不同來源寡聚-1,6-葡糖苷酶異源表達(dá)及酶學(xué)特性

華 燁， 劉 鵬， 王永紅

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是一種兼性厭氧革蘭氏陽性菌，具有耐高溫、耐酸、穩(wěn)定性好、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[1]，在工業(yè)發(fā)酵中主要用來生產(chǎn)L-乳酸。相比于其他生產(chǎn)菌株，凝結(jié)芽孢桿菌的發(fā)酵溫度更高，不易染菌，且發(fā)酵工藝較簡單[2]，并可以利用一些廉價碳源作為底物原料。但目前在以玉米粉/淀粉水解液為底物的凝結(jié)芽孢桿菌生產(chǎn)乳酸的工業(yè)發(fā)酵過程中，發(fā)酵結(jié)束時會有較高濃度的殘?zhí)荹3]，這會使得糖酸轉(zhuǎn)化率下降，并導(dǎo)致乳酸分離純化過程費(fèi)用增加、產(chǎn)品質(zhì)量下降以及貨架期縮短。在乳酸發(fā)酵液殘?zhí)侵?，異麥芽糖質(zhì)量占?xì)執(zhí)强傎|(zhì)量的60%左右，而寡聚-1,6-葡糖苷酶（oligo-1,6-glucosidase，EC 3.2.1.10）對于異麥芽糖有較高的利用活性。

寡聚-1,6-葡糖苷酶也稱異麥芽糖酶或糊精6-α-D-葡萄糖水解酶[4-5]，是一種外切酶，可以從多糖的非還原性端催化水解α-1,6-糖苷鍵，如α-極限糊精、異麥芽糖、異麥芽糖酮糖、異麥芽三糖等，同時也能水解對硝基苯-α-D-葡萄糖苷（pNPG）生成葡萄糖苷和對硝基苯酚（pNP）[6]。不同細(xì)菌來源的寡聚-1,6-葡糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)有所差異，為了水解凝結(jié)芽孢桿菌乳酸發(fā)酵殘?zhí)且褐械漠慃溠刻牵竺妇哂休^好的耐熱性和耐酸性。關(guān)于酶的熱穩(wěn)定性，Suzuki 等[4]和Watanabe 等[7]提出了脯氨酸法則，在氨基酸序列中脯氨酸含量的增加會使得每個區(qū)域結(jié)構(gòu)更加緊密穩(wěn)定以及疏水性更強(qiáng)，從而提高蛋白的熱穩(wěn)定性。研究人員將蛋白中的氨基酸殘基定點(diǎn)誘變?yōu)楦彼岷笤黾恿说鞍椎臒岱€(wěn)定性，在一定程度上支持了脯氨酸法則，如Matthews 等[8]將β-轉(zhuǎn)角的丙氨酸定點(diǎn)突變?yōu)楦彼岷筇岣吡耸删wT4 溶菌酶的熱穩(wěn)定性，但需要更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)來驗(yàn)證脯氨酸的普適性。

基于前期研究工作并經(jīng)BRENDA 數(shù)據(jù)庫搜索挑選了5 個可能耐溫、耐酸的寡聚-1,6-葡糖苷酶基因，分別是凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）ATCC 7050中的malL BF29_2011（BC1）和malL BF29_2004（BC2）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）168 中的 malL yvdL BSU34560（BS1）和yugT BSU31290（BS2）以及嗜熱葡萄糖苷地衣芽孢桿菌（Bacillus thermoglucosidasius）KP 1006 中的malL（KP）。其中Bacillus coagulansATCC 7050 適 合 的 生 長 溫 度 為37～50 ℃，BC1 和BC2 的脯氨酸摩爾分?jǐn)?shù)分別為4.32% 和4.80%；Bacillus subtilis168 適合生長溫度為37 ℃，BS1 和BS2 的脯氨酸摩爾分?jǐn)?shù)分別為4.10% 和4.33%，Bacillus thermoglucosidasiusKP 1006 適 合 生 長 溫 度 為55～60 ℃，KP 的脯氨酸摩爾分?jǐn)?shù)為5.69%。可見KP 的脯氨酸摩爾分?jǐn)?shù)最高，BC1、BC2、BS1 和BS2 的脯氨酸摩爾分?jǐn)?shù)較為接近，其中BS1 的脯氨酸摩爾分?jǐn)?shù)最低。

寡聚-1,6-葡糖苷酶屬于α-淀粉酶GH13 家族，其結(jié)構(gòu)與其他α-淀粉酶結(jié)構(gòu)相似，其在CSR V 中的序列是QPDLN[9-10]，是能夠區(qū)分GH13 家族中的寡聚-1,6-葡糖苷酶和普魯蘭酶的關(guān)鍵區(qū)域[11]。對比BC1、BC2、KP、BS1、BS2 在CSR V 以及CSR Ⅱ的氨基酸序列，BC2 在CSR V 的 序 列 是MPDLN，BC2 和BS2 在CSR Ⅱ的序列中也含有中介酶特異性殘基，可推斷BC2 以及BS2 基因所表達(dá)的酶是中介酶。

目前關(guān)于寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的研究，主要是將來源于蠟樣芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌等的寡聚-1,6-葡糖苷酶在大腸桿菌[12]、釀酒酵母畢赤酵母中[13]進(jìn)行異源表達(dá)。寡聚-1,6-葡糖苷酶在大腸桿菌中的表達(dá)水平較低，因此蛋白純化難度較高。隨著基因工程的發(fā)展，大腸桿菌pET 表達(dá)系統(tǒng)開始得到廣泛應(yīng)用，它是一種可以使用乳糖或乳糖類似物進(jìn)行誘導(dǎo)的高效表達(dá)系統(tǒng)，同時可以為外源目的基因帶上純化標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，是一種強(qiáng)大有效、應(yīng)用極廣的克隆及表達(dá)重組蛋白的系統(tǒng)[14]。其中，pET-22b(+)是大腸桿菌在pET 表達(dá)系統(tǒng)中常用的一種高表達(dá)載體，且?guī)в蠺7 啟動子、His 親和標(biāo)簽以及多克隆位點(diǎn)，可以在宿主E. coliBL21(DE3)中高效表達(dá)不同來源的寡聚-1,6-葡糖苷酶，并滿足蛋白純化和酶活性研究的需求。

本文對不同來源的寡聚-1,6-葡糖苷酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的特性比較研究，可為今后乳酸發(fā)酵用凝結(jié)芽孢桿菌的基因工程改造和高效菌株融合篩選奠定基礎(chǔ)，并有效降低乳酸發(fā)酵后期的殘?zhí)菨舛取?/p>

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

Bacillus coagulansATCC 7050，E. coliBL21(DE3)，E. coliDH5α：均由本實(shí)驗(yàn)室保藏；Bacillus subtilis168：美國ATCC 細(xì)胞庫；Bacillus thermoglucosidasiusKP 1006：中國普通微生物菌種保藏管理中心；pET-22b(+)：由本實(shí)驗(yàn)室保藏；酵母膏、蛋白胨、瓊脂：生化試劑，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）：生化試劑，上海碧云天有限公司；pNPG：w＞ 99%，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；限制性內(nèi)切酶：寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因DNA 抽提試劑盒、AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒：愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；One Step Cloning Kit：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；PAGE 凝膠快速制備試劑盒（10%）：上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；Ni-NTA 6FF 蛋白純化預(yù)裝柱（5 mL）：上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 測試與表征

高速冷凍離心機(jī)（德國Hermle 5 418）：4 ℃離心；超聲破碎儀（美國Qsonica Q500）：工作時間10 min，超聲3 s，暫停7 s，振幅34%；蛋白電泳槽（BIO-RAD Laboratories 165-800）：濃縮膠操作電壓80 V，分離膠操作電壓120 V；核酸定量儀（Thermo Scientific ND2000/2000c）：在280 nm 下檢測核酸濃度，在205 nm下檢測蛋白濃度；96 孔酶標(biāo)儀（Thermo Scientific Varioskan lux）：在405 nm 下檢測對硝基苯酚的濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 培養(yǎng)基配制 LB(Luria-Bertani) 液體培養(yǎng)基（g/L）[15]：蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10，pH 為7.0；LB 固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上再添加18 g/L的瓊脂，用于E. coliDH5α、E. coliBL21(DE3)、Bacillussubtilis168、Bacillus thermoglucosidasiusKP 1006 的培養(yǎng)。將LB 培養(yǎng)基用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 為5.0，用于Bacillus coagulansATCC 7050 的培養(yǎng)。

1.3.2 菌體培養(yǎng) 按照Bacillus coagulansATCC 7050 的培養(yǎng)溫度為50 ℃，Bacillus thermoglucosidasiusKP 1006 的培養(yǎng)溫度為55 ℃，Bacillus subtilis168、E. coliDH5α、E. coliBL21(DE3)的培養(yǎng)溫度為37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。首先將凍存于-80 ℃的細(xì)菌融化后，在無抗性LB 固體平板上劃線倒置培養(yǎng)12～14 h，挑取單菌落接種于4 mL液體LB 培養(yǎng)基中，220 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)。

1.3.3 構(gòu)建不同來源寡聚-1,6-葡糖苷酶表達(dá)系統(tǒng)

（1）提取Bacillus coagulansATCC 7050、Bacillus subtilis168、Bacillus thermoglucosidasiusKP 1006 基因組。將3 株菌在LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至光密度（OD600）值達(dá)到1～2，再取2 mL菌液使用Takara 細(xì)菌基因組DNA 小量純化試劑盒提取基因組，具體操作按試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行。

（2）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 擴(kuò)增目的基因。分別以3 株菌的基因組為模板，利用PhantaTM高保真DNA 聚合酶擴(kuò)增出BC1、BC2、BS2、BS1 和KP 5 個基因（BC1(NedI)-F/BC1(HindIII)-R、BC2(NedI)-F/BC2(HindIII)-R、BS1(NedI)-F/BS1(HindIII)-R、BS2(NedI)-F/BS2(HindIII)-R、KP(NedI)-F/ KP(HindIII)-R），引物具體堿基序列見表1。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸1.5 min，進(jìn)行35 個循環(huán)；72 ℃徹底延伸5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）瓊脂凝膠電泳鑒定為目的基因后，使用Axygen 膠回收試劑盒進(jìn)行片段回收。

表1 不同來源寡聚-1,6-葡糖苷酶基因PCR 擴(kuò)增上下游引物設(shè)計(jì)Table 1 Primers of different oligo-1,6-glucosidase genes for PCR amplification

（3）構(gòu)建表達(dá)載體。將質(zhì)粒pET-22b(+)用NedI和HindIII 兩種限制性酶雙酶切，經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳鑒定后，使用Axygen 膠回收試劑盒進(jìn)行片段回收，得到目的基因片段和載體酶切片段。使用ClonExpress?試劑盒進(jìn)行重組連接，挑取陽性轉(zhuǎn)化子送上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.3.4 重組蛋白異源表達(dá)及制備樣品 采用熱激法將經(jīng)過測序驗(yàn)證堿基序列正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E. coliBL21(DE3)中獲得相應(yīng)重組菌。挑取單菌落于10 mL含50 μg/mL 氨芐的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12～14 h 至OD600達(dá)到4 左右時，按照2.5%的接種量接種至LB 液體培養(yǎng)基中，使得初始OD600為0.1，于37 ℃、220 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)1.5 h 至OD600達(dá)到0.5～0.8，加入IPTG（終濃度為0.3 mmol/L），于20 ℃、220 r/min 條件下誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。將菌液倒入預(yù)冷離心管中取樣，8 000g、4 ℃下離心收集菌體，用去離子水和1×PBS（磷酸鹽緩沖液）各清洗一次，最后用1×PBS 緩沖液重懸菌體，置于冰上進(jìn)行超聲破碎，至液體澄清透明則破碎完全。破碎后樣品于8 000g、4 ℃下離心15 min 后分別收集上清和沉淀，上清液為蛋白表達(dá)液，沉淀用1×PBS 緩沖液重懸，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)檢測重組蛋白的表達(dá)情況。

1.3.5 重組蛋白分離純化 重組蛋白帶有His 親和標(biāo)簽，使用Ni-NTA 蛋白純化預(yù)裝柱進(jìn)行純化。低咪唑上樣，再用濃度為100、150、200、250 mmol/L 的咪唑依次梯度洗脫，確定最適濃度咪唑洗脫的方式進(jìn)行純化。純化蛋白超濾濃縮后經(jīng)SDS-PAGE 分析，并使用核酸定量儀在205 nm 處測定蛋白濃度。

1.3.6 寡聚-1,6-葡糖苷酶活性檢測 通過酶標(biāo)儀檢測pNPG 在寡聚-1,6-葡糖苷酶作用下水解生成的pNP 在405 nm下的吸光度來測定寡聚-1,6-葡糖苷酶的酶活。分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每個反應(yīng)按200 μL體積加樣，并做3 個平行。實(shí)驗(yàn)組先加入131.4 μL濃度為50 mmol/L 的pNPG 緩沖液，再加入11.5 μL蛋白溶液，在特定溫度下孵育一定時間后加入57.1 μL濃度為0.3 mol/L 的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測定405 nm處的吸光度。對照組則加入高溫滅活后的蛋白溶液。一個酶活單位（1U）定義為在最適條件下，1 min內(nèi)水解產(chǎn)生1 mmol pNP 的酶量。

1.3.7 不同來源寡聚-1,6-葡糖苷酶酶學(xué)特性

（1）最適pH 及pH 穩(wěn)定性。將不同來源寡聚-1,6-葡糖苷酶分別置于不同pH 和緩沖液（pH 4.0～6.0，100 mmol/L CH3COOH-CH3COONa 緩沖液；pH 6.0～8.0，100 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩 沖 液；pH 7.0～9.0， 50 mmol/L Tris-HCl 緩 沖 液） 配 制的pNPG 溶液中檢測酶活，并分別置于各自最適pH 的緩沖液中，4 ℃靜置，在3、6、9、12、15 h 取樣檢測殘余酶活。

（2）最適溫度及熱穩(wěn)定性。在各自最適pH 下，測定不同來源寡聚-1,6-葡糖苷酶在30～64 ℃的活性。在最適條件下孵育一定時間后，測定在最適條件下的殘余酶活。

（3）離子對酶活影響。參考培養(yǎng)基常用添加成分選取測試離子，檢測Ni+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Ca2+、Mg2+、K+、 N H+4對于酶活的影響，分別在緩沖體系中添加NiSO4、ZnSO4、CuSO4、CoCl2、CaCl2、MgSO4、KCl、(NH4)2SO4溶液（終濃度為5 mmol/L），以不添加金屬離子的體系作為參照，在最適條件下測定酶活。

（4）測定酶動力學(xué)參數(shù)。在各自最適條件下，測定酶在不同濃度（0.46、0.92、1.84、2.76、3.68、4.60 mmol/L）pNPG 底物下產(chǎn)生pNP 的速率，利用Microsoft Excel 2016 基于Michaelis-Menten 公式進(jìn)行非線性規(guī)劃求解，得到動力學(xué)參數(shù)Vmax和Km，轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat根據(jù)公式Kcat=Vmax/[E]求解（其中[E]為酶的濃度），催化效率根據(jù)Kcat/Km計(jì)算獲得[16]。

（5）分析底物特異性。參考乳酸發(fā)酵液中的殘?zhí)浅煞诌x取測試對象。用緩沖液配制質(zhì)量濃度均為2 g/L 的麥芽糖、異麥芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖以及可溶性直鏈淀粉的底物溶液，通過檢測水解產(chǎn)物葡萄糖的濃度來分析不同來源寡聚-1,6-葡糖苷酶的底物特異性。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同來源寡聚-1,6-葡糖苷酶基因克隆

以各細(xì)菌的基因組為模板，根據(jù)基因組序列分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物擴(kuò)增目的基因。BC1、BC2 擴(kuò)增長度為1 665 bp 和1 689 bp，KP 擴(kuò)增長度為1 686 bp，BS1、BS2 擴(kuò)增長度為1 683 bp 和1 662 bp。質(zhì)粒pET-22b(+)經(jīng)NedI 和HindIII 限制性內(nèi)切酶雙酶切后得到線性片段，片段長度為5 382 bp。各片段的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1 所示，可見長度符合預(yù)期。

圖1 BC1、BC2、KP、BS1、BS2 基因PCR(a)和pET-22b(+)雙酶切(b)結(jié)果Fig. 1 Results of PCR amplification of the BC1, BC2, KP, BS1 and BS2 gene (a) and double enzyme digestion of pET-22b(+) (b)

線性化質(zhì)粒載體和擴(kuò)增目的基因片段經(jīng)一步克隆酶連接后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 中，并涂布于含有氨芐（50 μg/mL）的抗性平板上。挑取轉(zhuǎn)化子菌斑，用pET-22b(+)質(zhì)粒上選擇的克隆位點(diǎn)上下游引物YZF/YZ-R（序列見表1）進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子。陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行進(jìn)一步的測序驗(yàn)證，若測序序列與插入目的基因序列一致則表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 不同來源寡聚-1,6-葡糖苷酶異源表達(dá)與純化

圖2 所示為5 種寡聚-1, 6-葡糖苷酶表達(dá)情況及純化結(jié)果。由圖2（f）可見，E. coliBL21(DE3)和含空載質(zhì)粒pET-22b(+) 的菌表達(dá)的蛋白大致相同，在IPTG 誘導(dǎo)前后總蛋白沒有差異，且在66.2 kDa 大小附近沒有明顯條帶，說明宿主菌本身和含有空載質(zhì)粒的菌株不表達(dá)重組蛋白。

將構(gòu)建好的pET-BC1、pET-BC2、pET-KP、pETBS1 和pET-BS2 分別轉(zhuǎn)入到E. coliBL21(DE3) 中獲得各個轉(zhuǎn)化菌株，并進(jìn)行IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)。各重組菌在IPTG 誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后取樣，菌體經(jīng)超聲破碎后獲得總蛋白液，離心后獲得上清液和沉淀，進(jìn)行SDSPAGE 蛋白凝膠電泳分析。

比較對照組和各重組菌，以及各重組菌IPTG 誘導(dǎo)前的菌體總蛋白（圖2（a）～2（e） Lane 1）和誘導(dǎo)后的總蛋白（圖2（a）～2（e） Lane 2），各重組菌誘導(dǎo)后的總蛋白中含有目的重組蛋白（BC1：66.2 kDa；BC2：

圖2 5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶表達(dá)及純化Fig. 2 Expression and purification of five oligo-1,6-glucosidases

66.6 kDa；KP：67.7 kDa；BS1：67.3 kDa；BS2：65.3 kDa），說明誘導(dǎo)表達(dá)成功，且在沉淀和上清液中都存在目的重組蛋白。上清液流經(jīng)鎳柱后，目的重組蛋白親和吸附于鎳柱上，依次用含100、150、200、250 mmol/L咪唑的洗脫液進(jìn)行洗脫，在含100 mmol/L 咪唑的洗脫液中有較多雜蛋白（圖2（a）～2（e） Lane 5），在含150 mmol/L 咪唑的洗脫液中得到單一的純化蛋白（見圖2（a）～2（e） Lane 6），將用含150 mmol/L 咪唑的洗脫液洗脫并超濾濃縮得到的目的重組蛋白進(jìn)行酶學(xué)特性檢測。

2.3 不同來源寡聚-1,6-葡糖苷酶酶學(xué)特性

2.3.1 最適pH 及pH 穩(wěn)定性 在pH 4.0～9.0 范圍內(nèi)，5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶的pH-相對酶活曲線如圖3 所示。當(dāng)pH=4.0 時，5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶的相對酶活都在20%～30% 之間，酶活較低。當(dāng)pH=5.0 時，BC1、BC2、KP 的相對酶活為100%。當(dāng)pH=6.0 時，BS1、BS2 的相對酶活（CH3COOH-OH3COONa 緩沖液中）達(dá)到100%。隨著pH 的升高，各個寡聚-1,6-葡糖苷酶的相對酶活都顯著下降。BC1、BC2、KP 的最適pH 為5.0，BS1、BS2 的最適pH 為6.0。因此，5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶在堿性環(huán)境下酶活較低，都屬于酸性酶。

圖3 5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶的最適pHFig. 3 Optimum pH of five oligo-1,6-glucosidases

值得注意的是，在pH 6.0 情況下， BC1、BC2、BS1 和BS2 在CH3COOH-CH3COONa 緩沖液中的相對酶活高于在Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中的相對酶活；在pH 7.0～8.0 情況下，5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶在Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中的相對酶活高于在Tris-HCl 緩沖液中的相對酶活，說明Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液較CH3COOH-CH3COONa 緩沖液對酶活有一定抑制作用，而Tris-HCl 緩沖液較Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液對酶活的抑制作用更強(qiáng)。

5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶在各自最適pH 下，孵育不同時間后測定其pH 穩(wěn)定性，孵育時間-相對酶活曲線如圖4 所示。 KP 在孵育3～6 h 后相對酶活迅速下降至47%，在孵育15 h 后相對酶活下降至27%。隨著孵育時間的延長，BC1、BC2、BS1、BS2 的相對酶活均緩慢下降，孵育15 h 后相對酶活分別降至80%、64%、79%、67%，說明這4 種酶的pH 穩(wěn)定性高于KP。

圖4 5 種寡聚-1,6-糖苷酶在各自最適pH 下的穩(wěn)定性Fig. 4 Stability of five oligo-1,6-glycosidases at their optimum pH

2.3.2 最適溫度及熱穩(wěn)定性 在30～64 ℃溫度范圍內(nèi)，5 種寡聚-1,6-糖苷酶的溫度-相對酶活曲線如圖5所示。BC1 和BC2 從30 ℃開始隨著溫度升高相對酶活逐漸增加，56 ℃為最適反應(yīng)溫度，此時相對酶活達(dá)到最高，在60 ℃ BC1 和BC2 仍分別有74%和94%相對酶活。KP 從48 ℃升溫到52 ℃時相對酶活大幅提升，60 ℃為其最適反應(yīng)溫度，相對酶活達(dá)到最高，在64 ℃仍有78% 的相對酶活。BS1、BS2 的最適溫度均為43 ℃，隨著溫度繼續(xù)升高相對酶活迅速降 低。綜 上，BC1、BC2、KP 為 嗜 熱 性 酶，BS1、BS2 為嗜溫性酶。

圖5 5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶最適溫度Fig. 5 Optimum temperature of five oligo-1,6-glucosidases

5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶在各自最適條件下孵育不同時間后測定其熱穩(wěn)定性，孵育時間-相對酶活曲線如圖6 所示。BS1 在43 ℃孵育2 min 時相對酶活急速下降，孵育20 s 時相對酶活迅速降至50%。BC1在孵育1 min 時相對酶活降至50% 以下，BC2 在孵育1.5 min 時相對酶活降至50%以下。BC1、BC2 和BS1 在孵育5 min 時都幾乎失活。相比之下，BS2 在孵育0.5 h 時相對酶活降至35%，孵育2 h 時相對酶活幾乎為0。KP 在孵育0.5 h 時仍有60%以上的相對酶活，隨后酶活隨孵育時間的延長而緩慢降低，孵育2 h 時相對酶活降至31%，表現(xiàn)出了較高的熱穩(wěn)定性。

圖6 5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶在各自最適溫度下的熱穩(wěn)定性Fig. 6 Thermostability of five oligo-1,6-glucosidases at their optimum temperatures

Suzuki 等[4]在深入研究比較了來源于不同芽孢桿菌的寡聚-1,6-葡糖苷酶的氨基酸組成、結(jié)構(gòu)參數(shù)和熱穩(wěn)定性后提出了脯氨酸法則，即增加氨基酸序列中脯氨酸殘基的摩爾分?jǐn)?shù)可以提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶的脯氨酸摩爾分?jǐn)?shù)及熱穩(wěn)定性關(guān)系如表2 所示。由表2 可見，KP 的脯氨酸摩爾分?jǐn)?shù)最高，其最適溫度及熱穩(wěn)定性明顯高于其他寡聚-1,6-糖苷酶。BC1、BC2 及BS1 的脯氨酸摩爾分?jǐn)?shù)較低，相應(yīng)的熱穩(wěn)定性也較低，其中BC1 的相對酶活衰減速度明顯快于其他酶，符合脯氨酸法則對這些酶的熱穩(wěn)定性的預(yù)測。

表2 5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶的脯氨酸摩爾分?jǐn)?shù)與熱穩(wěn)定性Table 2 Proline molar fraction and thermostability of five oligo-1,6-glucosidases

Zn2+對這5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶都有強(qiáng)烈的抑制作用，其中使BS2 的相對酶活降低了99.32%。Zn2+被報道對許多酶的活性均具有抑制作用[17-19]，可能是因?yàn)閆n2+易與蛋白酶親和而改變酶的構(gòu)象，從而抑制了酶的活性[20]。除Zn2+以外，Ni+也有普遍的抑制作用，其作為重金屬離子的作用可能與Zn2+相似[21]。Cu2+對5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶都呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，但由于Cu2+在反應(yīng)體系中產(chǎn)生沉淀會影響酶活的檢測，其抑制程度不能精確確定。

表3 離子對5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶相對酶活的影響Table 3 Effects of ions on relative enzyme activities of five oligo-1,6-glucosidases

2.3.5 底物特異性 在凝結(jié)芽孢桿菌利用玉米粉水解液進(jìn)行乳酸發(fā)酵過程中，發(fā)酵后期發(fā)酵液中的菌體難以利用的殘?zhí)侵饕挟慃溠刻牵ê?1,6-糖苷鍵）、蔗糖（含α-1,2-糖苷鍵）、麥芽糖（含α-1,4-糖苷鍵）以及海藻糖（含α-1,1-糖苷鍵）[3]。因此選取以上發(fā)酵液殘?zhí)侵泻枯^高的糖類，同時還選取了乳糖（含β-1,6-糖苷鍵）以及可溶性直鏈淀粉（含α-1,4-糖苷鍵）作為底物來測定分析底物的特異性。如表5 所示，5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶水解其他底物時的酶活相對于水解pNPG 時的酶活較低。BC1、BC2、KP、BS1 對異麥芽糖都有水解活性，只有BS2 未檢測到該活性。其中BC1 對異麥芽糖的水解活性最高，酶活達(dá)到了（12.82±0.08）mmol/(min·g)，其次是KP，酶活達(dá)到了（7.24±1.35）mmol/(min·g)。5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶對麥芽糖都有催化水解的活性，其中BS2 催化水 解 麥 芽 糖 的 酶 活 高 達(dá)(4.11±0.04)mmol/(min·g)。此外，BC1、KP、BS1 還具備一定的催化水解蔗糖的活性。而5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶都不具備催化水解乳糖、海藻糖及可溶性直鏈淀粉活性的性能。

表4 5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶酶動力學(xué)參數(shù)Table 4 Enzyme kinetic parameters of five oligo-1,6-glucosidases

表5 5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶的底物特異性Table 5 Substrate specificity of five oligo-1,6-glucosidases

3 結(jié) 論

（1）以pET-22b(+) 作為表達(dá)載體分別構(gòu)建了來源 于Bacillus coagulansATCC 7050（BC1、BC2）、Bacillus thermoglucosidasiusKP 1006（KP）和Bacillus subtilis168（BS1、BS2）的5 個寡聚-1,6-葡糖苷酶基因的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，在E. coliBL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，并利用鎳柱親和層析方法進(jìn)行純化。純化后5 種寡聚-1,6-葡糖苷酶BC1、BC2、KP、BS1、BS2對水解pNPG 的酶活分別達(dá)到了(3 385.51 ± 39.26)、(36.57 ± 1.94)、(5 657.29 ± 50.64)、(759.58 ± 73.50)、(114.70 ± 7.57) mmol/(min·g)。