直刺4 mm。操作：將大鼠捆綁束縛于鼠板上，采用華佗牌0.30×13 mm一次性使用針灸針，75%乙醇棉簽常規(guī)消毒針刺，行針時捻轉(zhuǎn)角度在90～180°之間，頻率在60～90次/min之間，持續(xù)捻轉(zhuǎn)1 min。針后選用SDZ-V電針治療儀，密波，100Hz，導線的正極接一側(cè)刺入陽陵泉穴毫針的針柄，負極接同側(cè)刺入曲池穴毫針的針柄，以形成刺激回路，以大鼠肢體輕微抖動為度，每次30 min。中藥組給予加味芍藥甘草湯水煎劑灌胃治療，針藥組先行加味芍藥甘草湯灌服再行電針治療，西藥組給予巴氯芬水溶液灌胃治療。

1.6 行為學檢測

1.6.1 大鼠神經(jīng)功能評分測定 參照Zea longa標準進行神經(jīng)功能評分。0分為無神經(jīng)損傷癥狀；1分為不能完全伸展手術對側(cè)前爪或后爪；2分為行走時向手術對側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分為行走時向手術對側(cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。分別在造模后及治療結(jié)束后各進行評分1次。

1.6.2 大鼠肌張力評分的測定 根據(jù)改良人類Ashworth肌張力評分法[8]對大鼠綜合肌張力進行評分。0級：無肌張力增高，大鼠活動自如；1級：輕微增加，抓握中被動屈伸至最后有小的阻力；1+級：輕度增加，抓握至一半ROM以上有輕度阻力增加；2級：肌張力在大部分ROM中都有較大增加，但肢體被動運動容易；3級：肌張力明顯增高，被動活動困難；4級：受累部分肢體強直性屈曲或伸直。為便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計，將0、1、1+、2、3、4級分別記為 0、1、2、3、4、5 分，分數(shù)越高說明肌張力越差，并分別在造模后及治療結(jié)束各進行1次評分。

1.7 組織取材

大鼠行為學檢測結(jié)束后采集標本，斷頭處死大鼠，冰盤上快速剝離取出大腦皮質(zhì)放入凍存管，立即放入液氮速凍，-80 ℃保存待測。

1.8 RT-PCR 檢測大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)BDNF、TrkB、GABAa受體mRNA 表達

表1示，采用Trizol 一步法提取總 RNA，獲得 RNA 溶液，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。RNA 中 DNA 消除：37 ℃ 30 min；Hold，加 1 μL EDTA；65 ℃，10 min?？?RNA 中 DNase1 消除：將反應液加入與其等量的苯酚/氯仿/異戊醇充分混勻，適量 DEPC-H2O 溶解進行反轉(zhuǎn)錄。反應條件：42 ℃，60 min；70 ℃，15 min；16 ℃，循環(huán)；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。將制備好cDNA進行PCR擴增，反應程序：95 ℃、3 min，95 ℃、5 s，56 ℃、10 s，72 ℃、25 s，39 個循環(huán)；65 ℃、5 s，95 ℃、50 s。計算ΔCt 值，以 2-ΔΔCt分析各基因相對表達量。以β-actin 作為內(nèi)參基因，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 各基因 PCR 引物序列

1.9 Western blot 檢測大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)BDNF、TrkB、GABAa受體蛋白的表達

將組織剪成細小的碎片，每20 mg組織加150～250 μL 裂解液，勻漿直至完全裂解。裂解后4 ℃、12000×g 離心15 min，取上清液進行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80 ℃冰箱，根據(jù)目的蛋白的分子量選擇不同的凝膠濃度(6%、12%)，再根據(jù)蛋白定量結(jié)果取所需蛋白加入適量上樣緩沖液，沸水浴10 min使蛋白變性，離心取上清液上樣。將配制好的 PAGE 膠放入電泳槽中，加入適量電泳緩沖液轉(zhuǎn)膜。室溫封閉 2 h 后加入一抗和膜，室溫孵育1 h，膜用PBST洗滌3次×5 min。隨后根據(jù)用量按1∶10000 稀釋 HRP 標記二抗，與膜室溫孵育 1 h。PBST 洗3次× 5 min，顯色后通過TANON GIS 軟件讀取相關條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 行為學檢測結(jié)果

2.1.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分結(jié)果 表2示，與假手術組比較，模型組神經(jīng)功能評分明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，各治療組神經(jīng)功能評分下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能評分情況比較(M(Q))

2.1.2 各組大鼠Ashworth評分的結(jié)果 表3示，與假手術組比較，模型組Ashworth評分明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，各治療組Ashworth評分下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠Ashworth評分情況比較(M(Q))

2.2 各組大鼠皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa受體mRNA表達的影響

表4示，與假手術組比較，模型組BDNF、TrkB、GABAa受體mRNA表達水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，各治療組BDNF、TrkB、GABAa受體 mRNA表達水平均有顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)；其中針藥組和西藥組上升最明顯(P<0.05，P<0.01)，2組間比較差異無統(tǒng)計學意義。

表4 各組大鼠皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa受體 mRNA表達比較

2.3 各組大鼠皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa受體蛋白表達的影響

表5圖1示，與假手術組比較，模型組BDNF、TrkB、GABAa受體蛋白表達均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，各治療組BDNF、TrkB、GABAa受體蛋白表達均有顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)；其中針藥組和西藥組上升最明顯(P<0.05，P<0.01)，2組間比較差異無統(tǒng)計學意義。

表5 各組大鼠皮質(zhì)中BDNF、TrkB、GABAa受體蛋白表達比較

圖1 各組大鼠BDNF、TrkB、GABAa受體蛋白免疫印跡圖

3 討論

中醫(yī)學認為，中風后肢體痙攣狀態(tài)多因陰虛血少、氣滯血瘀、經(jīng)脈失養(yǎng)所致，其病位在筋，屬于十二經(jīng)筋病候，治則為祛邪扶正、舒筋緩急[9]。陽陵泉是足少陽膽經(jīng)合穴，為八會穴之筋會，是治療全身筋病要穴，具有舒筋和壯筋的作用；曲池為多氣多血的手陽明經(jīng)合穴，《太平圣惠方》中說曲池穴能主治中風后痙證“偏風半身不遂，投物不得，挽弓不開，肘臂偏細”[10]。《針灸大成·百癥賦》中指出，陽陵泉與曲池二穴在中風病中具有相互聯(lián)系、協(xié)同增效的作用，“半身不遂, 陽陵遠達于曲池”[11]。芍藥甘草湯是《傷寒論》中治療“足痙急，不得伸”的名方，具有“酸甘化陰”的作用，臨床治療腦卒中后肢體痙攣具有很好的療效。方中由白芍、甘草為君藥柔肝緩急、解痙止痛；黃芪、當歸、川芎、地龍加雞血藤、木瓜、桑枝、伸筋草為臣藥，以益氣活血、通經(jīng)活絡，佐以山茱萸、枸杞子滋補肝腎養(yǎng)陰，諸藥合用共奏滋陰柔肝緩急、益氣活血通絡之功[3]。因此，針刺陽陵泉、曲池結(jié)合加味芍藥甘草湯能更好地緩解腦卒中后肢體痙攣狀態(tài)，以促進腦卒中患者的康復，提高患者生存質(zhì)量。

腦卒中痙攣狀態(tài)是一種以臨床肢體偏癱為表現(xiàn)的運動功能性障礙狀態(tài)。大腦皮質(zhì)是人體大腦中掌控運動、認知以及感覺的重要部位[12]，大腦皮質(zhì)激活區(qū)模式的變化與腦卒中體感功能障礙恢復有關[13]。BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特別是在大腦皮質(zhì)、海馬含量極為豐富，TrkB是BDNF的特異性受體，二者高度結(jié)合后調(diào)控胞內(nèi)多種信號通路，參與神經(jīng)元生存、分化、發(fā)育，可促進神經(jīng)元損傷后的再生，維持神經(jīng)系統(tǒng)的生存及功能，調(diào)節(jié)海馬突觸傳遞和突觸可塑性[14]。突觸可塑性是腦可塑性的主要表現(xiàn)，腦的可塑性貫穿于腦卒中后神經(jīng)功能康復的全過程，在保護神經(jīng)損傷、促進神經(jīng)功能恢復有重要作用[15]。現(xiàn)代醫(yī)學認為，神經(jīng)遞質(zhì)的失衡和紊亂是肢體痙攣發(fā)生的物質(zhì)基礎[16]。抑制性遞質(zhì)相對/絕對缺乏或興奮性遞質(zhì)相對/絕對增加，均可引起和加重痙攣狀態(tài)[17]。GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的抑制性遞質(zhì)，與上運動神經(jīng)元損傷引起的痙攣關系密切。GABA受體可分為三類，即GABAa受體、GABAb受體和GABAc受體，其中GABAa屬于離子通道型受體，其與GABA在突觸后膜相結(jié)合，借助于離子通道可產(chǎn)生快速抑制性突觸傳遞，防止腦內(nèi)神經(jīng)元過度興奮，從而防止痙攣的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，BDNF與GABA存在相互調(diào)控作用，除極化的GABAa受體活性觸發(fā)BDNF的釋放；反之，BDNF通過突觸前TrkB受體也可促進GABA的釋放，并增加細胞表面GABAa受體的表達。BDNF參與調(diào)節(jié)谷氨酸和GABA能突觸的突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體的數(shù)量與分布[18]，即突觸后調(diào)控作用，通過升高GABA水平，對GABA能神經(jīng)可塑性的調(diào)節(jié)起關鍵作用[19]。課題組在前期研究工作顯示，電針緩解腦卒中肢體痙攣狀態(tài)療效顯著，其作用機理與調(diào)節(jié)腦內(nèi)GABAa受體mRNA表達水平有關[9，20-21]。電針可雙向調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)中谷氨酸和GABAa受體的表達，從而對腦卒中肢體痙攣產(chǎn)生良好的治療效果[8]。

本實驗為建立一種痙攣狀態(tài)穩(wěn)定的腦卒中肢體痙攣大鼠動物模型，造模時注射NMDA受體，通過引起神經(jīng)元產(chǎn)生迅速而持久的興奮效應，從而引起肢體痙攣的狀態(tài)。研究結(jié)果顯示，針藥結(jié)合方法優(yōu)于單純電針和中藥療法，可促進大腦皮質(zhì)中BDNF、TrkB、GABAa受體基因和蛋白表達上升，使大鼠的神經(jīng)功能和肌張力評分明顯下降，說明針藥結(jié)合方法緩解肢體痙攣的作用機制可能與上調(diào)BDNF、TrkB、GABAa受體表達水平有關。針藥結(jié)合方法能有效疊加電針舒筋緩急止痙和加味芍藥甘草湯滋陰柔肝緩急的療效，同時發(fā)揮藥物和經(jīng)穴的雙重特殊作用。通過影響神經(jīng)遞質(zhì)，調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)運動區(qū)神經(jīng)興奮功能，從而改善腦卒中肢體痙攣狀態(tài)。本實驗結(jié)果為臨床應用針藥結(jié)合治療腦卒中肢體痙攣提供了一定的實驗依據(jù)，但其具體是如何通過信號通路來發(fā)揮其作用機制的，還有待后續(xù)進一步研究探索。