寧夏民間藥雞娃草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

莫 婷，何 婷，徐 靜，楊麗娟，楊 森，火明才，康菊英，盧海瑞，馬 力

（1. 寧夏回族醫(yī)藥研究所，寧夏 銀川750021； 2. 寧夏中醫(yī)醫(yī)院暨中醫(yī)研究院，寧夏 銀川 750021）

雞娃草為白花丹科雞娃草屬植物雞娃草Plumbagella micrantha（Ledeb.） Spach的全草，又名小藍(lán)雪花、刺礬松、藍(lán)雪草等，是雞娃草屬唯一品種，與白花丹屬親緣關(guān)系最近[1]。雞娃草在我國西北、西南地區(qū)分布廣泛，生于海拔2 000 ～ 3 500 m的山坡和田間。在寧夏省六盤山、南華山地區(qū)主要生長在鹽堿性地帶[2]。有文獻(xiàn)記載在俄羅斯西伯利亞阿爾泰邊疆地區(qū)及烏克蘭克里米亞半島的南部海岸地區(qū)亦有分布[3-4]。長期以來，寧夏地區(qū)民間常用雞娃草治療濕疹、手廯、足廯、神經(jīng)性皮炎等癥[5]，該藥材性寒，味苦，歸肺經(jīng)，具有解毒、止癢、殺蟲的功效，鮮品外用治療各種皮膚癬，以及疣痣、惡肉等病癥具有奇特療效[2]。但是，雞娃草缺乏相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，在歷版《中國藥典》及各地方標(biāo)準(zhǔn)中均未收載，且沒有指標(biāo)性成分用于該藥材的鑒別與質(zhì)量控制。

有報(bào)道發(fā)現(xiàn)雞娃草中除了含有白花丹科常見的花色苷、山柰苷和槲皮苷等黃酮苷類化合物以外[6-7]；還含有以白花丹素（5-hydroxy-2-methyl-l,4-naphthoquinone, C11H8O3） 為代表的α-萘醌類成分。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)白花丹素具有顯著的抗炎、抗菌活性，并對多種癌細(xì)胞增殖具有抑制作用[8-16]，與雞娃草藥材解毒、止癢、殺蟲的功效接近，是雞娃草的主要藥效物質(zhì)之一。因此，本研究在文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上，首次選擇白花丹素為雞娃草的指標(biāo)性成分，初步探索了雞娃草藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方法，包括性狀、顯微、薄層色譜鑒別及白花丹素成分的定量方法，為控制雞娃草的藥材質(zhì)量和進(jìn)一步開發(fā)利用及擴(kuò)大藥用資源提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 型液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）； DM3000型光學(xué)顯微鏡（德國徠卡公司）；ME204型萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；74-05332型鼓風(fēng)干燥箱（德國賓德公司）；P/N560-01302-00型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦有限公司）；SX2-10-13型馬弗爐（上海樹立儀器儀表有限公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ZF-8型暗箱式紫外分析儀（上海勤科分析儀器有限公司）。

1.2 材料

白花丹素對照品（成都普瑞法生物科技開發(fā)有限公司，純度 > 98%，批號：PRF8032121）；甲醇［色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；其它試劑均為分析純，水為超純水；硅膠板（青島海洋化工廠分廠，G100×100mm）。雞娃草藥材分別采自寧夏固原市六盤山區(qū)、涇源縣及隆德縣等城區(qū)，經(jīng)寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院李小偉副教授鑒定為白花丹科植物雞娃草Plumbagella micrantha（Ledeb.） Spach的全草。

2 方法及結(jié)果

2.1 性狀鑒別

本品為雞娃草的干燥全草，根細(xì)長圓柱形，略微彎曲，較多分枝，表面紅棕色或灰褐色，上端著生多數(shù)細(xì)根。莖直立或斜上，有條棱，沿棱有稀疏小皮刺，多分枝，綠色或紫紅色，質(zhì)輕，易折斷，斷面皮部纖維狀，髓部類白色，海綿狀，松軟；葉片完整者展平后呈倒卵狀披針形或披針形，多皺縮破碎，基部箭形或耳形而抱莖，先端漸尖，上面綠色或紅紫色，下面灰綠色或淡紅紫色；穗狀花序頂生，等筒狀；花粉紅色或淡藍(lán)紫色；氣微；味淡。

2.2 顯微鑒別

粉末特征：粉末呈棕綠色或紅棕色。葉上表皮細(xì)胞多角形，垂周壁較平直；下表皮細(xì)胞類長方形，垂周壁微波狀彎曲狀；氣孔不等式，副衛(wèi)細(xì)胞2 ～ 3個(gè)。網(wǎng)紋導(dǎo)管、梯紋導(dǎo)管多見，環(huán)紋或螺紋導(dǎo)管少見，直徑5 ～ 35 μm。木纖維成束，多亮黃色，壁薄或微木化，直徑8 ～ 12 μm。韌皮纖維棕綠色，長梭形，頂端尖，壁增厚，直徑10 ～ 20 μm。石細(xì)胞單個(gè)散在或成群，類方形、類長方形、多角形或紡錘形，黃綠色，直徑20 ～ 50 μm，壁厚。分泌道內(nèi)含紅棕色分泌物，存在于植物根部。非腺毛具1 ～ 10余個(gè)細(xì)胞，多平直、頂端鈍圓，少數(shù)頂端細(xì)胞皺縮扭曲。草酸鈣簇晶散在，直徑10 ～ 25 μm?；ǚ哿ｎ悎A形，直徑20 ～ 30 μm，數(shù)目較多，表面光滑，具3 ～ 4個(gè)萌發(fā)孔。油細(xì)胞含黃色或紅黃色油狀物，類方形、類長方形或類圓形。分泌細(xì)胞成束，長條狀，內(nèi)含淡紫色或黃白色分泌物，直徑8 ～ 10 μm。棕色塊多數(shù)，紅棕色，不規(guī)則，見圖1。

2.3 薄層色譜TLC鑒別

按照薄層色譜法（《中國藥典》2020版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品和對照品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸（8∶1∶1）為展開系統(tǒng)，展開后取出，晾干。供試品色譜中，在與對照品相應(yīng)的位置上，日光下顯相同的淺黃色斑點(diǎn)，紫外燈254、302、365 nm下均顯棕黃色斑點(diǎn)。薄層板置于氨水蒸氣中熏至斑點(diǎn)變色清晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫色斑點(diǎn)，見圖2。

圖2 雞娃草藥材薄層色譜圖Fig.2 TLC chromatograms of Plumbagella micrantha

2.4 水分、灰分和醇溶性浸出物測定

6批樣品醇溶性浸出物測定、水分測定、灰分測定分別按《中國藥典》2020版四部通則“2201浸出物測定法”項(xiàng)下冷浸法及醇溶性浸出物測定法、通則“0832水分測定法”項(xiàng)下烘干法、通則“2302灰分測定法”項(xiàng)下總灰分測定法及酸不溶性灰分測定法進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1 6批雞娃草各指標(biāo)測定結(jié)果Tab.1 The measurement results of various indicators of 6 batches Plumbagella micrantha

2.5 白花丹素含量測定

2.5.1色譜條件 按照高效液相色譜法（《中國藥典》2020版四部通則0512），采用安捷倫Agilent 1260 ChemStation工作站；色譜柱為Phenomenex luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水溶液 （70∶30） 等度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測器為二極管陣列檢測器，圖3中供試品溶液和白花丹素對照品溶液的波峰均在268 nm附近，可選擇作為檢測波長；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL 。

2.5.2對照品溶液的制備 精密稱取白花丹素對照品0.002 9 mg 置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容至10 mL，精密量取1.0 mL該溶液至10 mL容量瓶中，甲醇定容至10 mL，搖勻，配制成每1.0 mL含29.0 μg的白花丹素對照品溶液。

2.5.3供試品溶液的制備 雞娃草全草藥材粉末過2號篩，精密稱定1.0 g置于100 mL具塞錐形瓶中，加入15 mL甲醇，超聲提取30 min后取出，冷卻后用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，濾過，取濾液過0.22 μm 濾膜，作為供試品溶液。

2.5.4系統(tǒng)適應(yīng)性 考察發(fā)現(xiàn)，按照“2.5.2”“2.5.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行配制，并在上述色譜條件下，白花丹素在9.4 min出峰，且峰形對稱、尖銳。雞娃草全草供試品色譜和白花丹素對照品色譜在相同的保留時(shí)間上有對應(yīng)的吸收峰，與其它峰的分離度良好，且均在268 nm處有最大紫外吸收，表明系統(tǒng)適應(yīng)性良好，見圖3。

圖3 白花丹素對照品及雞娃草全草供試品色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of plumbagin and Plumbagella micrantha

2.5.5線性關(guān)系考察 分別精密吸取白花丹素對照品溶液按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣量 （μg） 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=5 452.9X－7.809 8，R2= 0.999 9。結(jié)果表明，白花丹素在0.029 0 ～ 0.290 0 μg 進(jìn)樣量范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5.6精密度試驗(yàn) 按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣白花丹素對照品溶液（0.029 0 mg/mL）6次，進(jìn)樣量為10 μL，測得峰面積，RSD 值為0.98%，表明儀器精密度良好。

2.5.7重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的雞娃草全草藥材粉末6份，按照“2.5.3”項(xiàng)下方法平行配制6份供試品溶液，并按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，測定白花丹素的峰面積，RSD值為1.06%。

2.5.8穩(wěn)定性試驗(yàn) 取雞娃草全草藥材按照“2.5.3”項(xiàng)下方法配制，并按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件分別在制備后0、2、4、8、10、24 h進(jìn)樣測定，測定白花丹素峰面積的RSD值為0.73%，表明樣品溶液避光放置在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.5.9加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的雞娃草全草藥材粉末樣品 （批號：20200915YBQ-2） 約1.0 g，共9份，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，再精密稱取白花丹素對照品0.007 9 g，按“2.5.2”項(xiàng)下制備成每1 mL含7.9 mg的對照品溶液，分別精密吸取該對照品溶液81、102和122 μL各三份于相應(yīng)的錐形瓶中。按“2.5.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，加樣回收率平均值為99.82%，RSD為1.97%。

2.5.10樣品測定 取10批雞娃草樣品，精密稱定，分別按上述條件制備供試品溶液和進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 雞娃草不同采收批次含量測定結(jié)果Tab. 2 Determination results of different batches of Plumbagella micrantha

此外，從雞娃草藥材中選取綠色的根、莖、葉，以及隨著季節(jié)變換，植物自然生長逐漸變?yōu)榧t色后的根、莖、葉，各3批，分別精密稱取藥材粉末，考察雞娃草不同顏色不同藥用部位中白花丹素的含量差異。按“2.5.1”和“2.5.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，計(jì)算雞娃草不同顏色不同部位中白花丹素的含量，結(jié)果見表3。

表3 雞娃草不同顏色不同部位含量測定結(jié)果Tab. 3 Determination results of different medicinal parts and colors of Plumbagella micrantha

3 討論

雞娃草植物在寧夏分布較為廣泛，多集中在固原市六盤山地區(qū)，野生資源豐富，但目前市售多為雞娃草浸膏和提取物，無原藥材售賣，因此本研究所用10 個(gè)批次的樣品均為寧夏南部地區(qū)的野生雞娃草藥材，對其進(jìn)行了性狀及顯微鑒別，發(fā)現(xiàn)藥材性狀特征基本一致，顯微特征穩(wěn)定，TLC鑒別結(jié)果顯示分離度、斑點(diǎn)相對位置和重復(fù)性較好。此外，在不同波長的紫外燈下，還觀察到其它多個(gè)不同顏色的清晰斑點(diǎn)，提示雞娃草中的化學(xué)成分值得進(jìn)一步研究。根據(jù)研究結(jié)果初步擬定：雞娃草藥材（寧夏地區(qū)）水分不得超過6.0%；總灰分不得超過15.0%；酸不溶性灰分不得超過8.0%；醇溶性浸出物不得少于2.0%。本研究還建立了雞娃草藥材中白花丹素的HPLC定量測定的方法，對10批雞娃草藥材全草進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明各樣品均可檢出白花丹素，且含量有一定的差異。此外，考察發(fā)現(xiàn)雞娃草藥材根、莖、葉中白花丹素的含量差異較為顯著，且隨著季節(jié)變換，藥材性狀由綠色逐漸變?yōu)榧t色后，白花丹素在根、莖、葉中的含有量高低分布也隨之變化，綠色藥材根中的白花丹素含量最高，而紅色藥材葉中的白花丹素含量最高，這可能與其適應(yīng)自然環(huán)境體內(nèi)正常的產(chǎn)物分布和代謝有關(guān)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合藥材的來源、采收季節(jié)及存放等原因，初步擬定雞娃草藥材全草白花丹素含量應(yīng)不得少于0.07%。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對雞娃草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，建立的定性、定量方法靈敏度高、重復(fù)性好，較為精確和簡便，可為今后雞娃草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步完善奠定基礎(chǔ)，并為其藥材的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，雞娃草的藥用價(jià)值及療效雖然已為民間所證實(shí)，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理活性機(jī)制尚不明確，值得深入研究。