甘露糖對(duì)乳癌細(xì)胞增殖及表柔比星化療敏感度影響

衣俊羽,王圓媛,劉相萍,聶衛(wèi)紅,劉加秀,王海波

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 乳腺病診療中心;2 醫(yī)學(xué)研究中心)

沃伯格效應(yīng)(Warburg效應(yīng))是腫瘤代謝重編程的重要標(biāo)志之一[1],這種能量代謝異常也存在于乳癌中[2]。表柔比星(EPI)作為乳癌化療中常用的一線蒽環(huán)類(lèi)藥物,具有很好的抗腫瘤效果[3],但由于乳癌具有高異質(zhì)性,某些類(lèi)型乳癌對(duì)此類(lèi)藥物并不敏感[4]。有研究結(jié)果證明,甘露糖能抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖,增加其對(duì)順鉑類(lèi)或阿霉素類(lèi)化療藥物的敏感性[5]。本文擬探討甘露糖在乳癌細(xì)胞中的作用,以及甘露糖是否對(duì)EPI具有增敏作用,旨在為乳癌的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

RPIM-1640培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)于BI公司,甘露糖、葡萄糖、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)粉末、EPI均購(gòu)于Solarbio公司(北京),二甲基亞砜(DMSO)及GAPDH、Tubin、Caspas3、Caspase-8、Bax、Bcl-2 單克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。磷酸甘露糖異構(gòu)酶(MPI)單克隆抗體購(gòu)于Proteintech公司,正常乳腺細(xì)胞MCF-10A 和乳癌細(xì)胞株T-47D、BT-549、HCC1937、MCF-7均來(lái)自青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Western blot方法檢測(cè)MPI蛋白表達(dá)水平分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-10A、T-47D、BT-549、HCC1937和MCF-7細(xì)胞,加入RIPA 裂解液裂解蛋白,超聲處理2～3次,室溫下、12 000 r/min離心10 min,吸取上清后用BCA 法測(cè)量蛋白濃度。以每孔30μg 計(jì)算上樣量,SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上,脫脂奶粉封閉1.5 h,分別加入MPI(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)一抗于4 ℃搖床過(guò)夜,用PBST 洗膜3次,加相應(yīng)二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h,使用ECL顯色,待顯出條帶后進(jìn)行圖像分析。用Image J軟件分析條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示MPI的表達(dá)。

1.2.2MTT 方法檢測(cè)甘露糖對(duì)乳癌細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T-47D 和MCF-7 細(xì)胞,以2×107/L密度接種于24孔板,每孔加入100μL 細(xì)胞懸液,每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔,于37℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的孵箱中培養(yǎng)24 h,細(xì)胞融合度達(dá)20%～30%時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。為篩選甘露糖的實(shí)驗(yàn)濃度,將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的普通培養(yǎng)液)、甘露糖組(分別加入10、25、50 mmol/L甘露糖)和葡萄糖組(分別加入10、25、50 mmol/L葡萄糖),于120 h后每孔加入5 g/L 的MTT 溶液50μL,置于孵箱中4 h 后棄上清,再加入DMSO 500μL,室溫避光靜置15 min,分裝于96 孔板中(每孔150μL),應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)處吸光度(A)值。以單糖濃度為橫坐標(biāo),以細(xì)胞增殖率為縱坐標(biāo),繪制濃度曲線,確定甘露糖最終臨界濃度為25 mmol/L。為觀察甘露糖作用,細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的普通培養(yǎng)液)、甘露糖組(加入25 mmol/L 甘露糖)和葡萄糖組(加入25 mmol/L葡萄糖),在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2活細(xì)胞工作站中觀察120 h。采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)40、80和120 h細(xì)胞活性,并計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白)/(A對(duì)照組-A空白)×100%。

1.2.3MTT 方法檢測(cè)甘露糖對(duì)EPI的作用 為篩選EPI實(shí)驗(yàn)濃度,取T-47D 細(xì)胞分為對(duì)照組(加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的普通培養(yǎng)液)、EPI組(分別加入0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/L EPI),每孔加500μL培養(yǎng)液,培養(yǎng)120 h后應(yīng)用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性。以時(shí)間為橫坐標(biāo),以吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制EPI IC50濃度曲線,計(jì)算EPI IC50值。為了觀察甘露糖聯(lián)合EPI對(duì)細(xì)胞作用,取MCF-7 和T-47D 細(xì)胞隨機(jī)設(shè)為對(duì)照組(加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的普通培養(yǎng)液)、甘露糖組(加入25 mmol/L甘露糖)、葡萄糖組(加入25 mmol/L 葡萄糖)、EPI組(加入1μmol/L EPI)、甘露糖聯(lián)合EPI組(加入1μmol/L EPI+25 mmol/L 甘露糖)和葡萄糖聯(lián)合EPI組(加入1μmol/L EPI+25 mmol/L葡萄糖),根據(jù)1.2.2方法檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)處的吸光度(A)值,并計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.4MTT 法檢測(cè)乏氧條件下甘露糖及甘露糖聯(lián)合EPI對(duì)乳癌細(xì)胞的作用 取MCF-7和T-47D 細(xì)胞隨機(jī)設(shè)為對(duì)照組(加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的普通培養(yǎng)液)、甘露糖組(加入25 mmol/L 甘露糖)、葡萄糖組(加入25 mmol/L 葡萄糖)、EPI組(加入1μmol/L EPI)、甘露糖聯(lián)合EPI組(加入1μmol/L EPI+25 mmol/L甘露糖)和葡萄糖聯(lián)合EPI組(加入1μmol/L EPI+25 mmol/L葡萄糖),每孔加入培養(yǎng)液體積為500μL。于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.01 O2、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2(剩余體積以N2填充)的乏氧箱中繼續(xù)培養(yǎng)120 h,采用MTT 方法檢測(cè)細(xì)胞活性并計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.5Western blot方法檢測(cè)甘露糖對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T-47D 細(xì)胞,以2×107/L的密度接種于24孔板,隨機(jī)分為對(duì)照組(含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的普通培養(yǎng)液)、甘露糖組(25 mmol/L甘露糖)、葡萄糖組(25 mmol/L 葡萄糖),各組分別加入含相應(yīng)藥物培養(yǎng)液500μL,培養(yǎng)120 h后收集蛋白,取30μg上樣進(jìn)行電泳,封閉后分別加入Caspase-8(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)、Tubulin(1∶2 000)和GAPDH(1∶2 000),其余步驟同1.2.1。用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示Caspase-3、Caspase-8、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料結(jié)果以表示,多組數(shù)據(jù)比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析,組間兩兩比較采用LSD 法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各乳癌細(xì)胞株中MPI表達(dá)情況

MCF-10A、HCC1937、T-47D、BT-549和MCF-7細(xì)胞MPI表達(dá)量分別為0.74±0.04、0.63±0.01、0.38±0.02、0.41±0.05、1.44±0.06(n=6),各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=392.680,P＜0.05)。與正常乳腺細(xì)胞MCF-10A 相比,T-47D 細(xì)胞MPI表達(dá)量相對(duì)較低,MCF-7細(xì)胞表達(dá)相對(duì)較高,差異有顯著性(t=25.449、32.857,P＜0.05)。見(jiàn)圖1。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇MCF-7和T-47D 細(xì)胞作為研究細(xì)胞。

圖1 Western blot檢測(cè)乳癌細(xì)胞系中MPI的蛋白表達(dá)

2.2 甘露糖對(duì)T-47D 和MCF-7細(xì)胞增殖的影響

對(duì)照組、甘露糖組(10、25、50 mmol/L)、葡萄糖組(10、25、50 mmol/L)T-47D 增殖率比較差異有顯著性(F=20.194,P＜0.05)。見(jiàn)圖2A。在不影響細(xì)胞滲透壓的情況下,選用25 mmol/L作為各種單糖實(shí)驗(yàn)濃度。MTT 法檢測(cè)各組處理120 h T-47D和MCF-7細(xì)胞增殖率見(jiàn)表1。析因設(shè)計(jì)方差分析顯示,時(shí)間與甘露糖對(duì)T-47D 和MCF-7 的影響之間存在交互作用(F=25.201、54.618,P＜0.05)。與對(duì)照組相比,甘露糖組T-47D 細(xì)胞增殖率明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=33.192,P＜0.05),甘露糖組MCF-7增殖率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.804,P＞0.05)。見(jiàn)圖2B、C、D。

圖2 甘露糖對(duì)乳癌細(xì)胞增殖的影響

2.3 甘露糖聯(lián)合EPI對(duì)T-47D 細(xì)胞增殖的影響

對(duì)照組、EPI組(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/L)T-47D 細(xì)胞的增殖率見(jiàn)圖3A。EPI IC50濃度為1μmol/L,因此選取1μmol/L作為EPI實(shí)驗(yàn)濃度。甘露糖聯(lián)合EPI作用不同時(shí)間T-47D 和MCF-7細(xì)胞增殖率見(jiàn)圖3B、C。析因設(shè)計(jì)方差分析顯示,時(shí)間與甘露糖聯(lián)合EPI對(duì)T-47D 和MCF-7影響之間存在交互作用(F=12.636、232.438,P＜0.05)。與EPI組相比,甘露糖聯(lián)合EPI組T-47D 增殖率相對(duì)較低(t=22.901,P＜0.05),兩組MCF-7細(xì)胞增殖率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.4 乏氧條件下甘露糖及甘露糖聯(lián)合EPI對(duì)乳癌細(xì)胞增殖的影響

析因設(shè)計(jì)方差分析顯示,時(shí)間與甘露糖對(duì)T-47D 和MCF-7細(xì)胞增殖率影響之間存在交互作用(F=5.970、38.610,P＜0.05)。見(jiàn)圖3。與對(duì)照組相比,甘露糖組T-47D 和MCF-7細(xì)胞增殖率明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=24.538、35.158,P＜0.05);與EPI組相比較,甘露糖+EPI組T-47D 和MCF-7細(xì)胞增殖率顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=37.986、54.622,P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 有氧及乏氧條件下處理120 h各組T-47D細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞增殖率比較(n=6,χ/%,)

表1 有氧及乏氧條件下處理120 h各組T-47D細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞增殖率比較(n=6,χ/%,)

注:A 組為對(duì)照組;B 組為甘露糖組;C 組為葡萄糖組;D 組為EPI組;E組為甘露糖+EPI組;F組為葡萄糖+EPI組。

圖3 乏氧條件下甘露糖對(duì)乳癌T-47D和MCF-7細(xì)胞增殖的影響

2.5 甘露糖對(duì)T-47D 細(xì)胞凋亡蛋白作用

與對(duì)照組相比,甘露糖組及葡萄糖組T-47D 細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bax、Bcl-2 表達(dá)差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。見(jiàn)圖4、表2。

圖4 甘露糖聯(lián)合EPI對(duì)乳癌T-47D細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞增殖及蛋白表達(dá)影響

表2 甘露糖對(duì)T-47D 細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)水平的比較(n=6,)

表2 甘露糖對(duì)T-47D 細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)水平的比較(n=6,)

3 討 論

甘露糖是生活中常見(jiàn)己醛醣之一[6],具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前,甘露糖補(bǔ)充劑是Ib型糖基化先天性疾病的有效治療方式之一[7],而且甘露糖已被證明可以在體外抑制紅細(xì)胞的糖酵解,有望成為血糖檢測(cè)血液樣本中有效的葡萄糖防腐劑[8]。此外有研究表明,甘露糖衍生物如2-DG 等具有抑制乳癌細(xì)胞的作用[9]。EPI在臨床上多與2種或3種化療藥物聯(lián)合應(yīng)用[10],可能增加其他藥物的毒副作用。因此,找到一種既可以增加乳癌細(xì)胞對(duì)EPI的敏感性,同時(shí)又能減輕其所帶來(lái)的毒副作用的化療增敏劑迫在眉睫。甘露糖安全、無(wú)毒副作用,對(duì)人體有保護(hù)或營(yíng)養(yǎng)作用,并且具有一定程度的抗腫瘤作用。這些特點(diǎn)為甘露糖成為乳癌治療中理想的化療增敏劑提供了應(yīng)用基礎(chǔ)。

已有研究表明,甘露糖能抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖并增加腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑類(lèi)和阿霉素類(lèi)化療藥物的敏感性[3]。最新研究發(fā)現(xiàn),甘露糖在體內(nèi)外對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和遷移具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性的抑制作用[11]。本文研究結(jié)果顯示,有氧條件下,甘露糖組T-47D 細(xì)胞增殖率顯著低于對(duì)照組,表明甘露糖可以抑制乳癌細(xì)胞增殖,甘露糖聯(lián)合EPI組T-47D 細(xì)胞增殖率顯著低于EPI單藥組,提示甘露糖與EPI聯(lián)用可以顯著促進(jìn)乳癌細(xì)胞凋亡;而MCF-7細(xì)胞則對(duì)甘露糖并不敏感。本文Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,T-47D 和MCF-7細(xì)胞中MPI的表達(dá)差異有顯著性。有研究表明,MPI的缺失會(huì)通過(guò)甘露糖-6-磷酸大量累積而阻礙Warburg效應(yīng),進(jìn)而阻斷糖酵解途徑,同時(shí)刺激抑癌基因p53的活化,并進(jìn)一步維持p53的穩(wěn)定[12]。有研究顯示,腫瘤細(xì)胞對(duì)甘露糖的易感性與MPI的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[3]。本研究結(jié)果表明,低表達(dá)MPI的T-47D 細(xì)胞對(duì)甘露糖更易感,高表達(dá)MPI的MCF-7細(xì)胞對(duì)甘露糖并不敏感。本文研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)結(jié)論基本一致。表明MPI表達(dá)與乳癌細(xì)胞對(duì)甘露糖的易感性密切相關(guān)。

本文研究結(jié)果表明,乏氧條件下甘露糖組及甘露糖聯(lián)合EPI組T-47D 和MCF-7細(xì)胞增殖率均顯著低于對(duì)照組和EPI單藥組,說(shuō)明乏氧條件下甘露糖可明顯抑制MCF-7和T-47D細(xì)胞增殖并增加其對(duì)EPI的敏感性。相較于正常有氧條件,乏氧因素可以增加甘露糖對(duì)乳癌細(xì)胞的抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn),低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1通過(guò)上調(diào)糖酵解中一系列進(jìn)行物質(zhì)及能量?jī)?chǔ)備活動(dòng)的相關(guān)基因表達(dá),間接地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解的發(fā)生[13]。乳癌細(xì)胞中HIF-1α和前梯度蛋白2(AGR2)的表達(dá)水平密切相關(guān)[14-15]。甘露糖的抑癌作用與HIF 介導(dǎo)的生物學(xué)信號(hào)通路之間的聯(lián)系有待驗(yàn)證。

本文研究還探討了甘露糖抑癌作用與常見(jiàn)線粒體凋亡通路[16-17]的關(guān)系,結(jié)果表明甘露糖組T-47D細(xì)胞線粒體凋亡通路常見(jiàn)蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bax、Bcl-2表達(dá)與對(duì)照組和葡萄糖組比較差異無(wú)顯著性,提示甘露糖抑制乳癌細(xì)胞增殖與線粒體凋亡通路無(wú)關(guān)。有研究表明,甘露糖與化療藥物聯(lián)用后可使結(jié)腸癌細(xì)胞中促凋亡蛋白NOXA 水平升高,而抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-XL和Mcl-1水平降低,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[3]。而甘露糖增加乳癌細(xì)胞對(duì)EPI敏感性機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。最近研究表明,甘露糖通過(guò)ERK/GSK-3β/β-catenin/SNAIL 通路抑制肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[11]。下一步將驗(yàn)證此通路與甘露糖抑制乳癌細(xì)胞增殖作用的聯(lián)系。

綜上所述,甘露糖具有抑制乳癌細(xì)胞增殖和遷移以及增加化療藥物敏感性等作用,但其機(jī)制尚不明確。甘露糖和MPI競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑有望成為乳癌治療中理想的化療增敏劑。