熒光定量PCR檢測HBV-DNA與ELISA法乙肝免疫學(xué)檢測的探討

周曉瑩，林珠，胡塔，鄺炎波

（廣東省婦幼保健院 檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510010）

0 引言

乙型肝炎病毒是流行最廣，危害最嚴(yán)重的病毒性肝炎，在我國，HBV感染人群可達(dá)到60%以上，其中乙肝個體中10%可導(dǎo)致慢性攜帶狀態(tài)，其中一部分會發(fā)展成慢性肝炎，需接受抗病毒治療。臨床表現(xiàn)為惡心、食欲減退、腹部不適和肝區(qū)疼痛等癥狀。有些患者還可出現(xiàn)黃疸發(fā)熱和肝功能損害，若未進(jìn)行有效的治療和病情控制，可發(fā)展成肝硬化，甚或是肝癌[1]。因此，對乙肝病毒的檢測和診斷就非常重要了。乙肝逐漸成為世界性慢性疾病，在乙肝患者的診斷中，實(shí)時熒光定量PCR可通過敏感反應(yīng)HBV病毒水平，ELISA法能夠?qū)Σ⌒瓦M(jìn)行分型[2]。為了進(jìn)一步探討HBV-DNA和乙肝免疫學(xué)檢測的關(guān)系，指導(dǎo)臨床乙肝防治工作，現(xiàn)將乙型肝炎的兩種檢測結(jié)果進(jìn)行分析，現(xiàn)報告如下。

1 資料及方法

1.1 一般資料。研究對象是我院2018年4月至2020年4月在我院檢測的172份HBsAg反應(yīng)性的血液樣本，所有樣本均行ELISA法乙肝免疫學(xué)指標(biāo)檢測和熒光定量PCR檢測HBV-DNA。在這些標(biāo)本所屬的患者中，包括男性112例、女性60例，年齡：年齡18～66歲、平均（44.23±4.27）歲，所有患者的HBsAg均為陽性。根據(jù)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測方法（ECLIA）檢驗(yàn)結(jié)果的陰陽性進(jìn)行分組，大三陽組58例[HBsAg（+）HBcAb（+）HBeAg（+）]、小三陽組32例[HBsAg（+）HBcAb（+）HBeAb（+）]、A組38例[HBsAg（+）HBeAg（+）]、B組21例[HBsAg（+）HBeAg（-）]、C組23例[HBsAg（+）HBcAb（+）]。

1.2 方法。所有患者均接受ELISA法檢測和實(shí)時定量PCR檢測。ELISA法：儀器：采用深圳愛康公司生產(chǎn)的型號為AE280型的全自動酶免疫分析儀，檢測試劑。一檢試劑廈：門英科新創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn)，弱陽性質(zhì)控品濃度0.5 IU/mL；二檢試劑：北京萬泰生物藥業(yè)有限公司，弱堿性質(zhì)控品濃度0.2 IU/mL。所有患者的血清學(xué)檢測均由上述兩個不同廠家的試劑進(jìn)行兩次檢測，兩次均合格，此項結(jié)果合格，單試劑反應(yīng)性時需進(jìn)行雙孔復(fù)試，任意一孔反應(yīng)性則為不合格，不合格直接淘汰；雙試劑反應(yīng)性直接判定該項目不合格；不合格直接淘汰，不再行NAT檢測，對合格樣本行HBV-DNA檢測。檢測項目：乙肝表面抗原（HBSAg）、乙肝表面抗體（HBSAb）、e抗原（HBeAg）、e抗體（HBeAb）、核心抗體（HBcAb）熒光定量PCR法：儀器：科華核酸檢測系統(tǒng)：Hamiltion Star+ABI 7500擴(kuò)增儀。所用試劑均為傷害科華生物工程有限公司生產(chǎn)，質(zhì)控品濃度HBVDNA200 IU/mL、HCV-RNA2000 IU/mL、HIVRNA2000 IU/mL，各項操作按照流程進(jìn)行。

1.3 觀察指標(biāo)與評價標(biāo)準(zhǔn)。①大三陽組和小三陽組的HBV-DNA比較；②大三陽組和小三陽組的Ct值比較；③A/B/C組與HBV-DNA比較。采用定量法檢測標(biāo)準(zhǔn)：HBsAg＞0.5 IU/mL為陽性、HBsAb＞1.0 IU/mL為陽性；采用標(biāo)本相對光強(qiáng)度與臨界相對光強(qiáng)度比值檢測HBeAb、HBeAg、HBcAb，HBeAg＜1.0 S/co為陰性；HBeAb＞1.0 S/co為陰性；HBcAb＞1.0 S/co為陰性。

2 結(jié)果

2.1 大三陽組和小三陽組的HBV-DNA。大三陽的陽性檢出率為93.10%，小三陽組的為56.25%，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05，如表1所示。

表1 兩組大三陽組和小三陽組的HBV-DNA陽性檢出率對比表[n（%）]

2.2 大三陽組和小三陽組的Ct值比較。由檢測結(jié)果得知，大三陽組的Ct值顯著高于小三陽組，比較差異具備統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），如表2所示。

表2 大三陽組和小三陽組的Ct值對比表（±s）

表2 大三陽組和小三陽組的Ct值對比表（±s）

組別 例數(shù) Ct值大三陽 58 37.02±0.04小三陽 32 32.15±0.26 t-105.272 P-0.000

2.3 A/B/C三組與HBV-DNA對比。由檢測結(jié)果得知，A、B、C三組的陽性檢測率和Ct值比較均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05，如表3所示。

表3 A/B/C三組與HBV-DNA對比表

3 討論

乙型肝炎的流行性、傳染性受世界所關(guān)注，它直接增加了使患者發(fā)展成肝硬化、肝癌的幾率。在我國，乙肝攜帶者達(dá)到將近10%，嚴(yán)重威脅著我國居民的身體健康，安全、高效的檢測方法可幫助患者盡早確診，對延緩疾病及疾病的傳播有著重要的作用。當(dāng)前，用于乙肝的檢測方法較多，有實(shí)時熒光定量PCR法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）等，其中熒光定量PCR法可有效對HBV-DNA在機(jī)體復(fù)制情況進(jìn)行測定，操作簡單，有很高的利用率。ELISA法具有操作簡單、成本低、高靈敏度等優(yōu)勢，但此檢測只能達(dá)到定性的效果，無法對HBV感染具體情況進(jìn)行判斷，臨床上常將ELISA法和PCR法聯(lián)合應(yīng)用[3]。

ELISA法是一種讓抗體和酶復(fù)合物結(jié)合，通過顯色來檢測的方法，使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，使酶標(biāo)抗原或抗體既保持酶的活性也保留其免疫活性。臨床上常用ELISA法診斷HBV感染，它檢測的是機(jī)體對HBV的免疫反應(yīng)情況實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是指將熒光基因加入PCR反應(yīng)體系，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測PCR進(jìn)程，最后通過曲線對未知模板進(jìn)行定量分析，PCR是可準(zhǔn)確的反映出HBV-DNA的、病程變化、復(fù)制水平以及預(yù)后判斷等。當(dāng)HBsAg為陽性，就表示存在HBV感染，如急慢性肝炎或無癥狀攜帶者。

本研究結(jié)果中，大三陽的陽性檢出率高于小三陽組，且大三陽組的C值也高于小三陽組，由結(jié)果得知，大三陽患者體內(nèi)的乙肝病毒非?；钴S，有較強(qiáng)的傳染性，同時也反映了HBsAg陽性和HBeAg陽性可對乙肝病毒的感染、傳染得以反應(yīng)。本研究結(jié)果還顯示A、B、C三組的陽性檢出率、Ct值比較，皆有差異，A組的陽性檢出率最高，說明，HBeAg在乙肝患者體內(nèi)的存在和HBV-DNA有非常緊密的聯(lián)系，臨床上可將HBeAg作為乙肝病毒在體內(nèi)復(fù)制的依據(jù)，若其轉(zhuǎn)陰，說明HBVDNA復(fù)制水平下降，可用于乙肝治療效果和病情監(jiān)測指導(dǎo)。若HBeAg為陰性，則患者乙肝病毒量減少，傳染性降低[4]。無論HBeAg是陽性還是陰性，都需定期去醫(yī)院復(fù)查，特別是HBeAg陽性患者，其乙肝病毒處于復(fù)制階段，HBV-DNA濃度也高。HBcAb單一陽性標(biāo)本，其HBV-DNA為陰性；單純HBcAb陽性中，排除假陽性，可存在HBV-DNA低水平復(fù)制。HBsAg陰性HBV-DNA為陽性，提示，HBV的S基因發(fā)生突變，說明HBsAg檢測試劑不能檢出HBsAg,PCR檢測在HBsAg出現(xiàn)前檢出HBV-DNA的感染及乙肝病毒的傳染性[5]。

綜上所述，ELISA法檢測免疫學(xué)指標(biāo)，PCR法檢測HBV-DNA，兩種方法結(jié)合使用，可更準(zhǔn)確的了解患者體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制情況，克服單一檢測的局限性，盡早幫助患者確診。