烯酰還原酶基因的替換對(duì)裂殖壺菌合成二十碳五烯酸的影響

楊瑞雄，鄭鑫，陸濤，趙譽(yù)澤，楊慶華，盧英華，2，3，何寧，2，凌雪萍，2，3

（1 廈門(mén)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建廈門(mén)361005； 2 福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建廈門(mén)361005；3 福建省化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廈門(mén)大學(xué)），福建廈門(mén)361005）

引 言

ω-3型多不飽和脂肪酸對(duì)健康的重要性已在臨床和流行病學(xué)研究中得到充分證實(shí)，其中備受關(guān)注的有二十碳五烯酸（EPA,C20:5）和二十二碳六烯酸（DHA,C22:6）[1]。作為脂質(zhì)的重要組成部分[2]，EPA可以調(diào)控生物膜的結(jié)構(gòu)與功能，并通過(guò)降低血纖維蛋白水平和低密度脂蛋白水平來(lái)預(yù)防心血管疾病[3]，例如腦血栓、動(dòng)脈粥樣硬化[4]。深海魚(yú)油是目前多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）工業(yè)化生產(chǎn)的主要來(lái)源，但自然資源的匱乏以及較高的分離成本導(dǎo)致其供不應(yīng)求[5]。因?yàn)轸~(yú)油中豐富的PUFAs 通過(guò)食物鏈積累而來(lái)，所以藻類(lèi)、低級(jí)真菌以及海洋細(xì)菌等微生物才是PUFAs 的初始來(lái)源[6]。El Razak 等[7]從地中海、紅海等地篩選了250 株海洋細(xì)菌，通過(guò)響應(yīng)面等方法進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化后EPA 的最大產(chǎn)量達(dá)到45 mg/L。Zhang 等[8]通過(guò)優(yōu)化希瓦氏菌的培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)基成分等使得EPA 的 產(chǎn) 量 達(dá) 到30 mg/g。Chen 等[9]對(duì) 菱 形 藻（Nitzschia laevis）進(jìn)行高密度培養(yǎng)，在最大細(xì)胞干重達(dá) 到22.1 g/L 的 基 礎(chǔ) 上，EPA 產(chǎn) 量 達(dá)695 mg/L。Wang 等[10]研究的破囊壺菌基因工程菌株通過(guò)發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵后EPA 產(chǎn)量達(dá)到2.7 g/L。由此可見(jiàn)，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)EPA 將成為未來(lái)的主要發(fā)展趨勢(shì)。

近年來(lái)，研究者們不斷探索PUFAs 的合成機(jī)理，PKS 途徑被認(rèn)為是主要用來(lái)合成PUFAs 的途徑[11]，進(jìn)而研究通過(guò)替換不同微生物中PKS 基因簇上的基因來(lái)增加PUFAs 的含量。Hayas hi 等[12]將Photobacterium profundum的PKS 基因簇上部分基因與Aureispira marina的PKS 基因簇上對(duì)應(yīng)基因相互置換，發(fā)現(xiàn)ORFC和ORFB上的脫氫酶（dehydratase，DH）基因在花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）的合成中起關(guān)鍵作用。Ren 等[13]通過(guò)在Schizochytriumsp. HX-308 中敲入Shewanella的?；D(zhuǎn)移酶（Acyltransferase，AT）基因，EPA 占比提高3.7 倍。Matsuda 等[14]敲除破囊壺菌中的Δ12 脫飽和酶基因后，傳統(tǒng)脂肪酸合成途徑（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）受阻，而PKS 途徑合成的PUFAs 含量增加。以上研究表明基因工程調(diào)控脂肪酸合成相關(guān)途徑對(duì)改善油脂的組成是可行的，可以進(jìn)一步提高PUFAs 的產(chǎn)量。

裂殖壺菌具有生長(zhǎng)繁殖快、耐受機(jī)械攪拌和可異養(yǎng)培養(yǎng)等特點(diǎn)，非常適宜發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)。裂殖壺菌的油脂含量可達(dá)細(xì)胞干重的40%～70%，PUFAs占比達(dá)30%～50%，其中DHA占比30%～40%，但EPA 含量較低[15]。研究表明，裂殖壺菌的脂肪酸合成主要通過(guò)兩個(gè)途徑，分別是需氧的FAS 途徑和厭氧的PKS 途徑[16]。Wallis 等[17]從裂殖壺菌PKS 基因簇中分離了三個(gè)閱讀表達(dá)框（ORF A-C），其中包含8個(gè)功能不同的基因（圖1）。其中ER基因所表達(dá)的烯酰還原酶主要催化不飽和C====C 鍵還原成飽和的C—C 鍵，使底物烯酰-ACP 還原成酰基-ACP，是從頭合成脂肪酸的最后一步[18]。Heath 等[19]首次提出ER主要作用于大腸桿菌中的反式-烯酰-ACP，將其還原為酰基-ACP。ER基因在PKS 基因簇中包含兩個(gè)部分，分別位于ORFB上（ORFB-ER）和ORFC上（ORFC-ER）（圖1）[19]。Ling 等[20]利用基因工程手段對(duì)兩個(gè)ER基因的功能進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明ORFB-ER基 因 在Schizochytrium limacinumSR21 的PUFAs 合成中起著關(guān)鍵作用，而ORFC-ER基因則更多地和飽和脂肪酸（SFAs）的合成及細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)；此外，研究還發(fā)現(xiàn)ORFC-ER基因轉(zhuǎn)錄水平的降低有利于Schizochytrium limacinumSR21 細(xì)胞內(nèi)油脂的積累。Lee 等[21]將希瓦氏菌屬的Shewanellasp.SCRC2738 菌株中完整的PKS 基因簇重組表達(dá)在大腸桿菌中，在提取的總脂肪酸中成功檢測(cè)到了EPA。Metz 等[22]提出希瓦氏菌PKS 基因簇中的ER基因與肺炎鏈球菌FAS 合成途徑的FabI基因具有高度同源性。因此，ER基因可能是PKS 途徑和FAS途徑的重要中樞基因，在PUFAs 的合成中發(fā)揮重要作用。

圖1 希瓦氏菌、裂殖壺菌SR21、B-sh-ER菌株和C-sh-ER菌株中的PKS基因簇Fig.1 PKS gene clusters of Shewanella sp.SCRC2738,Schizochytrium limacinum SR21,B-sh-ER strain and C-sh-ER strain

希瓦氏菌Shewanella在低溫、高壓條件下生長(zhǎng)時(shí)，EPA 作為細(xì)胞內(nèi)唯一的PUFA，含量可達(dá)20%左右。因此，希瓦氏菌中的PKS 基因簇（圖1）被認(rèn)為主要催化合成EPA[6]。ER基因存在于希瓦氏菌PKS基因簇的ORFD結(jié)構(gòu)域上，表達(dá)的烯酰還原酶對(duì)反式-2-烯基-ACP 中間體的雙鍵進(jìn)行NADPH 依賴(lài)的還原，該反應(yīng)是合成EPA 的關(guān)鍵步驟[1]。目前已有研究學(xué)者將希瓦氏菌屬的Shewanellasp. SCRC 2738、MR-1、MAC1 等菌株中完整的EPA 基因簇導(dǎo)入至大腸桿菌中表達(dá)，成功地通過(guò)PKS 途徑合成了EPA[23]。其中，Lee 等[24]在大腸桿菌中異源表達(dá)希瓦氏菌（Shewanella oneidensisMR-1）EPA 合成基因簇，EPA 產(chǎn)量能達(dá)到總油脂的0.689%。美國(guó)杜邦公司在解脂酵母（Yarrowia lipolytica）中完整構(gòu)建了FAS途徑的十八碳二烯酸至二十碳五烯酸合成通路，使PUFAs占總油脂的70%以上[25]。通過(guò)在EPA生物合成途徑中過(guò)表達(dá)不同的去飽和酶和延長(zhǎng)酶，Yarrowia lipolytica的EPA 在總油脂中占比超過(guò)25%[26]。 在 聚 球 藻Synechococcus中 異 源 表 達(dá)Shewanella的PUFAs 合成基因簇，EPA 的產(chǎn)量也明顯提高[27]。對(duì)于PUFAs的合成來(lái)說(shuō)，大腸桿菌、酵母以及微藻等微生物菌種相比于裂殖壺菌不具備天然的優(yōu)勢(shì)，而且單一菌株插入多個(gè)外源基因在穩(wěn)定性上也不盡人意。因此，本研究將SchizochytriumlimacinumSR21 的高油脂含量與Shewanellasp.SCRC2738 較強(qiáng)的PKS 基因簇相結(jié)合，利用同源重組技術(shù)將Shewanellasp. SCRC2738 的ER基因分別敲入Schizochytrium limacinumSR21 的ORFB-ER基因和ORFC-ER基因中，使Shewanellasp.SCRC2738的ER基因代替原宿主的ER基因發(fā)揮作用，對(duì)重組菌株脂肪酸成分以及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，探究sh-ER基因在裂殖壺菌PUFAs 合成中的功能。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 工具酶與試劑

大腸桿菌Trans110感受態(tài)細(xì)胞、EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒和TransStart Top Green QPCR 試劑盒購(gòu)買(mǎi)于北京全式金生物有限公司。質(zhì)粒小提試劑盒、普通DNA 產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、SuperMix MiniBEST 通用RNA 提取試劑盒和限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。十七烷酸甲酯、博來(lái)霉素和脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma 公司。正己烷和三氟化硼乙醚購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司。

1.2 菌種和培養(yǎng)基

本研究從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC，USA）獲 取Schizochytrium limacinumSR21 菌 株。pTEF1/Zeo 載體和pMD19T-easey 載體購(gòu)自英駿公司（Invitrogen,USA）。

LB 培養(yǎng)基（氨芐）用于大腸桿菌培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化子篩選。裂殖壺菌種子培養(yǎng)基用于SchizochytriumlimacinumSR21 常規(guī)培養(yǎng)[20]。含博來(lái)霉素種子培養(yǎng)基用于裂殖壺菌轉(zhuǎn)化子篩選[28]。發(fā)酵培養(yǎng)基用于Schizochytrium limacinumSR21發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酸[29]。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

種子液制備：取裂殖壺菌種子在固體種子培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng)，在28℃條件下培養(yǎng)36 h。在已培養(yǎng)好的固體種子培養(yǎng)基上挑選形態(tài)飽滿(mǎn)的單菌體，置于50 ml 種子培養(yǎng)基中，在28℃，250 r/min 條件下培養(yǎng)24 h。

搖瓶發(fā)酵：從二級(jí)種子培養(yǎng)基中，按照6%的接種量，轉(zhuǎn)移一定量種子培養(yǎng)液至50 ml 發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃，250 r/min條件下培養(yǎng)120 h。

發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)：本實(shí)驗(yàn)采用補(bǔ)料分批發(fā)酵的方法，采用5 L 發(fā)酵罐（Winpact，USA）進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，初始葡萄糖濃度為60 g/L，轉(zhuǎn)速為300 r/min，通氣量為4 vvm，培養(yǎng)溫度保持為28℃，pH 維持7.5。初始溶氧設(shè)定為100%，根據(jù)發(fā)酵過(guò)程中溶氧情況逐級(jí)提高，最大至700 r/min。

1.4 菌株構(gòu)建

如圖2 所示構(gòu)建替換Schizochytrium limacinumSR21 中ORFB-ER和ORFC-ER基因的敲入載體。將合成的希瓦氏菌ER基因（sh-ER）表達(dá)框（TEF1啟動(dòng)子、sh-ER基因、CYC1 終止子）克隆到pMD19T Easy Vector 中進(jìn)行擴(kuò)增，并命名為pMD-sh-ER。使用BamHI 和PstI 限 制 酶 對(duì) pMD-sh-ER和pBlueZEO-B 載體雙酶切后使用T4 連接酶在16 ℃過(guò)夜連接，產(chǎn)生重組敲入載體pBlueZEO-B-sh-ER。使用相同的方法構(gòu)建pBlueZEO-C-sh-ER載體。

根據(jù)Ling 等[20]報(bào)道的方法，通過(guò)電轉(zhuǎn)化將構(gòu)建的兩個(gè)載體線(xiàn)性化后轉(zhuǎn)化并重組到裂殖壺菌基因組上。制備好的裂殖壺菌感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)過(guò)電穿孔后，在含有1 mol/L 山梨糖醇的種子培養(yǎng)基中于28℃培養(yǎng)2～3 h。將回收的細(xì)胞在含有30 mg/L博來(lái)霉素的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5 d。最后，將在含博來(lái)霉素平板上生長(zhǎng)出的陽(yáng)性敲入菌株在28℃，250 r/min 下培養(yǎng)，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

1.5 生物量和總油脂測(cè)定

生物量通過(guò)重量法測(cè)定法[28]。將1 ml發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至預(yù)先稱(chēng)重的離心管中，然后以10000g離心2 min。沉淀用去離子水洗滌兩次，在-50℃凍干至恒重約24 h，最后稱(chēng)量干細(xì)胞重量。

圖2 B-sh-ER載體構(gòu)建（a）;C-sh-ER載體構(gòu)建（b）Fig.2 Construction of B-sh-ER vector(a);Construction of C-sh-ER vector(b)

脂質(zhì)提取方法為正己烷提取法[28]。將3 ml發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到離心管中，加入4 ml 12 mol/L 濃鹽酸混合，然后將混合溶液在65℃水浴中反應(yīng)50 min。最后將反應(yīng)后的混合物用4 ml 正己烷萃取數(shù)次直至上清無(wú)色，收集上清后氮?dú)獯蹈芍梁阒兀?5℃烘箱干燥2 h后稱(chēng)量總油脂重量。

1.6 脂肪酸組分分析

根據(jù)文獻(xiàn)[30]報(bào)道的方法制備脂肪酸甲酯并進(jìn)行了一些修改。首先，5 ml 0.5 mol/L 氫氧化鉀-甲醇溶液溶解提取的總油脂，65℃的水浴中皂化10 min后加入三氟化硼乙醚甲酯化。冷卻至室溫后，以十七烷酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)，將脂肪酸甲酯樣品于配備有100 m × 0.25 mm 毛細(xì)管柱（SP-2560，USA）的氣相色譜儀（Agilent GC 7890，USA）中進(jìn)行分析。

1.7 葡萄糖濃度測(cè)定

將1 ml 發(fā)酵液10000g離心2 min，收集上清液以測(cè)量葡萄糖濃度。葡萄糖濃度通過(guò)3,5-二硝基水楊酸（DNS）方法測(cè)定[31]。

1.8 實(shí)時(shí)定量PCR分析

使用MiniBEST 通用RNA 提取試劑盒提取菌體中總RNA 后，通過(guò)Easy-Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒以總RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。將獲得的cDNA 稀釋至100 ng/μl，使用Trans-Start Top Green QPCR SuperMix 配置RT-PCR反應(yīng)體系并通過(guò)Step-One 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems，China）檢測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄水平。無(wú)cDNA模板的反應(yīng)用作陰性對(duì)照，肌動(dòng)蛋白（ACT）基因作為參照對(duì)mRNA 的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并使用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)水平[32]。表A1 列出用于RT-qPCR的引物。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過(guò)t值檢驗(yàn)顯示重組敲入菌株和野生型菌株之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。P< 0.05(a)表示顯著性差異；P< 0.01(b)表示極顯著性差異。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均設(shè)有三組生物學(xué)重復(fù)，兩組技術(shù)重復(fù)以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，數(shù)值均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 S.limacinum SR21 sh-ER基因敲入菌株構(gòu)建

重組敲入質(zhì)粒如圖2 所示，包含sh-ER基因的上下游同源臂，博來(lái)霉素表達(dá)框（TEF1啟動(dòng)子，博來(lái)霉素基因和CYC1終止子）和sh-ER表達(dá)框（TEF1啟動(dòng)子，sh-ER基因和CYC1 終止子）。利用博來(lái)霉素基因作為篩選標(biāo)記，將敲入質(zhì)粒線(xiàn)性化后分別電轉(zhuǎn)進(jìn)入Schizochytrium limacinumSR21 中。如圖3 所示，在含有30 mg/L 博來(lái)霉素的平板上分別挑取Bsh-ER敲入（sh-ER基因敲入ORFB-ER）和C-sh-ER敲入（sh-ER基因敲入ORFC-ER）的陽(yáng)性重組菌株。在兩種陽(yáng)性重組菌株的基因組中均成功檢測(cè)到與部分博來(lái)霉素抗性表達(dá)框相對(duì)應(yīng)的649 bp 片段，而在野生型菌株中未檢測(cè)到（圖4）。這表明sh-ER基因已成功敲入Schizochytrium limacinumSR21 的ORFB-ER和ORFC-ER基因中。

2.2 重組菌株的生物量和總油脂含量分析

如圖5(a)所示，對(duì)于B-sh-ER敲入菌株，細(xì)胞前期生長(zhǎng)緩慢，72 h后生長(zhǎng)加快。在發(fā)酵144 h前生物量均低于野生型菌株，而發(fā)酵后期（144 h之后）細(xì)胞生物量與野生型菌株接近。分析認(rèn)為sh-ER基因片段與ORFB-ER基因片段大小接近，但由于異源基因在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)需要一定的適應(yīng)期[33]，所以Bsh-ER敲入菌株的細(xì)胞生長(zhǎng)周期較野生型菌株明顯延長(zhǎng)。如圖5(b)、(c)所示，B-sh-ER敲入菌株總油脂含量在發(fā)酵中前期低于野生型菌株，而在發(fā)酵168 h時(shí)，總油脂基本與野生型菌株持平，而重組菌株的油脂含量高于野生型菌株9.38%（P< 0.05）。上述結(jié)果表明，sh-ER基因的敲入雖然降低了菌體生長(zhǎng)速率，但最終補(bǔ)償了ORFB-ER基因的功能，使得Bsh-ER敲入菌株的生物量與總油脂恢復(fù)至野生型菌株的水平，同時(shí)提高了菌體合成油脂的能力。

圖3 含博來(lái)霉素抗性平板上生長(zhǎng)的野生型菌株（a），B-sh-ER 菌株（b）和C-sh-ER菌株（c）Fig.3 Wild strains(a),B-sh-ER strains(b)and C-sh-ER strains(c)grown on media containing zeocin

圖4 B-sh-ER菌株中博來(lái)霉素表達(dá)框的基因組PCR(a);C-sh-ER菌株中博來(lái)霉素表達(dá)框的基因組PCR(b)Fig.4 Genomic PCR of zeocin expression cassette in the B-sh-ER strains(a);Genomic PCR of zeocin expression cassette in the C-sh-ER strains(b)

如圖5(d)所示，C-sh-ER敲入菌株生物量相對(duì)于野生型菌株降低18.82%（P<0.05），與Ling等[20]構(gòu)建的ORFC-ER敲除菌株的細(xì)胞生長(zhǎng)相似，表明敲入sh-ER基因替換原有的ORFC-ER并沒(méi)有補(bǔ)償ORFC-ER基因?qū)w生長(zhǎng)的影響，導(dǎo)致敲入菌株生物量沒(méi)有恢復(fù)到正常水平。如圖5(e)所示，C-sh-ER敲入菌株總油脂產(chǎn)量較野生型菌株降低34.51%，但由于C-sh-ER敲入菌株生物量的降低，導(dǎo)致單位細(xì)胞油脂產(chǎn)量[圖5（f）]與野生型菌株一致。而Ling等[20]報(bào)道的ORFC-ER敲除菌株總油脂產(chǎn)量在發(fā)酵后期與野生型菌株基本持平，并且單位細(xì)胞油脂含量較野生型菌株高19.70%。這說(shuō)明sh-ER基因在該位置敲入不能發(fā)揮ORFC-ER基因?qū)w生長(zhǎng)的作用，同時(shí)對(duì)油脂合成產(chǎn)生了一定的抑制。Ren等[34]發(fā)現(xiàn)在Schizochytriumsp.中異源表達(dá)ω-3 去飽和酶和過(guò)表達(dá)乙酰輔酶A 合成酶后，生物量都明顯降低，這可能與引入外源基因后細(xì)胞負(fù)擔(dān)增加有關(guān)。本研究結(jié)果與上述結(jié)果類(lèi)似，sh-ER基因片段較ORFC-ER基因片段長(zhǎng)一些，可能增大了菌株的蛋白表達(dá)負(fù)荷[35]。除此之外，ORFC-ER基因更多地與細(xì)胞生長(zhǎng)和飽和脂肪酸（saturated fatty acids，SFAs）合成相關(guān)，而sh-ER基因則更多地與PUFAs尤其是EPA 的合成相關(guān)[20]，因此導(dǎo)致sh-ER基因的敲入不能補(bǔ)償ORFC-ER基因的功能。

2.3 重組菌株脂肪酸成分分析

如表1 所示，B-sh-ER敲入菌株的單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid, MUFAs）如C14∶1含量相比于野生型菌株增加了95.02%（P< 0.05），文獻(xiàn)報(bào)道MUFAs 的碳碳雙鍵能夠提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性[36]，因此MUFAs 的增加是細(xì)胞在敲入基因的壓力下為了維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性造成的。對(duì)于PUFAs 來(lái)說(shuō)，B-sh-ER敲入菌株的DHA 含量雖然由29.76%下降到27.63%，但是EPA 含量提高了85.71%（P<0.01），達(dá)到0.78%；EPA/DHA 的百分含量增加了77.02%（P<0.01）。這些結(jié)果表明，B-sh-ER敲入菌促進(jìn)了EPA 的合成通路，提高了EPA 的合成能力。分析認(rèn)為sh-ER主要傾向于合成EPA[37]，而裂殖壺菌的ORFB-ER在細(xì)胞內(nèi)主要用于合成PUFAs[38]。因此，接下來(lái)主要研究B-sh-ER敲入菌的相關(guān)代謝變化。

而對(duì)于C-sh-ER敲入菌株，SFAs 的占比增加，而包括DHA、DPA 和EPA 在內(nèi)的PUFAs 的含量降低，EPA/DHA 的百分含量基本保持不變，甚至略有降低。文獻(xiàn)報(bào)道，PUFAs 主要是通過(guò)PKS 途徑合成的，而SFAs 主要是通過(guò)FAS 途徑合成的[38]，兩者都需要以乙酰輔酶A 為底物，以ATP 為能量，以NADPH 為 還 原 力[39]，這 表 明sh-ER敲 入 替 換ORFC-ER使 更 多 的ATP 和NADPH 流 向SFAs 合成，與Ling 等[20]對(duì)ORFC-ER基因結(jié)構(gòu)域功能鑒定結(jié)果一致。

2.4 B-sh-ER敲入菌株相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析

如 圖6（a）、（b）所 示，B-sh-ER敲 入 菌 株 中ORFB-ER基因在發(fā)酵過(guò)程中相比于野生型菌株均下調(diào)表達(dá)，60 h 時(shí)表達(dá)水平降低78.73%（P<0.05），同時(shí)敲入的sh-ER基因均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，60 h時(shí)上調(diào)表達(dá)接近30 倍（P< 0.01），這進(jìn)一步驗(yàn)證了B-sh-ER重組敲入菌株構(gòu)建的準(zhǔn)確性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。如圖6(c)所示，重組菌中ORFC-ER基因的轉(zhuǎn)錄水平整體呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，Ling 等[20]通過(guò)敲除Schizochytrium limacinumSR21 基因組中ORFCER基因的方式來(lái)驗(yàn)證其功能發(fā)現(xiàn)該基因與SFAs 的合成以及菌體生長(zhǎng)密切相關(guān)，因此B-sh-ER生物量的增加以及C16:0 和C18:0 等飽和脂肪酸含量提高與ORFC-ER基因上調(diào)表達(dá)相關(guān)。如圖6(d)所示，重組菌中AT 基因轉(zhuǎn)錄水平在84 h 提高接近20 倍（P<0.01）。AT 是一類(lèi)?；D(zhuǎn)移酶，能夠?yàn)镻KS 途徑合成PUFAs 提供底物[29]，Ren 等[13]針對(duì)AT 基因的替換研究發(fā)現(xiàn)?；D(zhuǎn)移酶對(duì)其他脂肪酸組分影響不顯著，但EPA的含量卻明顯增加，這說(shuō)明了sh-ER敲入對(duì)ORFB-ER的替換促進(jìn)了AT 基因的上調(diào)表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)了EPA的合成。

圖5 野生型菌株和B-sh-ER菌株中生物量（a），總油脂量（b）和油脂含量（c）；野生型菌株和C-sh-ER菌株生物量（d）、總油脂量（e）和油脂含量（f）Fig.5 Biomass(a),total lipids yield(b)and lipids content(c)in the wild strain and B-sh-ER strains;Biomass(d),total lipids yield(e)and lipids content(f)in the wild strain and C-sh-ER strains

2.5 B-sh-ER敲入菌株的補(bǔ)料分批發(fā)酵

通過(guò)以上生物量、總脂質(zhì)和脂肪酸組成的分析，可以發(fā)現(xiàn)B-sh-ER敲入菌株在維持正常生物量的同時(shí)，使得總油脂和EPA 含量均增加。因此，將B-sh-ER敲入菌株在5 L 發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵。

如圖7 所示，B-sh-ER敲入菌株顯示在保持與野生型菌株生長(zhǎng)速率一致的前提下細(xì)胞生長(zhǎng)周期明顯延長(zhǎng)，最終生物量達(dá)到159.70 g/L，高于野生型菌株42.46%[圖8(a)]。同時(shí)，在B-sh-ER敲入菌株中，葡萄糖顯示出更快的消耗速率，總油脂和EPA產(chǎn)量分別增加了28.70%和71.6%，達(dá)到73.24 g/L 和732.40 mg/L[圖8(b)、(c)]。B-sh-ER敲入菌株的EPA/DHA 的百分含量在整個(gè)補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程中均高于野生型菌株，并且在發(fā)酵終點(diǎn)提高了76.1%[圖8(e)]，而B(niǎo)-sh-ER敲入菌株的最終DHA 產(chǎn)量與野生型菌株相比變化不明顯[圖8(d)]。脂肪酸組成的進(jìn)一步分析如表2 所示，B-sh-ER敲入菌株與野生型菌株相比C16:0 含量從49.54%增加到57.40%，同時(shí)，PUFAs、DHA 和DPA 含量分別降低了24.4%、24.4% 和29.3%。但是，B-sh-ER敲入菌株中的EPA 比例（占總脂質(zhì)的1.0%）比野生型菌株高出33.3%。

表1 野生型菌株、B-sh-ER菌株和C-sh-ER菌株脂肪酸組成Table 1 Fatty acid composition of wild strains，C-sh-ER strains and B-sh-ER strains

表2 補(bǔ)料分批發(fā)酵野生型菌株和B-sh-ER菌株的脂肪酸組成Table 2 Fatty acid composition of the wild strain and B-sh-ER strain in fed-batch fermentation

圖6 B-sh-ER菌株相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析(a)裂殖壺菌烯酰還原酶基因ORFB-ER;(b)希瓦氏菌烯酰還原酶基因sh-ER;(c)裂殖壺菌烯酰還原酶基因ORFC-ER;(d)?；D(zhuǎn)移酶(AT)基因Fig.6 The transcription level of related gene in B-sh-ER strain(a)Schizochytrium limacinum SR21 enoyl-reductase gene ORFB-ER;(b)Shewanella sp.SCRC2738 enoyl-reductase gene sh-ER;(c)Schizochytrium limacinum SR21 enoyl-reductase gene ORFC-ER;(d)acyl transferase(AT)gene

圖7 野生型菌株(a)和B-sh-ER菌株(b)在5 L發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料發(fā)酵生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.7 Growth curves of fed-batch fermentation in 5 L fermentator by wild strain(a)and B-sh-ER strain(b)

表3 相關(guān)菌株EPA產(chǎn)量及占比Table 3 EPA yield and proportion of related strains

表3中列出了目前用于EPA 生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量以及總脂肪酸中EPA 的占比，主要有破囊壺菌屬、微藻以及高山被孢霉。破囊壺菌屬由于具有高生物量以及高油脂含量的特點(diǎn)，因此在PUFAs 合成方面潛力巨大。目前針對(duì)破囊壺菌屬調(diào)控PUFAs 合成的主要方式以基因工程和代謝工程為主，但是在獲得較高EPA 占比的條件下細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)受抑制。Cui 等[43]指出過(guò)表達(dá)六磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）導(dǎo)致破囊壺菌PUFAs占比增加10.60%，但是細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂合成受到嚴(yán)重影響。微藻的油脂中也含有豐富的PUFAs，光合作用菌株紫球藻（Porphyridium cruentum）中EPA 占總脂肪酸的41%[44]；而根據(jù)栽培條件不同，三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum） 和 微 綠 球 藻（Nannochloropsissp.）中EPA 的積累占總脂肪酸的比例可分別高達(dá)57%[45]和68%[46]。產(chǎn)油微藻的培養(yǎng)方式以異養(yǎng)為主，因此影響微藻PUFAs 積累的主要因素是培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分。高山被孢霉油脂中PUFAs 的占比較大，但由于生物量的限制，無(wú)法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。Shi 等[41]指出Δ6 去飽和酶的過(guò)表達(dá)使得Mortierella alpinaATCC 32222 在培養(yǎng)基中添加前體的情況下EPA 產(chǎn)量增加26.2 倍，達(dá)到588.5 mg/L。相比于以上所述的基因工程菌株，本研究構(gòu)建的B-sh-ER敲入菌株在提高生物量同時(shí)，EPA 的占比也大幅度提升，對(duì)于EPA 的工業(yè)化生產(chǎn)有一定的借鑒意義。在后續(xù)的研究中，將結(jié)合菌株培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)基成分的優(yōu)化進(jìn)一步提高EPA 的產(chǎn)量。

3 結(jié) 論

本研究根據(jù)前期對(duì)ER 基因功能的鑒定，選擇了將Shewanellasp.SCRC2738PKS基因簇上的ER基因和具有高產(chǎn)PUFAs 潛力的Schizochytrium limacinumSR21 的ER基因相結(jié)合進(jìn)行研究：在Schizochytrium limacinumSR21 的ORFC-ER基 因 和ORFB-ER基因的位置分別敲入sh-ER基因進(jìn)行替換，進(jìn)一步研究ER基因功能的同時(shí)，提高EPA 的產(chǎn)量。B-sh-ER敲入菌株相比于野生型菌株油脂產(chǎn)量提高9.38%（P< 0.05），其中EPA 占比增加最為顯著，提高了85.71%（P<0.01），達(dá)到0.78%；而C-sh-ER敲入菌株單位細(xì)胞油脂含量可以恢復(fù)到野生型菌株的水平，但由于細(xì)胞生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，因此菌株總油脂產(chǎn)量明顯降低。B-sh-ER敲入菌株的發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵結(jié)果表明B-sh-ER敲入菌株最大生物量高于野生型菌株42.46%，總油脂和EPA產(chǎn)量分別增加了28.70%和71.6%，達(dá)到73.24 g/L 和732.40 mg/L。根據(jù)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在裂殖壺菌的ORFB-ER基因上敲入sh-ER基因有利于協(xié)同PKS 途徑基因的表達(dá)，促進(jìn)PUFAs 尤其是EPA的合成。B-sh-ER敲入菌株的構(gòu)建為PUFAs合成的調(diào)控提供了新的思路，為EPA 的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

圖8 野生菌株和B-sh-ER菌株的補(bǔ)料分批發(fā)酵參數(shù)
(a)生物量;(b)總油脂量;(c)EPA產(chǎn)量;(d)DHA產(chǎn)量;(e)EPA×100/DHA
Fig.8 Fed-batch fermentation parameters of wild strain and B-sh-ERstrain

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