度拉糖肽對(duì)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶減退和突觸退行性變的保護(hù)作用*

姜國晶 周 梅 俞 婧 楊 敏 劉筱涵 趙 綱 鄧艷秋

1 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院老年病科,天津市 300211; 2 天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系;3 天津腫瘤醫(yī)院病理科

阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是以進(jìn)行性學(xué)習(xí)記憶力減退為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，神經(jīng)細(xì)胞外形成淀粉樣斑塊(Aβ)、細(xì)胞內(nèi)見神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)及神經(jīng)元、軸突丟失是AD的主要病理表現(xiàn)[1]。神經(jīng)元突觸缺失及其引起的突觸可塑性的改變?cè)贏D的早期病理變化中占有重要地位，與學(xué)習(xí)和記憶減退密切相關(guān)[2]。葡萄糖代謝異常和胰島素信號(hào)通路受損是2型糖尿病(T2DM)和AD的共同特征，AD也被稱為3型糖尿病[3]。胰高血糖素樣肽1(GLP-1)作為T2DM藥物作用的靶點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注[4]。研究發(fā)現(xiàn)GLP-1和GLP-1受體(GLP-1R)廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，主要分布在神經(jīng)元胞體和樹突上，GLP-1R基因缺失的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降[5]。筆者先前報(bào)道長效GLP-1R激動(dòng)劑度拉糖肽對(duì)AD樣學(xué)習(xí)記憶減退的保護(hù)作用[6]，本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射度拉糖肽，聯(lián)合應(yīng)用GLP-受體拮抗劑，進(jìn)一步探究度拉糖肽對(duì)散發(fā)性AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶、突觸蛋白、CREB和Aβ的表達(dá)及對(duì)神經(jīng)細(xì)胞和突起的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 選取SPF級(jí)雄性野生型C57/BL6小鼠32只，9周齡。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(CON組)、模型組(STZ組)、度拉糖肽治療組(Dul組)和度拉糖肽加抑制劑組(Ex組)，每組8只。造模前小鼠常規(guī)飼養(yǎng)、適應(yīng)環(huán)境1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 度拉糖肽(禮來，上海，中國)，Ex9-39(中肽，杭州，中國)，Streptozotocin (STZ)(Sigma Aldrich,USA)，SAP97、SP11抗體(Thermo Fisher Scientific,USA) Aβ1-42、p-CREB抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠和IgG羊抗兔IgG(Abcam,UK)。無菌度拉糖肽制備：將1.5mg/0.5ml度拉糖肽放于超凈臺(tái)內(nèi)，取其中0.5ml放入無菌離心管中，4℃無菌條件下保存。腹腔注射時(shí)將度拉糖肽與無菌生理鹽水混合稀釋。

1.3 動(dòng)物處理和取材 于STZ組、Dul組和Ex組小鼠雙側(cè)腦室內(nèi)注射STZ(3mg/kg體質(zhì)量)，以建立散發(fā)性AD模型。注射后21d，Dul組小鼠腹腔注射度拉糖肽，Ex組小鼠注射度拉糖肽和Ex9-39，CON組和STZ組給予等量無菌生理鹽水，均持續(xù)注射4周。嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。水迷宮實(shí)驗(yàn)完成后，小鼠斷頭處死，冰上迅速取腦，取右半腦放入離心管中-80℃凍存用于蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，左半腦部分固定于4%中性甲醛溶液中用于尼氏染色和高爾基染色。

1.4 學(xué)習(xí)記憶能力行為測試 自度拉糖肽注射后23d起對(duì)小鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力行為學(xué)測試，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。選取四個(gè)象限中點(diǎn)為四個(gè)入水點(diǎn)，分別進(jìn)行以下檢測：(1)定位航線實(shí)驗(yàn)：將4組小鼠隨機(jī)從3個(gè)不同象限面向池壁放入水中，分別記錄60s內(nèi)小鼠尋找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)及其游泳路徑。若小鼠于60s內(nèi)成功找到平臺(tái)，記錄實(shí)際逃避潛伏期；若60s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將逃避潛伏期記為60s，而后研究者手動(dòng)將小鼠放到平臺(tái)上并停留30s；每次實(shí)驗(yàn)時(shí)間為4d，4次/d，路徑相同。(2)空間搜索試驗(yàn)：于步驟(1)后次日進(jìn)行，撤除平臺(tái)，將各組小鼠分別從第一象限相同入水點(diǎn)面向池壁放入水中，統(tǒng)計(jì)小鼠60s內(nèi)在原平臺(tái)象限內(nèi)的停留時(shí)間。

1.5 小腦組織SAP97、SP11、CREB和Aβ1-42表達(dá)檢測 采用Western blot法。取各組小鼠凍存腦組織，冰浴下勻漿，而后4℃、16 000r/min離心10min，取上清液，常規(guī)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，提取蛋白并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，室溫下于脫脂牛奶中封閉30min，而后分別加入抗SAP97、SP11、p-CREB、CREB和Aβ一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠或兔二抗，室溫孵育1h，TBST洗膜。將PVDF膜置于掃描儀內(nèi)，ECL顯色。以β-actin為內(nèi)參。

1.6 尼氏染色 對(duì)各組小鼠腦組織切片，脫蠟、復(fù)水后，置于尼氏染色液中，于56℃浸染1h。雙蒸水清洗，分化液中分化，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于普通顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.7 高爾基染色 按試劑盒說明書完成。取2mm厚已固定腦組織，放入3.5%重鉻酸鉀溶液中1周，每天定時(shí)換液。1周后采用雙蒸水溶液洗凈組織塊，放入1.5%AgNO3雙蒸水溶液中浸銀5d，每天換液1次，常溫避光保存。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，每隔5張取1張，厚度為50μm。脫蠟、封片。

2 結(jié)果

2.1 度拉糖肽改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力 在前4d水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中，與CON組相比，STZ組小鼠的逃避潛伏期增大，Dul組同STZ組小鼠相比，逃避潛伏期縮短，而Ex組小鼠的逃避潛伏期與STZ組的數(shù)據(jù)接近(圖1a)。在空間探索實(shí)驗(yàn)，STZ、Ex組小鼠在目標(biāo)象限的游泳時(shí)間比CON組明顯減少， Dul組小鼠在目標(biāo)象限的游泳時(shí)間比STZ組小鼠明顯增加(圖1b)。各組小鼠游泳速度無明顯差異，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，CON組和Dul組小鼠從盲目的隨機(jī)式和邊緣式尋找平臺(tái)轉(zhuǎn)變?yōu)橛心康闹本€式變化，而STZ和Ex組小鼠軌跡轉(zhuǎn)變不明顯(圖1c)。這些結(jié)果提示度拉糖肽可能通過GLP-1受體改善AD樣小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

圖1 小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.2 度拉糖肽提高小鼠腦組織神經(jīng)突觸蛋白的表達(dá)水平 與CON組相比，STZ、Ex組小鼠腦組織SAP97和SP11表達(dá)量下降，與STZ、Ex組相比，Dul組小鼠腦組織兩種蛋白的表達(dá)升高(圖2)。

圖2 小鼠腦組織中突觸相關(guān)蛋白Western Blotting結(jié)果

2.3 度拉糖肽促進(jìn)小鼠轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CREB的表達(dá)，減少Aβ的產(chǎn)生 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CREB與調(diào)節(jié)突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶的形成密切相關(guān)，β-actin為內(nèi)參，同CON組相比， STZ和Ex組小鼠腦組織CREB磷酸化的水平下降，Aβ1-42水平增加。與STZ組相比，Dul組小鼠CREB磷酸化修飾水平上升，Aβ聚集水平下降(P<0.05)，提示度拉糖肽可能通過GLP-1受體改善AD樣小鼠腦內(nèi)CREB的活性和減少Aβ聚集(圖3)。

圖3 小鼠腦組織內(nèi)CREB蛋白和Aβ的Western Blotting結(jié)果

2.4 度拉糖肽改善AD樣小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞的功能活性 CON組小鼠海馬CA2區(qū)和皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞排列密集、整齊，胞漿中可見豐富尼氏體，呈深藍(lán)色，細(xì)胞核藍(lán)染，著色較深；STZ、Ex組小鼠海馬CA2區(qū)和皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞漿中尼氏體數(shù)量少，呈空泡狀，染色較淺；而Dul組小鼠腦組織海馬CA2區(qū)和皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞尼氏小體比STZ組和Ex組有明顯改善(圖4)。

圖4 小鼠腦組織尼氏染色

2.5 度拉糖肽改善AD樣小鼠的神經(jīng)突起 高爾基染色示，CON組中錐體細(xì)胞呈錐體形或三角形，油鏡下可見樹突和棘突枝干粗大、豐富，二者排列錯(cuò)綜復(fù)雜；STZ、Ex組樹突和棘突斷裂，分支減少，枝干纖細(xì)；Dul組樹突和棘突較STZ組和Ex組明顯豐富粗大(圖5)。

圖5 小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的高爾基染色圖片

3 討論

小鼠腦室注射STZ是制備散發(fā)性AD動(dòng)物模型的常用方法。本研究結(jié)果顯示，STZ處理小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力較CON組小鼠明顯減退，與筆者之前其他研究者的報(bào)告一致[7]，而度拉糖肽通過GLP-1受體明顯改善了模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。腦內(nèi)GLP-1與GLP-1R結(jié)合可激活GLP-1信號(hào)，可通過腦—腸—GLP軸抑制食欲，調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突生長及海馬神經(jīng)元回路活性、上調(diào)酪氨酸羥化酶活性、促進(jìn)兒茶酚胺生成[8]。外源性給予GLP-1類似物能明顯提高腦組織的GLP-1的表達(dá)，影響胰島素信號(hào)并激活胰島素信號(hào)分子如cAMP-PKA和PI3K-AKT途徑[9]，并調(diào)節(jié)腦內(nèi)的葡萄糖代謝，AD患者認(rèn)知能力下降與其腦內(nèi)胰島素抵抗、葡萄糖代謝失調(diào)等密切相關(guān)，GLP-1信號(hào)減弱參與認(rèn)知功能減退和AD神經(jīng)退行性變，而長效的度拉糖肽可能通過提高胰島素信號(hào)和糖代謝改善模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

神經(jīng)元突觸缺失和突觸可塑性變化是AD早期病理變化，在AD學(xué)習(xí)和記憶功能障礙發(fā)病中起重要作用。突觸蛋白是突觸可塑性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，突觸相關(guān)蛋白97參與控制神經(jīng)突觸受體密度和信號(hào)強(qiáng)度，突觸小泡蛋白存在于突觸前成分的突觸囊泡膜上，可間接反映突觸的數(shù)量、分布和密度，常用作突觸密度的標(biāo)志物[10]。筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩種蛋白的表達(dá)在STZ組明顯降低，伴有CREB的活性減低和Aβ1-42的增加，且在尼氏和高爾基染色可以明顯觀察到尼氏小體的減少和神經(jīng)突起的減少包括樹突縮短和樹突棘的明顯減少。研究發(fā)現(xiàn)：Aβ1-42通過降低樹突棘密度，引起神經(jīng)元損失，進(jìn)而影響突觸可塑性，使與記憶相關(guān)的突觸功能受損[11]。既往研究[12]發(fā)現(xiàn)，早期AD的組織病理學(xué)表現(xiàn)為神經(jīng)元樹突棘、突觸數(shù)量減少，且突觸蛋白水平下降早于突觸數(shù)量減少，進(jìn)而突觸功能受損，降低神經(jīng)遞質(zhì)傳遞效率，進(jìn)而導(dǎo)致Aβ沉積于突觸內(nèi)，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，進(jìn)一步損傷突觸可塑性，最終進(jìn)展為神經(jīng)退行性變和認(rèn)知障礙。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，Aβ過度表達(dá)可抑制突觸蛋白Syn、PSD-95表達(dá)。CREB是一種選擇性結(jié)合CREs 的核蛋白的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子。主要對(duì)PKA等信號(hào)發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)。未經(jīng)磷酸化的CREB主要存在于核內(nèi)，cAMP激活PKA后，活化PKA進(jìn)入細(xì)胞核，使CREB磷酸化，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因與記憶的形成有關(guān)。其中CREB 的133 位絲氨酸殘基(Ser133) 對(duì)CREB的轉(zhuǎn)錄活性起著重要作用[13]。有研究[14]報(bào)道，GLP-1類似物利拉魯肽可促進(jìn)AKT磷酸化，提高cAMP水平，同時(shí)可抑制GSK3β磷酸化及神經(jīng)細(xì)胞凋亡。DPP4抑制劑西格列汀調(diào)高GLP-1的水平，提高突觸相關(guān)蛋白97、突觸蛋白-1、突觸小泡蛋白和PSD95在3×Tg小鼠腦組織中表達(dá)下調(diào)，與改善CREB的活性相關(guān)[15]。因此，度拉糖肽可能通過提高GLP-1受體調(diào)節(jié)cAMP、PI3K/AKT等信號(hào)分子，影響CREB ser133的磷酸化，活化的CREB進(jìn)一步改變基因的轉(zhuǎn)錄，提高小鼠腦組織突觸相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄和合成，減少Aβ的沉積，增強(qiáng)突觸可塑性，從而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用。

因此，長效GLP-1R激動(dòng)劑度拉糖肽可能通過GLP-1受體，調(diào)節(jié)CREB的活性，減少AD樣小鼠腦內(nèi)Aβ沉積，增加突觸蛋白的表達(dá)水平和突觸的長度，進(jìn)而改善神經(jīng)細(xì)胞的突觸退行性病變，提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。