五味子多糖的分離純化及其抗糖尿病研究進(jìn)展

吳 倫，高 悅，李 靜，任文晨，蘇 陽(yáng)*

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

五 味 子Schisandra chinensis（Turcz.） Baill為 木蘭科植物五味子的干燥成熟果實(shí)，最早記錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》，作為上乘藥物已有2 000多年的藥用歷史，具有多種藥用功效[1-2]。以往研究中學(xué)界普遍認(rèn)為木脂素類成分是其主要藥效物質(zhì)，但隨著各學(xué)科交叉加速融合，發(fā)現(xiàn)五味子中多糖成分亦有很強(qiáng)的生物活性[3]?！短票静荨分杏涊d五味子補(bǔ)益五臟，系治療糖尿病之上品，現(xiàn)代研究已證實(shí)五味子多糖能夠起到抗糖尿病作用，并受到學(xué)界的廣泛關(guān)注[3]。中藥多糖制備過(guò)程復(fù)雜，因此多糖的制備自然也就成了藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及生物活性研究的重中之重。多糖提取和純化方法多樣，不同方法分離得到的五味子多糖各具差異，采取行之有效的分析手段是闡明多糖理化性質(zhì)對(duì)生物活性影響的關(guān)鍵[4]。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，概述五味子多糖的提取、分離純化、成分分析及抗糖尿病相關(guān)作用機(jī)制研究進(jìn)展，為五味子多糖防治糖尿病藥物的開(kāi)發(fā)及五味子制品的臨床合理應(yīng)用提供借鑒。

1 五味子多糖研究進(jìn)展

1.1 五味子多糖的提取

提取工藝是影響中藥多糖種類和特性的因素之一?，F(xiàn)階段，最廣泛的多糖提取方法是溶劑浸提法，但某些多糖溶解性復(fù)雜，常規(guī)提取方法不但耗時(shí)長(zhǎng)，而且提取效率較低[5]。因此，學(xué)者們專注于提取多糖新技術(shù)的開(kāi)發(fā)，例如，超聲提取法、超聲波輔助酶提取法、超聲波-微波協(xié)同提取法等，多種方法各具優(yōu)勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)表1。合適的提取方法不僅是增加提取率的手段，還有助于提高所得多糖提取物的生物活性。例如，超聲波處理提取可以顯著影響和改善五味子多糖的抗氧化活性，這可能與超聲波降解有關(guān)，超聲波提取將高分子量的多糖分解為適當(dāng)?shù)钠?，降低其?duì)氫鍵的影響，并提高羥基自由基的清除率[6]。兩相萃取法在聚乙二醇6000（PEG 6000）-K2HPO4溶液系統(tǒng)中提取效率是傳統(tǒng)方法的6倍，可能由于水相能夠抑制雜質(zhì)蛋白的溶解，而有機(jī)相有效提高五味子多糖的穩(wěn)定性[7]。隨著更多的五味子多糖結(jié)構(gòu)與生物活性相互影響研究的出現(xiàn)，提取工藝對(duì)多糖的影響不容忽視，研究多糖在各提取過(guò)程中結(jié)構(gòu)性變化對(duì)探究生物活性具有深遠(yuǎn)意義。

表1 五味子多糖提取方法Tab. 1 Schisandra chinensis polysaccharine extraction method

1.2 五味子多糖的純化與分離

1.2.1五味子粗多糖制備 五味子多糖粗提物是一種包含蛋白質(zhì)、色素、小分子和其它雜質(zhì)的混合物，雜質(zhì)純化是多糖精制過(guò)程中不可忽視的步驟?，F(xiàn)階段研究中，汪艷群[14]分別將不同的除蛋白質(zhì)方法應(yīng)用到五味子多糖研究中，結(jié)果表明酶法聯(lián)合三氯乙酸-正丁醇除蛋白效果最好，但在后續(xù)研究中，Sevag法因其操作簡(jiǎn)便且時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)更多用于去除五味子粗多糖中的蛋白[15]。除此之外，為了獲得更好的去除率，還可以將幾種方法組合在一起以減少時(shí)間和溶劑用量，這還需要后續(xù)的研究進(jìn)一步加以優(yōu)化。五味子多糖中的色素總是影響多糖的純化和性質(zhì)分析，除色素時(shí)，活性炭法會(huì)吸收多糖，導(dǎo)致產(chǎn)量下降，過(guò)氧化氫處理也會(huì)使多糖部分水解，通常狀況下，這兩種方法很少用于脫色，所以目前大多采用聚酰胺柱層析或者陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂法對(duì)五味子多糖進(jìn)行分離和色素的脫除[16-17]，其中聚酰胺DEAE-纖維素脫色法較為常用。同時(shí)，因?yàn)槎嗵谴蠓肿犹匦裕褂媚ね肝龇梢暂p松除去小分子物質(zhì)，如：寡糖和無(wú)機(jī)鹽[18]。

1.2.2五味子多糖分離純化 多糖大多數(shù)純化方法都是基于溶解度差異，而分級(jí)沉淀技術(shù)被認(rèn)為是一種獨(dú)特且方便的方法，可選擇性地得到在低級(jí)醇或酮中溶解度差異較大的多糖[19]。祁玉麗等[20]從五味子多糖中分離純化出了三種多糖子級(jí)分，WSP-30、WSP-60、WSP-80是通過(guò)使用乙醇（30%、60%、80%）的梯度濃度分級(jí)沉淀而獲得。另一方面，色譜技術(shù)是中藥多糖最有效的分離和分析方法之一，其中純化多糖最常用的方法是離子交換色譜法和凝膠過(guò)濾色譜法，陰陽(yáng)離子交換色譜常用填料為二乙基氨基乙基纖維素（DEAE-Cellulose），而凝膠色譜常用填料有葡聚糖凝膠（Sephadex G）、聚丙烯酰胺葡萄糖凝膠（Sephacryl HR）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）等，針對(duì)五味子多糖純化研究，兩者一般配合使用，以期得到純度更高的均一多糖，多糖純化工藝總結(jié)，見(jiàn)表2。

表2 五味子多糖分離純化方法Tab. 2 The method of separation and purification of Schisandra chinensis polysaccharides

1.3 五味子多糖的結(jié)構(gòu)特征、理化特性及生物活性

多糖的活性通常取決于其分子結(jié)構(gòu)和理化特性，包括分子量和單糖組成等[29]。目前，色譜法已廣泛應(yīng)用于多糖的組成和結(jié)構(gòu)分析[30]，五味子多糖中單糖成分可以通過(guò)高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）、氣相色譜（GC）等分析鑒定，其分子量可以通過(guò)高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）和多角度激光散射（MALLS）等確定分析，因此針對(duì)現(xiàn)階段五味子多糖提取分離情況進(jìn)行總結(jié)，見(jiàn)表3。對(duì)于多糖均一化成分的提取、檢驗(yàn)、分析促進(jìn)五味子多糖研究的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展，為進(jìn)一步闡明多糖結(jié)構(gòu)影響活性奠定基礎(chǔ)。

表3 五味子中多糖類成分Tab. 3 Polysaccharine ingredients in Schisandra chinensis

2 五味子多糖抗糖尿病作用相關(guān)機(jī)制

2.1 降低氧化應(yīng)激水平

目前為止，糖尿病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但其發(fā)生過(guò)程中常伴隨著內(nèi)環(huán)境代謝紊亂，其中氧化應(yīng)激水平的提高與糖尿病密切相關(guān)。NIU J M等[22]分離出一種水溶性五味子均一多糖（SSPW1），并對(duì)其在2型糖尿病大鼠體內(nèi)的抗氧化和抗糖尿病作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，SSPW1通過(guò)增加糖尿病大鼠體內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性并降低肝臟組織中的丙二醛（MDA）水平起到降血糖作用。

2.2 調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLUT-4）在葡萄糖的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)中起著至關(guān)重要的作用。JIN D等[44]使用BRL細(xì)胞建立胰島素抵抗模型研究低重量分子多糖SCPP11的降血糖機(jī)制。結(jié)果表明，SCPP11通過(guò)上調(diào)胰島素和5?-單磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路（例如胰島素）中關(guān)鍵酶的mRNA水平來(lái)調(diào)節(jié)GLUT-4 mRNA和蛋白表達(dá)，例如：受體底物1（IRS-1）、磷酸肌醇3激酶（PL3K）和蛋白激酶B（Akt）。此外，SCPP11通過(guò)調(diào)節(jié)AMPKα和過(guò)氧化物酶體增殖物激活的受體γ（PPAR-γ）mRNA水平并減輕胰島素抵抗改善葡萄糖消耗。

2.3 抑制JNK通路及保護(hù)胰島β細(xì)胞

糖尿病模型胰島β細(xì)胞凋亡是破壞胰島功能的主要形式，因此，五味子多糖治療糖尿病的關(guān)鍵是抑制胰島β細(xì)胞凋亡并改善其功能，維持體內(nèi)胰島素分泌水平。陶雪[4]觀察了五味子中酸性多糖對(duì)STZ誘導(dǎo)的T1DM和T2DM小鼠的作用，結(jié)果顯示，五味子酸性多糖能顯著降低T1DM和T2DM小鼠血清中FBG和MDA水平，提高FINS和SOD含量，并改善小鼠胰腺組織病理變化；同時(shí)抑制兩種小鼠胰腺組織中P-JNK、BAX及Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2蛋白釋放，對(duì)H2O2誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，推測(cè)五味子酸性多糖降血糖作用可能與抑制JNK信號(hào)通路從而降低胰島β細(xì)胞凋亡有關(guān)。

2.4 調(diào)節(jié)糖代謝及胰島素抵抗

脂聯(lián)素和抵抗素分別是由脂肪細(xì)胞分泌的膠原樣血漿蛋白和多肽類激素，兩者皆參與調(diào)節(jié)糖代謝和胰島素抵抗治療糖尿病。馬育軒等[45]將粗制五味子多糖應(yīng)用于高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型。研究結(jié)果表明五味子粗多糖對(duì)大鼠血清中的脂聯(lián)素水平有促進(jìn)作用，同時(shí)降低抵抗素含量，減輕大鼠糖尿病樣作用。

2.5 改善脂代謝

糖尿病患者通常伴有不同程度的脂代謝紊亂，研究表明，胰島素抵抗是糖尿病與高脂血癥的主要病因，所以調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝可以促進(jìn)糖尿病的治療進(jìn)程。王會(huì)堂等[46]對(duì)五味子多糖粗提物的降血脂功能進(jìn)行研究。結(jié)果表明多糖組可明顯升高HDL-C含量，同時(shí)降低TC、TG和LDL-C含量。表明多糖能有效改善脂代謝紊亂，降低血脂水平。趙婷[47]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步表明多糖能夠促進(jìn)肝糖原合成并抑制其分解從而降血糖，同時(shí)能夠顯著改善脂代謝異常。

2.6 抑制炎癥反應(yīng)

隨著糖尿病研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)已經(jīng)成為胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能減退的主要原因之一，因此，改善胰島素抵抗、保護(hù)胰島β細(xì)胞，抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮降低血糖作用是其關(guān)鍵作用機(jī)制。杜興旭等[48]觀察了五味子粗多糖對(duì)高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠血清中炎癥因子的影響，并進(jìn)一步探討其治療糖尿病的可能機(jī)制。結(jié)果表明，五味子粗多糖組大鼠FBG水平呈劑量依賴性降低，血糖AUC明顯下降，INS水平和ISI明顯升高，血清中IL-6、CRP、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均降低顯著，說(shuō)明可降低T2DM大鼠FBG水平，升高INS水平，改善五味子粗多糖胰島素抵抗，其作用機(jī)制可能與抑制體內(nèi)炎癥反應(yīng)相關(guān)。

2.7 其它

GAO X X等[27]發(fā)現(xiàn)一種五味子水溶性酸多糖SCP-BⅡ可改善四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠的體重下降、多飲和高血糖癥。陶雪等[49]探究了五味子多糖對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟的保護(hù)作用，研究表明，五味子粗多糖能顯著降低2型糖尿病大鼠FBG、ALT和AST水平，提高INS含量，同時(shí)，五味子粗多糖能夠降低肝組織中MDA水平，改善SOD活性，肝臟細(xì)胞脂肪變性減輕，起到改善2型糖尿病大鼠肝功能作用。

3 結(jié)論

本文概述了五味子多糖的提取、分離純化、成分分析及其抗糖尿病相關(guān)作用機(jī)制，提取工藝選擇和分離純化工藝優(yōu)化，成為五味子多糖開(kāi)發(fā)使用的前提，同時(shí)也是分析生物活性的必備條件。