扶正抗癌方通過(guò)miR221-3p/p27Kip1阻滯H460細(xì)胞周期的機(jī)制研究

李龍妹，甘紫胭，楊小兵，河文峰，廖桂雅，李秋萍，吳萬(wàn)垠

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510370）

扶正抗癌方是廣東省名中醫(yī)吳萬(wàn)垠教授總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，該方遵循中醫(yī)整體觀和辨證論治理念，目前已作為顆粒制劑廣泛用于臨床治療。前期臨床研究中，扶正抗癌方聯(lián)合吉非替尼可延長(zhǎng)非小細(xì)胞肺癌患者中位疾病無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間以及中位生存時(shí)間[1]；基礎(chǔ)研究中，扶正抗癌方可通過(guò)AMPKα-IGFBP1-FOXO3α和SAPK/JNK-Sp1通路抑制細(xì)胞增殖[2-3]，協(xié)同吉非替尼通過(guò)Akt-p65-MUC1通路抑制細(xì)胞增殖[4]，逆轉(zhuǎn)EMT抑制NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移[5-7]，激活Caspase-3、Bax誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡[8]，通過(guò)cMet通路逆轉(zhuǎn)NSCLC細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥[9]。但扶正抗癌方是否可通過(guò)阻滯細(xì)胞周期抑制增殖未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究以H460人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)扶正抗癌方對(duì)細(xì)胞增殖和周期的影響，并進(jìn)一步探討了扶正抗癌方對(duì)miR221-3p、細(xì)胞周期依賴性激酶抑制物p27Kip1、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細(xì)胞周期蛋白E（Cyclin E）、細(xì)胞周期依賴性激酶2（CDK2）和細(xì)胞周期依賴性激酶4（CDK4）的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 H460人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）。細(xì)胞培養(yǎng)：37 ℃、5% CO2，RPMI-1640培養(yǎng)基+10% 胎牛血清+100 U/mL的青霉素與100 mg/mL的鏈霉素。細(xì)胞傳代：棄舊培養(yǎng)基，PBS沖洗，胰酶消化后，吹打至單細(xì)胞懸液，按1∶3傳代至新培養(yǎng)皿或按照實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行細(xì)胞處理。

1.1.2藥物和試劑 扶正抗癌方顆粒（批號(hào)：J1708002），廣東一方制藥有限公司制備，具體方藥及藥物配制詳見(jiàn)文獻(xiàn)[8]。GAPDH（D16H11）XP? Rabbit mAb（ 批 號(hào)：5174）、CDK2 （E8J9T）XP? Rabbit mAb （批 號(hào)：18048）、CDK4 （D9G3E）Rabbit mAb（ 批 號(hào)：12790）、Cyclin D1 （E3P5S）XP? Rabbit mAb（批號(hào)：55506）、Cyclin E （D7T3U）Rabbit mAb（批號(hào)：20808）、p27Kip1（D69C12） XP?Rabbit mAb（批號(hào)：3686）均購(gòu)于美國(guó)CST公司；RPMI-1640培養(yǎng)基（批號(hào)：8119305）、胎牛血清（批號(hào)：10270-106）、胰酶（批號(hào)：25200-072）均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；2×mRNA Universal SYBR? qPCR Master Mix（批 號(hào)：MQ101-01）、miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （by stem-loop）（批號(hào)：MR101-02）均購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；riboFECT CP Transfection Kit（333T）（批號(hào)：c10511-1）購(gòu)于廣州銳博生物科技公司；miR221的引物及內(nèi)參U6引物、miR221 inhibitor 及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成。

1.1.3主要儀器 ChemiDoc XRS+型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、1658033型垂直電泳系統(tǒng)及1703940型半干轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；Cytomics FC500型流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼公司）；CountStar型全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Inno-Aliance Biotech公司）；Eon.C型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTEK公司）；5430R型冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；ABI7500型熒光定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

1.2 方法

1.2.1CCK8檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的H460細(xì)胞，培育24 h，分別加入0.1 mL濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的扶正抗癌方藥液，分別培養(yǎng)24、48 h，加入100 μL CCK8試劑，1 h后酶標(biāo)儀（450 nm波長(zhǎng)）檢測(cè)光密度值。細(xì)胞存活率 =給藥組光密度值/對(duì)照組光密度值×100%。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的H460細(xì)胞，培育24 h，分別加入2 mL濃度為0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的扶正抗癌方藥液，24 h后，胰酶消化，以培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，輕彈管壁，使沉淀重懸于殘液中，加入1 mL室溫下的PBS緩沖液。將細(xì)胞緩慢加入至提前-20 ℃預(yù)冷的3 mL無(wú)水乙醇中，邊加入邊高速攪拌，過(guò)夜。第二天，將固定的細(xì)胞離心，棄乙醇，輕彈管壁使沉淀松散，加入室溫下PBS緩沖液，放置15 min使細(xì)胞水化，離心，棄上清。加入1 mL DNA staining solution，渦旋震蕩5 ～ 10 s。室溫避光孵育30 min，流式機(jī)上樣。

1.2.3Real-time PCR檢 測(cè)miR221-3p及p27Kip1mRNA的表達(dá) 收集樣品，Trizol法試劑提取細(xì)胞總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄過(guò)程采用miRNA特異性引物構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄體系，條件按試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。擴(kuò)增時(shí)miRNA以U6位內(nèi)參照基因，mRNA以GAPDH位內(nèi)參照基因，結(jié)果利用2-△△Ct計(jì)算?；蛞镄蛄腥绫?所示。

表1 引物序列Tab. 1 The primer sequence

1.2.4Western blot檢 測(cè) p27Kip1、Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的H460細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)和給藥同“1.2.2”；ripa裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；蛋白樣品上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗搖床孵育2 h，4 ℃過(guò)夜，加入二抗搖床孵育1 h；ECL化學(xué)發(fā)光法在凝膠成像系統(tǒng)中成像，Image Lab分析數(shù)據(jù)。

1.2.5瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 利用化學(xué)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，采用lipo3000和 riboFECT CP兩種轉(zhuǎn)染試劑，其中，轉(zhuǎn)染miR221-3p的mimic和inhibitor采用riboFECT CP轉(zhuǎn)染試劑，其它的采用lipo3000轉(zhuǎn)染試劑，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.6熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR221-3p是否與p27Kip13’UTR的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合 將樣品按照Luc-Pair Duo-Luciferase HS Assay Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，對(duì)細(xì)胞提取物中的熒光素酶活性進(jìn)行分析。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 扶正抗癌方對(duì)H460細(xì)胞增殖的影響

與空白對(duì)照組比較，扶正抗癌方組（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL）中H460細(xì)胞的存活率下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01），且隨著給藥濃度的增加，細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)；同時(shí)，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率也呈下降趨勢(shì)，見(jiàn)表2。結(jié)果表明，扶正抗癌方能夠抑制H460細(xì)胞的增殖，且呈濃度和時(shí)間依賴性。

表2 扶正抗癌方對(duì)H460細(xì)胞存活率的影響（± s, n = 3）Tab. 2 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on cell viability in H460 cells（± s, n = 3）

表2 扶正抗癌方對(duì)H460細(xì)胞存活率的影響（± s, n = 3）Tab. 2 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on cell viability in H460 cells（± s, n = 3）

注：與空白對(duì)照組比較，**P < 0.01

組別 濃度/（mg/mL） 24 h存活率/% 48 h存活率/%空白對(duì)照組 - 100.00 ± 0.00 100.00 ± 0.00扶正抗癌方組 0.5 94.73 ± 3.80 82.96 ± 2.64**1.0 87.87 ± 2.42** 77.11 ± 1.48**1.5 67.60 ± 3.99** 61.31 ± 9.25**2.0 59.25 ± 6.40** 57.01 ± 3.27**2.5 53.64 ± 4.96** 48.29 ± 2.95**3.0 44.69 ± 4.58** 38.11 ± 6.06**F 80.252 64.023 P＜0.001 ＜0.001

2.2 扶正抗癌方對(duì)H460細(xì)胞周期的影響

與空白對(duì)照組比較，扶正抗癌方組（1.5、2.0、2.5 mg/mL）中G0/G1期的細(xì)胞增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），S期的細(xì)胞減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），G2/M期的細(xì)胞無(wú)顯著變化；且隨著給藥濃度的增加，G0/G1期的細(xì)胞逐漸增加，S期的細(xì)胞逐漸減少，見(jiàn)如圖1、表3。結(jié)果表明，扶正抗癌方能夠?qū)460細(xì)胞阻滯在G0/G1期以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，且呈濃度依賴性。

圖1 扶正抗癌方對(duì)H460細(xì)胞周期的影響（± s, n = 3）Fig.1 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on cell cycle in H460 cells（± s, n = 3）

表3 扶正抗癌方對(duì)H460細(xì)胞周期的影響（± s, n = 3）Tab. 3 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on cell cycle in H460 cells（± s, n = 3）

表3 扶正抗癌方對(duì)H460細(xì)胞周期的影響（± s, n = 3）Tab. 3 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on cell cycle in H460 cells（± s, n = 3）

注：與空白對(duì)照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

細(xì)胞數(shù)量/個(gè)G0/G1 S G2/M空白對(duì)照組 - 52.00 ± 1.00 26.33 ± 1.53 21.67 ± 0.58扶正抗癌方組 1.5 55.00 ± 1.00* 23.33 ± 1.15* 21.67 ± 0.58 2.0 60.67 ± 1.53** 16.67 ± 0.58** 22.67 ± 1.15 2.5 64.33 ± 1.53** 13.67 ± 1.15** 22.00 ± 1.00 F 55.333 76.833 0.889 P＜0.001 ＜0.001 0.487組別 濃度/（mg/mL）

2.3 扶正抗癌方對(duì)Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較， 扶正抗癌方組 （2.0、 2.5 mg/mL）中Cyclin D1、Cyclin E、CDK2和CDK4蛋白的表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），且隨著給藥濃度的增加，上述蛋白的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，見(jiàn)圖2、表4。結(jié)果表明，扶正抗癌方能夠下調(diào)Cyclin D1、Cyclin E、CDK2和CDK4蛋白的表達(dá)，且呈濃度依賴性。

表4 扶正抗癌方對(duì)Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4蛋白表達(dá)的影響（± s, n = 3）Tab. 4 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on the protein expression of Cyclin D1, Cyclin E, CDK2 and CDK4（± s, n = 3）

表4 扶正抗癌方對(duì)Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4蛋白表達(dá)的影響（± s, n = 3）Tab. 4 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on the protein expression of Cyclin D1, Cyclin E, CDK2 and CDK4（± s, n = 3）

注：與空白對(duì)照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

組別 濃度/（ mg/mL） Cyclin D1/% Cyclin E/% CDK2/% CDK4/%空白對(duì)照組 - 100.00 ± 0.00 100.00 ± 0.00 100.00 ± 0.00 100.00 ± 0.00扶正抗癌方組 1.5 80.46 ± 15.32 91.45 ± 9.99 63.97 ± 17.37* 77.22 ± 18.29 2.0 58.72 ± 18.10* 60.19 ± 17.34* 59.26 ± 15.07** 67.35 ± 8.48**2.5 45.61 ± 5.48** 48.72 ± 10.03** 50.62 ± 7.51** 49.69 ± 5.99**F 11.654 14.414 9.685 11.940 P 0.003 0.001 0.005 0.003

圖2 扶正抗癌方對(duì)Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4蛋白表達(dá)的影響（± s, n = 3）Fig.2 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on the protein expression of Cyclin D1, Cyclin E, CDK2 and CDK4（± s, n = 3）

2.4 扶正抗癌方對(duì)p27Kip1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，扶正抗癌方組（2.0 mg/mL）中p27Kip1的mRNA表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）；扶正抗癌方組（1.5、2.0、2.5 mg/mL）中p27Kip1蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），且隨著給藥濃度的增加，p27Kip1蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì)，見(jiàn)圖3、表5。結(jié)果表明，扶正抗癌方能夠在基因及蛋白質(zhì)水平上調(diào)p27Kip1的表達(dá)，且呈濃度依賴性。

表5 扶正抗癌方對(duì)p27Kip1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響（± s, n = 3）Tab. 5 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on the mRNA and protein expression of p27Kip1（± s, n = 3）

表5 扶正抗癌方對(duì)p27Kip1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響（± s, n = 3）Tab. 5 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on the mRNA and protein expression of p27Kip1（± s, n = 3）

注：與空白對(duì)照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；“-”表示沒(méi)有做相關(guān)實(shí)驗(yàn)

組別 濃度/（ mg/mL） p27Kip1 mRNA/% p27Kip1 /%空白對(duì)照組 - 100.00 ± 0.00 100.00 ± 0.00扶正抗癌方組 1.5 - 128.62 ± 19.01*2.0 242.69 ± 40.09** 178.98 ± 13.05**2.5 - 262.79 ± 18.81**F/t 6.165 69.040 P 0.004 ＜0.001

圖3 扶正抗癌方對(duì)p27Kip1蛋白表達(dá)的影響（± s, n = 3）Fig.3 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on the expression of p27Kip1（± s, n = 3）

2.5 扶正抗癌方對(duì)miR221-3p表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，扶正抗癌方組（2.0 mg/mL）中miR221-3p的表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01），見(jiàn)表6。結(jié)果表明，扶正抗癌方能夠抑制miR221-3p的表達(dá)。

表6 扶正抗癌方對(duì)miR221-3p表達(dá)的影響（± s, n = 3）Tab. 6 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on the expression of miR221-3p（± s, n = 3）

表6 扶正抗癌方對(duì)miR221-3p表達(dá)的影響（± s, n = 3）Tab. 6 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on the expression of miR221-3p（± s, n = 3）

組別 濃度/（ mg/mL） miR221-3p/%空白對(duì)照組 - 100.00 ± 0.00扶正抗癌方組 2.0 59.76 ± 2.03 t 34.401 P＜0.001

2.6 miR221-3p對(duì)p27Kip1 mRNA表達(dá)的影響

將miR221-3p mimics及相應(yīng)的陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染至H460細(xì)胞，48 h后發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組比較，miR221-3p mimics組中miR221-3p的表達(dá)提高約400倍，p27Kip1mRNA的表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01）。將miR221-3p inhibitor及相應(yīng)的陰性對(duì)照（nc-inhibitor組）轉(zhuǎn)染至H460細(xì)胞株，48 h后發(fā)現(xiàn)，與nc-inhibitor組比較，miR221-3p mimics組中miR221-3p的表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01），p27Kip1mRNA的表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01），見(jiàn)表7。結(jié)果表明，miR221-3p能夠靶向抑制p27Kip1mRNA的表達(dá)。

表7 miR221-3p對(duì)p27Kip1 mRNA表達(dá)的影響（± s, n = 3）Tab. 7 Effects of miR221-3p on the expression of p27Kip1 mRNA（± s, n = 3）

表7 miR221-3p對(duì)p27Kip1 mRNA表達(dá)的影響（± s, n = 3）Tab. 7 Effects of miR221-3p on the expression of p27Kip1 mRNA（± s, n = 3）

注：與陰性對(duì)照組比較，**P < 0.01；與nc-inhibitor組比較，#P < 0.05，##P < 0.01

組別 miR221-3p/% p27Kip1 mRNA/%陰性對(duì)照組 370.34 ± 147.55 100.00 ± 0.00 miR221-3p mimics組 144 800.00 ± 7 318.47** 50.08 ± 12.86**nc-inhibitor組 334.01 ± 90.72 100.00 ± 0.00 miR221-3p inhibitor組 84.84 ± 38.46# 369.95 ± 59.13##F 1169.458 69.113 P＜0.001 ＜0.001

2.7 miR221-3p與p27Kip1的結(jié)合位點(diǎn)驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證miR221-3p與p27Kip1的關(guān)系，根據(jù)軟件預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)序列構(gòu)建了p27Kip1野生型和突變型含雙熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒，分別檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR221-3p對(duì)轉(zhuǎn)染了p27Kip1野生型和突變型報(bào)告基因熒光素酶活性的影響。與陰性對(duì)照組比較，經(jīng)miR221-3p mimic處理后，轉(zhuǎn)染野生型報(bào)告基因質(zhì)粒的細(xì)胞熒光素酶活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01），轉(zhuǎn)染突變型報(bào)告基因質(zhì)粒的細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)顯著變化，見(jiàn)圖4、表8。結(jié)果表明，野生型p27Kip1存在與miR221-3p結(jié)合的點(diǎn)位，miR221-3p與p27Kip1結(jié)合后可靶向抑制p27Kip1的表達(dá)。

圖4 miR221-3p與p27Kip1野生型、突變型結(jié)合點(diǎn)位的示意圖Fig.4 Schematic diagram of the binding site between miR221-3p and p27Kip1 wild-type or mutant

表8 miR221-3p對(duì)p27Kip1野生型報(bào)告基因和突變型報(bào)告基因熒光素酶活性的影響（± s, n = 3）Tab. 8 Effects of miR221-3p on the luciferase activity of p27Kip1 in the wild-type and mutant（± s, n = 3）

表8 miR221-3p對(duì)p27Kip1野生型報(bào)告基因和突變型報(bào)告基因熒光素酶活性的影響（± s, n = 3）Tab. 8 Effects of miR221-3p on the luciferase activity of p27Kip1 in the wild-type and mutant（± s, n = 3）

p27Kip1 3UTR Mut luciferase activity/%陰性對(duì)照組 100.00 ± 0.00 100.00 ± 0.00 miR221-3p mimics組 58.99 ± 8.97 94.16 ± 5.87 t 7.914 1.722 P 0.001 0.160組別 p27Kip1 3UTR Wt luciferase activity/%

3 討論

細(xì)胞周期的調(diào)控點(diǎn)分別是由G1期進(jìn)入S期的G1/S檢測(cè)點(diǎn)和由G2期進(jìn)入M期的G2/M檢測(cè)點(diǎn)。在腫瘤細(xì)胞中，調(diào)控點(diǎn)功能異常，細(xì)胞周期無(wú)法停滯，從而導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方能夠以濃度和時(shí)間依賴性抑制H460細(xì)胞的增殖，且可提高G1期細(xì)胞數(shù)量，降低S期細(xì)胞數(shù)量，推斷其可調(diào)控G1/S檢測(cè)點(diǎn)阻滯細(xì)胞分裂由G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。

參與細(xì)胞周期調(diào)控的分子有細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）、細(xì)胞周期依賴性激酶（CDKs）和細(xì)胞周期依賴性激酶抑制物（CDKIs）。Cyclin D1和Cyclin E可分別與CDK4和CDK2結(jié)合，形成復(fù)合物，促使細(xì)胞分裂由G1期進(jìn)入S期[10]。Cyclin D1、Cyclin E、CDK4和CDK2在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，是預(yù)后不良的重要指標(biāo)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方能夠以濃度依賴性下調(diào)Cyclin D1、Cyclin E、CDK2和CDK4的表達(dá)。p27Kip1屬于CDKIs，是一種細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可與CyclinD1-CDK4和Cyclin E-CDK2復(fù)合物結(jié)合，阻斷復(fù)合物和ATP結(jié)合，阻滯細(xì)胞分裂由G1期進(jìn)入S期[12]。格列衛(wèi)就是將p27Kip1作為一個(gè)重要的靶點(diǎn)，通過(guò)阻滯細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方能夠以濃度依賴性上調(diào)p27Kip1mRNA及蛋白表達(dá)。

miRNAs可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白影響細(xì)胞周期。miR320a可通過(guò)FoxM1-p27Kip1調(diào)控胃癌增殖[14]，miR221可通過(guò)抑制p27Kip1促進(jìn)K562細(xì)胞增殖[15]。本研究利用軟件預(yù)測(cè)H460細(xì)胞中p27Kip1的上游miRNAs為miR221-3p，且扶正抗癌方能夠抑制miR221-3p的表達(dá)。進(jìn)一步過(guò)表達(dá)或沉默miR221-3p表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)p27Kip1mRNA的表達(dá)降低或增加，表明miR221-3p能夠靶向抑制p27Kip1mRNA的表達(dá)。同時(shí)，構(gòu)建p27Kip1野生型和突變型含雙熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR221-3p后，轉(zhuǎn)染野生型報(bào)告基因質(zhì)粒的細(xì)胞熒光素酶活性降低，而突變型熒光素酶活性無(wú)顯著變化，表明野生型p27Kip1存在與miR221-3p結(jié)合的點(diǎn)位。

4 結(jié)論

扶正抗癌方可通過(guò)下調(diào)miR221-3p的表達(dá)，靶向上調(diào)p27Kip1基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)，并進(jìn)一步調(diào)控下游Cyclin D1、Cyclin E、CDK2和CDK4蛋白的表達(dá)，使H460細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期而抑制細(xì)胞增殖。本研究對(duì)進(jìn)一步探明扶正抗癌方治療腫瘤的作用機(jī)制具有重要意義。