谷氨酸棒桿菌GPAT 功能基因鑒定與分析

劉翠翠， 李友元， 王永紅

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

生物柴油是由動(dòng)植物油脂、微生物油脂及一些垃圾油脂等可再生物質(zhì)通過(guò)酯交換過(guò)程得到的一種環(huán)境友好型燃料[1-2]。微生物油脂具有生產(chǎn)周期短、可連續(xù)生產(chǎn)、可規(guī)?；米匀唤绲呢S富資源等特點(diǎn)，脂肪酸組成也易通過(guò)基因工程手段進(jìn)行改造，因而微生物油脂成為第三代生物柴油重要的原料來(lái)源[3]。本實(shí)驗(yàn)室前期利用食品級(jí)安全菌株谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum）通過(guò)理性的基因改造手段獲得了產(chǎn)油菌株CT14，顯示了谷氨酸棒桿菌作為微生物油脂生產(chǎn)菌的潛力，有必要進(jìn)一步研究其作為產(chǎn)油微生物的宿主菌對(duì)微生物油脂的合成與調(diào)控機(jī)制[4]。

甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（GPAT）催化3-磷酸甘油和脂肪酰基輔酶A 生成溶血磷脂酸（LPA），是甘油三酯和甘油磷脂合成的第一步反應(yīng)且可能為限速步驟[5]，在油脂的合成過(guò)程中起重要作用[6]。研究表明，在集胞藻PCC6803 中，GPAT 的編碼基因被驗(yàn)證是該菌油脂合成的重要基因[7]。Paya 等[8]在酵母中過(guò)表達(dá)向日葵gpat9(Hagpat9)基因，使酵母三酰基甘油（TAG）總量增加，并且脂肪酸組分也發(fā)生了改變。然而，KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，在谷氨酸棒桿菌的基因組中沒有明確標(biāo)注的GPAT 的功能基因。Holder 等[9]通過(guò)比較谷氨酸棒桿菌與其他產(chǎn)油微生物的功能基因組后也指出谷氨酸棒桿菌缺少GPAT 的功能基因（EC 2.3.1.15）。但正如文獻(xiàn)[4]中所指出的GPAT 是微生物細(xì)胞膜脂質(zhì)合成途徑中的重要酶，谷氨酸棒桿菌能正常生長(zhǎng)，說(shuō)明谷氨酸棒桿菌肯定存在類似GPAT功能的蛋白。為了深入理解谷氨酸棒桿菌的油脂合成途徑，進(jìn)一步提升產(chǎn)油脂性能，有必要研究谷氨酸棒桿菌中GPAT 的功能基因。

本文首先基于文獻(xiàn)和生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)了CorynebacteriumglutamicumATCC13032 編碼GPAT的多個(gè)候選功能基因，并選擇其中之一cg2777基因進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證；然后利用基因工程手段敲除及過(guò)表達(dá)谷氨酸棒桿菌的GPAT編碼cg2777，結(jié)合發(fā)酵分析鑒定并研究谷氨酸棒桿菌中GPAT 的功能基因，為深入解析谷氨酸棒桿菌的油脂合成分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

本實(shí)驗(yàn)中所使用的菌株、質(zhì)粒和引物均列于表1。

表1 本文所用菌株、質(zhì)粒和引物的基因型和來(lái)源Table 1 Genotype and source of strains, plasmids and primers in this work

1.2 試劑和培養(yǎng)基

限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶、Gibson 組裝試劑盒、Phusion 超保真DNA 聚合酶、去磷酸化酶，均購(gòu)于NEB（北京）有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA 純化回收試劑盒，購(gòu)于TIANGEN 生物科技公司；X-gal、山梨醇、萘啶酮酸、硫酸卡那霉素，購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；牛腦心浸粉，購(gòu)于美國(guó)BD 公司；其余試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基、牛心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHIS）、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基，見參考文獻(xiàn)[4]。

1.3 谷氨酸棒桿菌的GPAT 生物信息學(xué)分析

使用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行GPAT 的編碼基因的尋找；利用MEGA-X 軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)分析；利用TMHMM Server 2.0 在線軟件預(yù)測(cè)分析GPAT基因編碼的蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)，TMHMM 軟件可以區(qū)分外周膜蛋白和內(nèi)在膜蛋白。

1.4 方法

1.4.1 一般操作 DNA 片段的回收、酶切、純化、連接，大腸桿菌質(zhì)粒抽提和轉(zhuǎn)化，瓊脂糖凝膠電泳，感受態(tài)制備與轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)操作均參見文獻(xiàn)[4]。

1.4.2 重組質(zhì)粒pZ8-TAG4-cg2777 的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化以谷氨酸棒桿菌基因組DNA 為模板，用引物對(duì)cg2777-FOR/REV 擴(kuò)增基因cg2777，其片段大小為974 bp。將PstⅠ單酶切載體質(zhì)粒pZ8-TAG4 和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)目的片段純化后利用Gibson 無(wú)縫克隆試劑盒連接，獲得重組質(zhì)粒pZ8-TAG4-cg2777。將重組質(zhì)粒pZ8-TAG4-cg2777 通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)到谷氨酸棒桿菌CG14。在含50 μg/mL 卡那霉素的牛心浸液肉湯或瓊脂平板上篩選，并通過(guò)菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4.3 重組質(zhì)粒pK18mobsacB-cg2777 的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

以谷氨酸棒桿菌基因組DNA 為模板，用引物對(duì)cg2777-D1/D2 擴(kuò)增基因cg2777的上游片段62 bp，用引物對(duì)cg2777-D3/D4 擴(kuò)增基因cg2777的下游片段547 bp。由于兩段PCR 產(chǎn)物含有20 bp 左右的同源序列，因此將兩段PCR 產(chǎn)物切膠回收，等量混合作為模板，以cg2777-D1/D4 為引物進(jìn)行重疊PCR。最終的PCR 產(chǎn)物通過(guò)XbaⅠ和SbfⅠ雙酶切后與相同酶切的質(zhì)粒pK18mobsacB 進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pK18mobsacB-cg2777?；谕粗亟M方法對(duì)基因cg2777進(jìn)行敲除[10]。通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法將敲除質(zhì)粒pK18mobsacB-cg2777 轉(zhuǎn)到谷氨酸棒桿菌CG14。在含50 μg/mL 卡那霉素的BHIS 平板上篩選已產(chǎn)生第1 次重組的卡那霉素抗性克隆。隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子接種到LB 培養(yǎng)基中。30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h 后涂布于含10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）蔗糖的BHIS 平板上，篩選已產(chǎn)生第2 次重組的克隆。將轉(zhuǎn)化子分別轉(zhuǎn)接到含50 μg/mL卡那霉素的平板和10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）蔗糖的平板上，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子的卡那霉素和蔗糖抗性，其中具有蔗糖抗性，且對(duì)卡那霉素敏感的克隆即為已發(fā)生了敲除的克隆，并通過(guò)菌落PCR 進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4.4 分析方法 采用上海儀電721G 分光光度計(jì)測(cè)定菌體濃度；用微量pH 計(jì)直接測(cè)定pH 值。菌體干重測(cè)定：取干燥不帶蓋子的15 mL 離心管若干稱重（需要用分析天平）；稱取合適時(shí)間的發(fā)酵菌液5 mL并在3 500 r/min 下離心10 min 與上清液分開，在菌體中加3 mL 超純水重懸；液氮速凍后于四環(huán)凍干儀中干燥48 h（需要提前預(yù)冷，使溫度降至-50 ℃以下）；用分析天平稱重，減去離心管質(zhì)量即為菌體干重。胞內(nèi)外脂肪酸測(cè)定：采用氣相色譜法測(cè)定，色譜條件：色譜柱為HP-5，柱箱溫度220 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃，進(jìn)樣器溫度250 ℃，進(jìn)樣口分流體積比20∶1，進(jìn)樣體積1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 GPAT 的功能基因預(yù)測(cè)

如前文所述，來(lái)自于KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)和其他研究者的研究發(fā)現(xiàn)，在谷氨酸棒桿菌ATCC13032 的基因組中沒有明確標(biāo)注的GPAT 的功能基因。因此，常規(guī)的同源多序列搜索未能發(fā)現(xiàn)有效的候選序列，必須采用其他的間接搜索方法。

首先，對(duì)模式生物大腸桿菌的GPAT 蛋白研究發(fā)現(xiàn)，其結(jié)合底物3-磷酸甘油可能依賴于HXXXXD序列（“X”代表任意氨基酸）。前期嘗試使用一級(jí)序列進(jìn)行直接預(yù)測(cè)，使用UniProt 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)上CorynebacteriumglutamicumATCC 13032 的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，對(duì)所有序列進(jìn)行HXXXXD 搜索，得到了接近1 100 條含有HXXXXD 的序列，由于HXXXXD單獨(dú)一個(gè)模塊復(fù)雜性較低，可能的序列以及錯(cuò)誤匹配較多，工作量巨大，先行放棄這一策略。

GPAT 是微生物細(xì)胞膜脂質(zhì)合成途徑中的重要酶，因此我們大膽猜測(cè)GPAT 蛋白定位是在細(xì)菌內(nèi)膜上。M?ker 等[11]通過(guò)研究谷氨酸棒桿菌的MtrAMtrB 二元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)攜帶有mtrAB 雙缺失的谷氨酸棒桿菌突變體細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞變性拉長(zhǎng)到野生型菌株的3 倍，說(shuō)明缺失株可能作用在細(xì)胞壁上，導(dǎo)致菌株不能正常進(jìn)行細(xì)胞分裂，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)mtrAB 缺失株對(duì)作用于細(xì)胞壁的抗生素有更高的靈敏度，包括青霉素、萬(wàn)古霉素和溶菌酶，這表明突變體的細(xì)胞壁有損傷，除了功能明確的蛋白酶、脂酶受影響以外，還有一部分功能不明確的基因，其中假定蛋白CG2777（NCgl2434）是假定膜蛋白。Brocker 等[12]進(jìn)一步考察了與MtrA-MtrB 二元轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)有關(guān)的目標(biāo)基因等信息，共發(fā)現(xiàn)4 種(CG0896、CG2096、CG2777、CG3254)未知功能的假定膜蛋白受影響，其中后3 種受到抑制效果的蛋白中，CG2777受抑制效果最大，因此本文選擇CG2777 蛋白編碼基因cg2777進(jìn)行下一步分析與驗(yàn)證。

利用MEGA-X 軟件對(duì)谷氨酸棒桿菌的cg2777基因與9 種其他來(lái)源GPAT 的基因[9]進(jìn)行多序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌的cg2777基因序列前后缺失較長(zhǎng)片段，在中部存在多處插入和缺失（圖1），這也是常規(guī)多序列同源搜索無(wú)法找到該序列的原因。使用TMHMM 跨膜預(yù)測(cè)分析軟件分析目標(biāo)蛋白CG2777的跨膜結(jié)構(gòu)，如圖2 所示。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果分析目標(biāo)蛋白為插膜蛋白，具有4 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，氨基酸位置分別在92～129、130～153、186～221 和264～297。

圖1 cg2777 與GPAT 的同源基因多序列比對(duì)Fig. 1 Multi-sequence comparison between cg2777 and homologous GPAT genes

圖2 目標(biāo)蛋白跨膜預(yù)測(cè)Fig. 2 Target protein transmembrane prediction

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將上述重組質(zhì)粒分別通過(guò)電激轉(zhuǎn)化到谷氨酸棒桿菌CG14 感受態(tài)細(xì)胞得到重組菌株CT14+cg2777和CT14Δcg2777。將重組菌株在以葡萄糖為唯一碳源下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，并以CG14 菌株作為對(duì)照菌株，研究菌株GPAT 功能基因改造對(duì)其生長(zhǎng)情況、胞內(nèi)外脂肪酸合成的影響。

2.2.1 質(zhì)粒pZ8-TAG4-cg2777 的構(gòu)建 基因cg2777過(guò)表達(dá)引物序列如表1 所示，引物中的小寫字母為引物間的重疊互補(bǔ)序列，大寫加粗部分為谷氨酸棒桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）序列。以Corynebacterium glutamicumATCC13032 基因組為模板，利用引物對(duì)cg2777-FOR 和cg2777-REV 擴(kuò)增基因cg2777，其片段大小為974 bp。將PstⅠ單酶切載體質(zhì)粒pZ8-TAG4 和PCR 目的片段純化后利用Gibson 無(wú)縫克隆試劑盒連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，利用驗(yàn)證引物對(duì)PZ8-T2/T3 進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，其電泳圖如圖3 所示，陽(yáng)性克隆大小為1 244 bp，同時(shí)提取質(zhì)粒送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，經(jīng)過(guò)序列比對(duì)分析無(wú)突變點(diǎn)存在。

圖3 質(zhì)粒pZ8-TAG4-cg2777 菌落PCR 驗(yàn)證Fig. 3 Identification of plasmid pZ8-TAG4-cg2777 by colony PCR

2.2.2 質(zhì)粒pK18mobsacB-cg2777 的構(gòu)建 基因cg2777

上下同源臂引物序列如表1 所示，引物中小寫字母為引物間的重疊互補(bǔ)序列，用于上下游同源片段的融合，橫線標(biāo)示部分為引入的酶切位點(diǎn)且前面加有保護(hù)堿基。以Corynebacterium glutamicumATCC13032基因組為模板，用引物cg2777-D1 和c2777-D2 擴(kuò)增基因cg2777的上游片段562 bp，用引物cg2777-D3和cg2777-D4 擴(kuò)增基因cg2777的下游片段547 bp（見圖4（a））。將上下游片段切膠回收后作為模板，再利用引物對(duì)cg2777-D1/D4 擴(kuò)增上下游融合片段1 088 bp（見圖4（b））。最終的PCR 產(chǎn)物通過(guò)XbaⅠ和SbfⅠ雙酶切后與相同酶切的質(zhì)粒pK18mobsacB進(jìn)行連接，利用驗(yàn)證引物對(duì)PK18-T1/T2 進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，其電泳圖如圖5 所示，陽(yáng)性克隆大小為1 280 bp 同時(shí)提取質(zhì)粒送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，經(jīng)過(guò)序列比對(duì)分析無(wú)突變點(diǎn)存在。

圖4 cg2777 基因上下游同源臂融合PCRFig. 4 Fusion PCR of cg2777 gene upstream and downstream

圖5 質(zhì)粒pK18mobsacB-cg2777 菌落PCR 驗(yàn)證Fig. 5 Identification of plasmid pK18mobsacB-cg2777 by colony PCR

2.3 發(fā)酵驗(yàn)證

將上述重組質(zhì)粒分別通過(guò)電激轉(zhuǎn)化到谷氨酸棒桿菌CG14 感受態(tài)細(xì)胞得到重組菌株CT14+cg2777和CT14Δcg2777。將重組菌株在以葡萄糖為唯一碳源下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，并以CT14 菌株作為對(duì)照菌株，研究菌株GPAT 功能基因改造對(duì)其生長(zhǎng)情況、胞內(nèi)外脂肪酸合成的影響。

2.3.1 GPAT 的功能基因?qū)晟L(zhǎng)情況的影響 搖瓶發(fā)酵所采用的培養(yǎng)基為CASO 種子培養(yǎng)基和CGXII發(fā)酵培養(yǎng)基，以40 g/L 葡萄糖作為唯一碳源。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案，菌株在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h 后，在菌濃（OD600）為5 左右進(jìn)行轉(zhuǎn)接使二級(jí)發(fā)酵初始OD600為0.3 左右，將搖瓶置于30 ℃、220 r/min 條件下進(jìn)行培養(yǎng)。改造株的生長(zhǎng)狀況如圖6 所示，可見CT14Δcg2777菌株明顯生長(zhǎng)緩慢并且發(fā)酵上清液中有乳白色渾濁，可能是菌株細(xì)胞膜受損有脂質(zhì)類物質(zhì)溢出，這符合我們的預(yù)測(cè)：基因cg2777除了行使GPAT 功能外還是膜蛋白基因，因此敲除此基因會(huì)影響細(xì)胞膜生成進(jìn)而影響菌株生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)阻斷甘油三酯合成途徑導(dǎo)致前體3-磷酸甘油和?；o酶A 不能大量合成油脂，而造成脂質(zhì)類物質(zhì)大量外溢。

圖6 不同谷氨酸棒桿菌菌株培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)曲線和pH 變化Fig. 6 Growth curve and pH change in different Corynebacterium glutamicum strains

同時(shí)，對(duì)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的菌株CT14Δcg2777和對(duì)照菌株CT14 進(jìn)行電鏡掃描分析，其結(jié)果如圖7 所示，可見對(duì)照菌株CT14 的細(xì)胞大小比較均一圓潤(rùn)，而CT14Δcg2777突變株細(xì)胞形態(tài)發(fā)生很大變化，細(xì)胞拉長(zhǎng)變形出現(xiàn)不規(guī)則形狀，且有很多細(xì)胞碎片存在，說(shuō)明基因cg2777的缺失影響了細(xì)胞膜脂質(zhì)的合成，導(dǎo)致細(xì)胞膜不完整且易于破裂。

圖7 CT14 和CT14Δcg2777 的電鏡掃描結(jié)果Fig. 7 SEM of CT14 and CT14Δcg2777

2.3.2 GPAT 的功能基因?qū)臧麅?nèi)外脂肪酸的影響

分析發(fā)酵48、60 h 時(shí)上述改造株總脂肪酸質(zhì)量濃度和菌體脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如圖8 所示，其中菌體脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為胞內(nèi)脂肪酸質(zhì)量與菌體干重之比，同時(shí)分析發(fā)酵60 h 時(shí)上述改造株胞外脂肪酸情況（圖9）。比較圖8 和圖9 可以看出，CT14Δcg2777突變株發(fā)酵48 h 時(shí)總脂肪酸質(zhì)量濃度和菌體脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)都很低，總脂肪酸質(zhì)量濃度僅有對(duì)照株CT14 的1/4 左右，菌體脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)是對(duì)照菌株質(zhì)量分?jǐn)?shù)的1/2；發(fā)酵培養(yǎng)延遲到60 h，對(duì)照菌株CT14 的脂肪酸變化穩(wěn)定，CT14Δcg2777突變株總脂肪酸質(zhì)量濃度和菌體脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)只有少量增加，這符合我們的猜測(cè)：cg2777基因是一個(gè)膜蛋白基因，影響菌株細(xì)胞膜脂質(zhì)的合成，進(jìn)而影響菌株生長(zhǎng)以及脂肪酸的合成。CT14+cg2777突變株與對(duì)照株CT14 相比，其脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)并沒有很大變化，且胞外游離脂肪酸的質(zhì)量濃度僅減少7.1%（圖8（a）），由此推測(cè)，基因cg2777行使GPAT 功能，但是油脂合成是一個(gè)多酶合作的復(fù)雜體系，單一過(guò)表達(dá)GPAT的編碼基因cg2777并不能明顯地提高油脂的含量。

圖8 不同谷氨酸棒桿菌菌株培養(yǎng)48 h(a)、60 h(b)的總脂肪酸質(zhì)量濃度和菌體脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig. 8 Mass concentration of total intracellular fatty acids and mass fraction of fatty acids in different Corynebacterium glutamicum strains cultured for 48 h(a) and 60 h(b)

圖9 不同谷氨酸棒桿菌菌株培養(yǎng)60 h 的胞外脂肪酸質(zhì)量濃度Fig. 9 Mass concentration of extracellular fatty acids in different Corynebacterium glutamicum strains cultured for 60 h

3 結(jié) 論

本研究基于文獻(xiàn)查閱和生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)了Corynebacterium glutamicumATCC13032 編碼GPAT的多個(gè)候選功能基因，并選擇其中之一cg2777基因進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。多序列比對(duì)結(jié)果表明，該基因中間的折疊區(qū)域存在大量的功能保守序列?？缒そY(jié)構(gòu)分析表明，CG2777蛋白存在4 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，這與AtGPAT9 蛋白存在3～4 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的特征一致[13]。通過(guò)對(duì)預(yù)測(cè)的GPAT 的編碼基因cg2777敲除和過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)基因cg2777的敲除會(huì)嚴(yán)重影響菌體增值，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生很大改變，胞外游離脂肪酸和總脂肪酸含量很低，這與羅泉[14]在集胞藻PCC6803 中關(guān)閉GPAT 的編碼基因會(huì)破壞類囊體膜結(jié)構(gòu)，生長(zhǎng)緩慢的現(xiàn)象一致；而基因cg2777的過(guò)表達(dá)，僅使胞外游離脂肪酸微量減少，總脂肪酸含量沒有變化。由此推測(cè)，基因cg2777行使GPAT 功能，但是油脂合成是一個(gè)多酶合作的復(fù)雜體系，單一過(guò)表達(dá)GPAT 的編碼基因cg2777并不能明顯提高油脂含量。本研究為今后利用基因工程手段提高微生物油脂含量提供了方向，同時(shí)為進(jìn)一步揭示谷氨酸棒桿菌油脂合成的分子機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。