耐有機(jī)溶劑氨基酸脫氫酶基因挖掘與非天然氨基酸的非水相合成

段凌暄，姚光曉，江亮，王世珍

（廈門(mén)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)工程與生物工程系，福建廈門(mén)361005）

引 言

非水相酶催化在手性中間體藥物合成、精細(xì)化學(xué)品和生物能源生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[1-2]。脂肪酶、酯酶等水解酶非水相體系催化研究已經(jīng)廣泛開(kāi)展[3]，而針對(duì)耐有機(jī)溶劑氧化還原酶的研究較少。氧化還原酶結(jié)構(gòu)復(fù)雜，往往由多個(gè)亞基組成，并具有輔酶和底物等多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，以及催化、調(diào)控等多個(gè)功能模塊，因此在有機(jī)溶劑體系中易失活。開(kāi)發(fā)耐有機(jī)溶劑的氧化還原酶不僅可用于非水相體系制備手性化合物、開(kāi)發(fā)體外診斷試劑和有機(jī)相酶?jìng)鞲衅鱗4]，也可為構(gòu)建非水相體系的體外合成生物學(xué)平臺(tái)提供支撐。對(duì)耐有機(jī)溶劑的氧化還原酶性能的挖掘、開(kāi)發(fā)及其對(duì)溶劑體系的應(yīng)答有待進(jìn)一步研究。由于自然界缺乏大量有機(jī)溶劑存在的生境，通過(guò)篩選獲得耐受有機(jī)溶劑的氧化還原酶僅有少數(shù)報(bào)道[5]。

海洋、鹽湖等高鹽、高滲透壓等極端生境與有機(jī)溶劑體系中的低水活度相似。因此，部分嗜鹽、耐鹽菌株來(lái)源的耐鹽酶具有耐有機(jī)溶劑的特性，可用于非水相酶催化[6]。Alsafadi 等[7]報(bào)道了來(lái)源于Haloferax volcanii的嗜鹽醇脫氫酶在高鹽濃度下才能正確折疊并保持酶活性，二甲基亞砜（DMSO）和甲醇可以取代部分鹽以維持酶的結(jié)構(gòu)并提高酶穩(wěn)定性。Munawar 等[8]報(bào)道了來(lái)源于Halobacterium salinarum的谷氨酸脫氫酶分別在含10%的甲醇、乙醇、乙腈和二甲基亞砜反應(yīng)體系中，室溫下保存8 d基本保持活性。Timpson 等[9]發(fā)現(xiàn)來(lái)源于死海極端嗜鹽菌Haloarcula marismortui的乙醇脫氫酶對(duì)高鹽、高堿、有機(jī)溶劑具有良好的耐受性，并且最適溫度為60℃，在工業(yè)生物催化中具有應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。極端氧化還原酶具有與陸地來(lái)源酶迥異的底物特異性和催化性能，無(wú)疑會(huì)給眾多的生物催化領(lǐng)域增添新的活力[10-11]。來(lái)自極端環(huán)境的大多數(shù)微生物不可培養(yǎng)，即便獲得少數(shù)培養(yǎng)菌株，對(duì)培養(yǎng)條件要求也比較特殊，例如低溫、含鹽。因此研究極地等特殊環(huán)境中的微生物應(yīng)該采取特殊的培養(yǎng)技術(shù)以及基因組學(xué)數(shù)據(jù)挖掘與酶學(xué)性質(zhì)考察等研究方法相結(jié)合[12-15]。

氨基酸脫氫酶(amino acid dehydrogenase,AaDH)催化不對(duì)稱(chēng)還原胺化，可合成系列手性天然氨基酸、非天然氨基酸和手性胺等。這些手性化合物均為醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品添加劑等精細(xì)化學(xué)品的重要手性砌塊[16-17]。L-高苯丙氨酸可用于合成血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，包括苯那普利、依那普利、賴(lài)諾普利和奎那普利，已被廣泛用于治療高血壓和心臟病[18]。目前氨基酸脫氫酶的研究主要基于催化位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)的修飾提高活性、拓展底物譜和提高穩(wěn)定性，而對(duì)耐有機(jī)溶劑性能報(bào)道較少[19]。獲得高效穩(wěn)定、耐鹽、耐有機(jī)溶劑的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的氨基酸脫氫酶對(duì)于我國(guó)工業(yè)應(yīng)用和臨床檢測(cè)、擺脫對(duì)國(guó)外進(jìn)口試劑依賴(lài)有著極大意義。

本文針對(duì)耐有機(jī)溶劑的氨基酸脫氫酶難以通過(guò)點(diǎn)突變改造獲得的難題,基于極端微生物的基因組挖掘與分析，獲得耐鹽氨基酸脫氫酶特征序列并利用熱力學(xué)數(shù)據(jù)分析，進(jìn)一步模擬對(duì)接篩選獲得目標(biāo)酶。通過(guò)基因合成、表達(dá)和分離純化，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證?；谏镄畔W(xué)與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法，闡明耐有機(jī)溶劑酶的機(jī)制，發(fā)展催化效率提升策略。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 基因挖掘

基于NCBI和Microscope[20]基因數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)的資源，針對(duì)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的極端環(huán)境來(lái)源的菌株基因組序列，挖掘獲得潛在的極端氨基酸脫氫酶編碼基因。主要采用特征結(jié)構(gòu)域挖掘的方法，以與NAD(P)H 結(jié)合的NAD(P)-binding domain (結(jié)構(gòu)域ID：IPR016040)作為指針挖掘氨基酸脫氫酶，以避免未被明確標(biāo)注功能的脫氫酶序列的漏檢。

1.2 序列比對(duì)與同源模建

對(duì)已篩選獲得的氨基酸脫氫酶進(jìn)行分析，利用Blast 等[21]進(jìn)行基因序列比對(duì)，選擇親緣性較遠(yuǎn)的具有代表性的酶分別進(jìn)行同源模建。采用iTasser 網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器進(jìn)行同源模建[22]，獲得蛋白三維結(jié)構(gòu)圖，利用SWISS-MODEL 獲得拉氏構(gòu)象圖[23]，對(duì)所獲得的立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行Ramachandran 構(gòu)象評(píng)價(jià)，獲得的結(jié)構(gòu)模型在允許區(qū)和最大允許區(qū)的氨基酸殘基占整個(gè)蛋白質(zhì)的比例高于90%，認(rèn)為該模型的構(gòu)象符合立體化學(xué)的規(guī)則，結(jié)構(gòu)合理。

1.3 熱力學(xué)參數(shù)模擬計(jì)算

將同源模建獲得的酶的結(jié)構(gòu)模型提交Scoop 網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器(http://babylone.ulb.ac.be/SCooP)，通過(guò)計(jì)算獲得表征酶熱穩(wěn)定性的熱力學(xué)參數(shù)，包括焓變(ΔHm), Gibbs 自由能變化(ΔGr),蛋白質(zhì)熱容量變化(ΔCp)和蛋白溶解溫度(Tm)[24]。

1.4 結(jié)構(gòu)比對(duì)與底物對(duì)接

將酶與天然底物L(fēng)-苯丙氨酸和非天然氨基酸底物L(fēng)-高苯丙氨酸進(jìn)行對(duì)接。小分子模型由ChemBioDraw 繪制2D 結(jié)構(gòu)式，隨后轉(zhuǎn)化為3D 結(jié)構(gòu)，并且對(duì)3D 結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化操作來(lái)優(yōu)化結(jié)構(gòu)。對(duì)接工作通過(guò)AutoDock4.0 完成。輸入配體文件后首先進(jìn)行加氫、加電荷等準(zhǔn)備工作，并保存為pdbqt格式。隨后在A(yíng)utoDock 中載入NT2349 蛋白結(jié)構(gòu)作為受體。進(jìn)行去除水分子，氨基酸殘基加氫、加電荷等準(zhǔn)備工作，同樣轉(zhuǎn)化為pdbqt 文件。在準(zhǔn)備工作完成后，對(duì)受體進(jìn)行活性空腔的掃描，確定對(duì)接區(qū)域。并設(shè)置對(duì)接參數(shù)，利用AutoDock中的Vina程序完成對(duì)接工作。

1.5 酶的表達(dá)和分離純化

所用的菌株為重組表達(dá)菌株E.coliBL21(pET28a-AaDH)，氨基酸脫氫酶(NT2349)的制備經(jīng)過(guò)了基因合成、質(zhì)粒導(dǎo)入、菌株活化、誘導(dǎo)培養(yǎng)等步驟。

表達(dá)NT2349 的重組大腸桿菌活化[25]：從-20℃保存的甘油管中取出保存的NT2349 菌種，以1%的比例接種。LB 培養(yǎng)基中加入卡那霉素至終濃度為40μg/ml，37℃，200 r/min下過(guò)夜培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)：取2 ml 上述活化后的菌液加入到200 ml經(jīng)滅菌的LB培養(yǎng)基中，加入200μl卡那霉素，37℃、200 r/min下培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8。

誘導(dǎo)表達(dá)：待培養(yǎng)基OD600為0.6～0.8 后，加入200 μl 乳糖誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至其終濃度為0.1 mol/L，25℃條件下，200 r/min繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)12～14 h。

純化：收集細(xì)胞并將其重懸于上樣緩沖液(20 mmol/L Tris，0.25 mol/L NaCl，pH7.4)，通過(guò)細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲破碎、離心獲得上清液即為粗酶液，將粗酶液通過(guò)膜濾器過(guò)濾并加入Ni-NTA His Bind Resin(重力預(yù)裝柱)上進(jìn)行結(jié)合，用15 倍柱體積的洗雜緩沖液(20 mmol/L 咪唑，20 mmol/L Tris(pH7.4),0.25 mol/L NaCl)沖洗柱子,然后用15 倍柱體積的洗脫緩沖液(200 mmol/L 咪唑，20 mmol/L Tris (pH7.4)，0.25 mol/L NaCl)洗脫目的蛋白。最后采用Macrosep超濾管(截留分子量10×103)進(jìn)行濃縮和脫鹽，得到純酶。

1.6 酶活性測(cè)定

NT2349 屬于輔酶NAD+/NADH 依賴(lài)型，酶活測(cè)定方法是檢測(cè)NADH 吸光值的變化。酶活力測(cè)定定義為：在30℃下，每分鐘消耗氧化1 μmol NADH所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位。在Gly-NaOH (pH 10)緩沖液體系中催化底物L(fēng)-苯丙氨酸(L-Phe)氧化脫氨生成苯丙酮酸，同時(shí)輔酶NAD+轉(zhuǎn)化為NADH。在NH4Cl-NH3·H2O(pH 8.5)緩沖液體系中催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(EOPB)還原胺化生成L-高苯丙氨酸(L-HPA)，同時(shí)將NADH 轉(zhuǎn)化為NAD+。檢測(cè)由NADH 的生成而導(dǎo)致的340 nm 處吸光度的變化，即可測(cè)定酶活。

1.7 圓二色譜表征方法

在Gly-NaOH 緩沖液體系中加入有機(jī)溶劑(乙醇，正丁醇，環(huán)己烷，甲基叔丁基醚)。在含30%有機(jī)溶劑的緩沖溶液中加入AaDH，4℃下放置6 h，測(cè)定190～250 nm 的遠(yuǎn)紫外區(qū)的圓二色譜，以不添加有機(jī)溶劑的緩沖液體系中酶的圓二色譜數(shù)據(jù)作為對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因挖掘

針對(duì)NCBI、Microscope 等網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的嗜熱、嗜鹽，以及雙嗜極的嗜熱嗜堿、嗜鹽嗜堿等菌株基因組序列，挖掘獲得潛在的耐有機(jī)溶劑、耐熱的極端氨基酸脫氫酶編碼基因。以NAD(P)H 結(jié)合的domain(IPR016040)作為探針，采用結(jié)構(gòu)域比對(duì)的方法進(jìn)行挖掘，避免未被明確標(biāo)注功能的脫氫酶序列的漏檢。 獲得了來(lái)源于嗜熱(Geobacillus kaustophilus、Natranaerobius thermophilus、Thermotoga maritima)、嗜 鹽(Halobacterium salinarum、Haloferax volcanii)以及嗜熱嗜堿(Anaerobranca gottschalkii、Halothermothrix orenii)、嗜 鹽 嗜 堿(Euhalothecenatronophila、Ferroplasma acidiphilum)等嗜極微生物的16種脫氫酶的基因序列(表1)。

表1 篩選獲得的來(lái)源于極端微生物的氨基酸脫氫酶Table 1 Screening of amino acid dehydrogenases from extremophiles

2.2 親緣分析與同源模建

對(duì)上述來(lái)源于嗜鹽、嗜熱等極端微生物的氨基酸脫氫酶進(jìn)行親緣關(guān)系分析（圖1）。利用Blast等進(jìn)行基因序列與氨基酸序列比對(duì)，從基因序列新穎性、進(jìn)化關(guān)系等角度進(jìn)行分析，并結(jié)合菌株所在生境確定后續(xù)研究的目標(biāo)基因。

進(jìn)化樹(shù)種垂直方向可以看出不同物種之間進(jìn)化關(guān)系的遠(yuǎn)近，距離接近說(shuō)明親緣關(guān)系接近。對(duì)嗜鹽酶的研究可得知，嗜鹽酶中含有較多的天冬氨酸和谷氨酸是蛋白嗜鹽的關(guān)鍵因素之一[26]。從序列分析中可以看出在嗜熱、嗜鹽蛋白中也存在較多的酸性氨基酸(Asp、Glu)。選擇符合嗜鹽酶特征，且親緣性較遠(yuǎn)的8個(gè)具有代表性的氨基酸序列酶進(jìn)行后續(xù)分析。

2.3 酶的熱力學(xué)參數(shù)篩選

經(jīng)過(guò)上述篩選獲得的8個(gè)氨基酸脫氫酶序列采用iTasser 網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器進(jìn)行同源模建，獲得蛋白三維結(jié)構(gòu)圖，利用iTasser 中ModRefiner 將同源模建獲得的結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，獲得平衡態(tài)下的蛋白三維結(jié)構(gòu)模型。利用SWISS-MODEL 對(duì)所獲得的立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行Ramachandran 構(gòu)象評(píng)價(jià)，獲得了拉氏構(gòu)象圖?；赟coop 模擬計(jì)算來(lái)源于不同生境的極端菌株的氨基酸脫氫酶的熱力學(xué)參數(shù)，包括蛋白熔點(diǎn)(Tm)、失活自由能變化(ΔGr)以及蛋白熱容量變化(ΔCp)(表2)?；谶@些熱力學(xué)參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)選具有良好穩(wěn)定性能的氧化還原酶。

反應(yīng)體系為催化制備高苯丙氨酸，因此優(yōu)選苯丙氨酸脫氫酶。由于嗜熱酶的熱穩(wěn)定性?xún)?yōu)于嗜鹽酶，因此選擇標(biāo)準(zhǔn)不能僅以Tm等熱力學(xué)參數(shù)作為唯一判斷標(biāo)準(zhǔn)。嗜鹽酶具有較密集的氫鍵和鹽橋等相互作用網(wǎng)絡(luò)，綜合考察其表面電荷分布和帶電性能以及酶表面酸堿性氨基酸的分布。綜合考慮酶所來(lái)源的極端菌株的嗜鹽性能，優(yōu)選來(lái)源于嗜熱菌的Natranaerobius thermophiles苯丙氨酸脫氫酶NT2349進(jìn)行酶結(jié)構(gòu)特征研究(圖2)。

圖1 篩選獲得極端微生物的氨基酸脫氫酶的親緣關(guān)系分析圖Fig.1 Phylogenetic analysis of genetic relationship among screened AaDHs

表2 不同極端菌株來(lái)源的氨基酸脫氫酶的熱力學(xué)參數(shù)比較Table 2 Comparison of thermodynamic parameters of amino acid dehydrogenases from extremophiles

2.4 氨基酸脫氫酶與底物相互作用

利用Protein Contacts Atlas(https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/rajini/index.html)進(jìn)行底物結(jié)合位點(diǎn)的相互作用分析[27]，如圖3 所示。圖3(a)顯示與底物結(jié)合的活性位點(diǎn)氨基酸殘基，圖3(b)顯示NT2349 的活性位點(diǎn)上的重要的氨基酸殘基與底物苯丙氨酸的相互作用的強(qiáng)度比較。從相互作用熱點(diǎn)圖（Heatmap圖）圖3(b)可以看出，底物與活性位點(diǎn)的氨基酸殘基N264、N265、Y287 等具有多層次的相互作用。因此，在后續(xù)DOCK對(duì)接中，選擇這些具有較高相互作用的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接。

2.5 底物對(duì)接

將酶與天然底物L(fēng)-苯丙氨酸和非天然底物L(fēng)-高苯丙氨酸進(jìn)行對(duì)接，活性位點(diǎn)選擇上述研究中發(fā)現(xiàn)的具有較高相互作用的殘基進(jìn)行與底物的對(duì)接，分析底物結(jié)合位點(diǎn)與底物相互作用的差異。首先對(duì)NT2349與天然底物苯丙氨酸對(duì)接,AutoDock 對(duì)接完成后，將對(duì)接結(jié)果按照對(duì)接能量由低到高排序。選取能量最低的構(gòu)象，保存為PDB 結(jié)構(gòu)。在Discover Studio 中進(jìn)行作圖，選定配體后查看配體與蛋白的作用力。

圖3 NT2349與底物的二級(jí)結(jié)構(gòu)相互作用圖(a)NT2349的氨基酸殘基與苯丙氨酸相互作用圖;(b)NT2349活性位點(diǎn)與苯丙氨酸相互作用的Heatmap圖Fig.3 Interactions of secondary structure of NT2349 with L-phenylalanine(a)key residues interact with L-phenylalanine;(b)interaction Heatmap of active site with L-phenylalanine

從三維結(jié)構(gòu)空間查看對(duì)接結(jié)果，L-苯丙氨酸(phenylalanine)和L-高苯丙氨酸(homophenylalanine)位于同一個(gè)對(duì)接區(qū)域，都為兩結(jié)構(gòu)域之間的空腔，說(shuō)明對(duì)接位點(diǎn)選取位置合理。NT2349 與L-高苯丙氨酸的結(jié)合能為-3.82 kcal/mol，在合理的結(jié)合能范圍內(nèi)。圖4 可見(jiàn)，底物L(fēng)-高苯丙氨酸與酶的結(jié)合以氫鍵等作用力為主。底物的酮基與Asn265 殘基形成氫鍵；底物的氨基與Asn265、Tyr287 形成氫鍵；底物的酮基與Asn264 形成了碳?xì)滏I。底物中的苯環(huán)與Met67、Leu63、Lys70、Tyr287 的氨基酸殘基形成較弱的π相互作用力。

2.6 苯丙氨酸脫氨氧化反應(yīng)

在上述的模擬篩選的基礎(chǔ)上，擇優(yōu)選擇來(lái)源于Natranaerobius thermophilus的氨基酸脫氫酶(NT2349)進(jìn)行基因合成和表達(dá)，分離純化獲得酶。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證酶催化性能和抗逆性能。分別考察了溫度、pH 及有機(jī)溶劑對(duì)NT2349 催化氧化脫氨和還原胺化的活性的影響。在Gly-NaOH 緩沖液中催化L-苯丙氨酸的氧化脫氨生成苯丙酮酸的反應(yīng)(圖5)。

研究NT2349 在不同溫度下的氧化脫氨催化活性。如圖6 所示，NT2349 在30～80℃下均保持85%以上的高催化活性。NT2349 在60℃下活性達(dá)到最大值，之后隨溫度升高，活性下降。

對(duì)于氧化脫氨活性反應(yīng)體系的pH，如圖7 所示，隨著pH 遞增，酶活力呈上升趨勢(shì)，在pH 12時(shí)酶活力達(dá)到最大值，之后隨pH 繼續(xù)升高，酶活力迅速下降。因此，氧化脫氨活性反應(yīng)體系的最適pH 為12，說(shuō)明該酶可適應(yīng)高堿性條件。高堿性條件可改變酶結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的帶電狀態(tài)和質(zhì)子化狀態(tài)，易造成酶失活。目前鮮有報(bào)道可適應(yīng)如此高pH 的氨基酸脫氫酶。

測(cè)定含有30%的有機(jī)溶劑的體系對(duì)NT2349 氧化脫氨活性的影響。本實(shí)驗(yàn)選擇8 種有機(jī)溶劑，以不添加有機(jī)溶劑的緩沖液體系中測(cè)得酶活作為100%計(jì)算相對(duì)酶活，結(jié)果如圖8。研究發(fā)現(xiàn)，在30%的二甲亞砜溶劑中，酶表現(xiàn)出最好的氧化脫氨活性，相較于不含有機(jī)溶劑的緩沖液體系，其活性提高了20.0%。在30%的甲基叔丁基醚和30%的環(huán)己烷溶劑中，酶的活性分別提高了13.5%和11.5%。而30%的乙醇、正丁醇、乙腈、異丙醇和丙酮有機(jī)溶劑均對(duì)酶的氧化脫氨活性產(chǎn)生了抑制作用。

考察NT2349 在30%有機(jī)溶劑下的催化氧化脫氨反應(yīng)的酶活穩(wěn)定性。從圖9 看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶在30%有機(jī)溶劑下酶活性下降。NT2349 在30%甲基叔丁基醚和環(huán)己烷中保溫24 h，分別保留93.2%和91.7%的酶活。在含有30%二甲亞砜和丙酮的體系中保溫24 h，僅保持64.6%和22.4%的殘余酶活。實(shí)驗(yàn)表明，酶在含有30%的甲基叔丁基醚(MTBE)和環(huán)己烷有機(jī)溶劑下催化氧化脫氨反應(yīng)時(shí)，具有良好的有機(jī)溶劑耐受性能。二甲亞砜和丙酮的極性比甲基叔丁基醚強(qiáng)，易造成酶失活。氫鍵和鹽橋作用力是維持蛋白結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵作用力。氨基酸殘基與水分子形成氫鍵，從而形成蛋白表面的水合層[28]。極性有機(jī)溶劑可影響酶表面的結(jié)合水層，進(jìn)一步破壞酶的空間結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)發(fā)生變性而失活，并可能滲透到酶活性中心影響酶與底物的結(jié)合[29]。

圖4 NT2349與高苯丙氨酸對(duì)接結(jié)果(a)NT2349與高苯丙氨酸的對(duì)接;(b)3D相互作用力;(c)2D相互作用力示意圖Fig.4 Docking of NT2349 with L-homophenylalanine

2.7 還原胺化制備高苯丙氨酸

考察酶催化底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(EOPB)還原胺化高選擇性制備L-高苯丙氨酸(圖10)。

研究NT2349 在不同溫度下的還原胺化催化活性。如圖11 所示，NT2349 在30～80℃下都保持著90%以上的高催化活性，且在70℃下酶活達(dá)到最大值，而后隨溫度升高酶活有所下降。

測(cè)定不同pH 的緩沖液中還原胺化反應(yīng)的酶活，如圖12所示。NT2349催化EOPB 的還原氨化反應(yīng)在pH 為8.5 時(shí)酶活力達(dá)到最大值；pH 大于8.5，酶活性呈下降趨勢(shì)。因此，該酶在不同催化體系中的最適pH有較大差異。

測(cè)定有機(jī)溶劑對(duì)NT2349 還原胺化活性的影響。在本實(shí)驗(yàn)中選擇8 種有機(jī)溶劑作為反應(yīng)溶劑(圖13)。研究發(fā)現(xiàn)，在含有30%的甲基叔丁基醚和二甲亞砜的反應(yīng)體系中，相較于在NH4Cl-NH3·H2O緩沖液中，酶的還原胺化活性分別保持99.2%和101.3%。而30%的乙醇、正丁醇、乙腈、異丙醇和丙酮均大幅度抑制了酶的活性。

總體來(lái)看，在30%的二甲亞砜溶劑中，酶催化還原胺化活性最高。有機(jī)溶劑中酶與底物接觸在一定程度上受到擴(kuò)散限制的影響。二甲亞砜是極性溶劑，與水互溶，可提高難溶于水的底物EOPB 的溶解度[30]。

研究酶在30%有機(jī)溶劑下的催化還原胺化反應(yīng)的穩(wěn)定性。從圖14 看出，NT2349 在30%二甲亞砜中保溫，酶活性呈先下降后上升再下降最后達(dá)到穩(wěn)定的趨勢(shì)，24 h 后剩余77.8%酶活。在30%環(huán)己烷中酶活性呈逐漸下降趨勢(shì)，24 h 后僅剩余20.0%酶活。在30%甲基叔丁基醚中24 h 后酶僅剩余25.1%的活性。有機(jī)溶劑對(duì)酶穩(wěn)定性的影響與溶劑極性關(guān)系較大。一般而言，蛋白的柔性在含非極性有機(jī)溶劑的疏水環(huán)境中下降，增加了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，而強(qiáng)極性有機(jī)溶劑易造成酶失活。

2.8 二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

酶在一定比例的有機(jī)溶劑體系中構(gòu)象會(huì)發(fā)生改變，α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)Loop 區(qū)的構(gòu)象均可能改變，導(dǎo)致酶活發(fā)生變化[30-31]。運(yùn)用圓二色譜研究酶在有機(jī)溶劑中二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。該酶的α-螺旋結(jié)構(gòu)在192 nm 處有一正譜帶；β-折疊在195～200 nm有一正譜帶；β-轉(zhuǎn)角在205 nm 處有一正譜帶，而在220～230 nm處有一個(gè)弱的負(fù)譜帶。

圖5 AaDH 催化L-苯丙氨酸(L-Phe)的氧化脫氨反應(yīng)Fig.5 AaDH catalyzes the oxidative deamination of L-phenyalanine

圖6 溫度對(duì)NT2349的氧化脫氨活性影響Fig.6 Effect of temperature on oxidative deamination activity of NT2349

圖7 pH對(duì)NT2349的氧化脫氨活性影響Fig.7 The effect of pH on oxidative deamination activity of NT2349

從圖15 可以看出，NT2349 在水溶液中，在192 nm處有一正譜帶，為α-螺旋結(jié)構(gòu)；在197 nm處有一正譜帶，為β-折疊結(jié)構(gòu)；在205 nm 處有一正譜帶，在222 nm 處有一個(gè)弱的負(fù)譜帶，為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。在四種有機(jī)溶劑中，192 nm 處的正譜帶峰都減弱，α-螺旋結(jié)構(gòu)受到了影響。與水溶液中的NT2349 相比，在乙醇和甲基叔丁基醚中，β-折疊結(jié)構(gòu)在195 nm處的正譜帶位置左移了約2 nm；在正丁醇和環(huán)己烷中β-折疊結(jié)構(gòu)的譜圖位置沒(méi)有偏移。說(shuō)明乙醇和甲基叔丁基醚對(duì)β-折疊有一定影響。

圖8 有機(jī)溶劑對(duì)NT2349的氧化脫氨反應(yīng)酶活影響Fig.8 Effect of organic solvent on oxidative deamination activity of NT2349

圖9 有機(jī)溶劑體系中酶催化氧化脫氨的酶活穩(wěn)定性Fig.9 Enzyme activity stability of oxidative deamination of NT2349 in organic solvents

圖10 NT2349 催化EOPB的還原胺化反應(yīng)制備高苯丙氨酸Fig.10 NT2349 catalyzes the synthesis of L-homophenylalanine by reductive amination of EOPB

圖11 溫度對(duì)NT2349的還原胺化活性影響Fig.11 The effect of temperature on the reductive amination activity of NT2349

圖12 pH對(duì)NT2349的還原胺化活性影響Fig.12 The effect of pH on the reductive amination activity of NT2349

3 結(jié) 論

圖13 有機(jī)溶劑對(duì)NT2349的還原胺化反應(yīng)酶活影響Fig.13 Effect of organic solvent on the activity of reductive ammoniation reactivity

圖14 有機(jī)溶劑中NT2349催化還原胺化的酶活穩(wěn)定性Fig.14 Enzyme activity stability of NT2349 reductive amination in organic solvents

（1）挖掘和改造獲得抗逆酶以適應(yīng)工業(yè)生物催化所需的極端pH、高溫、高鹽和非水相等反應(yīng)體系是使酶從細(xì)胞走向生物反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)綠色生物制造的關(guān)鍵。本文研究了極端微生物來(lái)源的耐鹽氨基酸脫氫酶。

（2）首先，通過(guò)基因挖掘，獲得了17 個(gè)來(lái)源于極端微生物的氨基酸脫氫酶基因。進(jìn)而基于進(jìn)化分析、熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算和底物對(duì)接等，篩選獲得來(lái)源于Natranaerobius thermophilus的苯丙氨酸脫氫酶。考察了有機(jī)溶劑體系中該酶催化L-苯丙氨酸氧化脫氨和還原胺化制L-高苯丙氨酸的反應(yīng)特性。

（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該酶具有良好的有機(jī)溶劑耐受性，且可耐受較高的溫度和高pH 的堿性環(huán)境。目前的研究?jī)H僅針對(duì)一個(gè)非天然氨基酸底物進(jìn)行了氨基酸突變研究，可進(jìn)一步拓展耐有機(jī)溶劑苯丙氨酸脫氫酶的底物譜。

（4）該研究可為新型抗逆氧化還原酶資源的開(kāi)發(fā)應(yīng)用和生物催化新途徑開(kāi)發(fā)與催化性能提升提供方法借鑒。