NLRP3基于IL-1β/TGF-β信號通路對心力衰竭小鼠室性心律失常易感性的調(diào)控機制研究

范群雄，段興剛，王磊，張濤

心力衰竭簡稱心衰，是一種由各種原因引起心臟結(jié)構(gòu)或心臟舒張、收縮功能異常而導(dǎo)致的心臟循環(huán)障礙癥候群，其發(fā)病率約0.9%，出院后3年病死率約30%，出院后5年病死率約60%[1]。室性心律失常是心衰常見并發(fā)癥之一，為心衰患者死亡的重要原因[2]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）是一種位于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)復(fù)合體，能夠識別應(yīng)激相關(guān)內(nèi)源性信號分子和多種病原微生物，在炎癥聯(lián)級反應(yīng)、固有免疫、動脈粥樣硬化、心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化等過程中具有重要作用[3]。當(dāng)炎癥反應(yīng)發(fā)生時，機體NLRP3大量釋放，其下游的炎性因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）表達水平亦會發(fā)生變化[4]。研究顯示[5]，以NLRP3炎性小體為中心的IL-1β/TGF-β信號通路在心肌缺血再灌注損傷過程中具有重要作用。研究報道[6]，NLRP3與心衰后心律失常有關(guān)，但其機制是否與IL-1β/TGF-β信號通路有關(guān)尚待研究。為此，本研究分析了NLRP3基于IL-1β/TGF-β信號通路對心衰小鼠室性心律失常易感性的調(diào)控機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD小鼠39只，清潔級，雄性，周齡6～8周，體質(zhì)量（200±20）g，購于上海睿智化學(xué)研究有限公司，許可證號：SYXK（滬）2019-0029。

1.2 動物分組、心衰小鼠造模及干預(yù)SD小鼠隨機分為對照組、模型組、干預(yù)組，每組各13只。模型組、干預(yù)組腹腔注射異丙腎上腺素（3 mg/kg，上海禾豐制藥有限公司），2/d，連續(xù)4周；對照組腹腔注射等量0.9%生理鹽水，2/d，連續(xù)4周。成功復(fù)制心衰小鼠模型后，干預(yù)組腹腔注射1 μl NLRP3 shRNA慢病毒載體（濃度2×106/μl，山東維真生物科技有限公司），模型組腹腔注射1 μl 0.9%生理鹽水（武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司）。超聲顯示射血分?jǐn)?shù)（EF）≤45%為心衰小鼠造模成功[7]。

1.3 評價項目造模成功后，繼續(xù)飼養(yǎng)4周評價以下指標(biāo)。記錄各組小鼠一般情況：包括小鼠精神、被毛、進食、活動量、體溫、呼吸、體重等情況。采集外周靜脈血2 ml，采用XL90超速低溫離心機（上海實維實驗儀器技術(shù)有限公司），3000 r/min離心15 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），利用Bio-Tek ELX800酶標(biāo)儀（北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司）和相關(guān)試劑盒（上海晶抗生物工程有限公司）檢測血清腦鈉肽（BNP）水平。麻醉小鼠，沿食管將一長約20 cm起搏電極插入，鼻尖至心搏最強處的距離為插入長度，進行12 V恒壓交流電擊18 s，2/d，連續(xù)3 d，第一次電擊后待大鼠心律恢復(fù)正常進行二次電擊。室性心律失常誘發(fā)3 d后，各組小鼠在麻醉狀態(tài)下行右側(cè)頸總動脈插管（將連接壓力換能器的插管經(jīng)右側(cè)頸總動脈逆行插入左心室），通過PowerLab生物信號采集與分析系統(tǒng)（上海埃德儀器國際貿(mào)易有限公司），測定并記錄左室舒張末壓（LVEDP）、左室收縮末壓（LVESP）。處死小鼠，剪下心臟，取心尖部心肌，PBS溶液沖洗，4%多聚甲醛溶液（北京索萊寶科技有限公司）固定，梯度酒精（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）脫水，二甲苯（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）透明，石蠟包埋成塊，切成5 μm連續(xù)切片，脫蠟水化，采用HE染色試劑盒（武漢百浩天生物科技有限公司）染色，流水沖洗，烘片0.5 h，脫水，透明，中性樹膠固封劑（上海邦景實業(yè)有限公司）封片，在MDS400光學(xué)顯微鏡（重慶奧特光學(xué)顯微鏡有限公司）下觀察心肌形態(tài)學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間兩兩比較采用SNK-Q檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，多組間計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況對照組小鼠精神、毛發(fā)、進食、活動量、體溫、呼吸、體重等情況均正常；模型組小鼠出現(xiàn)明顯心衰體征，即精神萎靡、被毛松軟、光澤度差、脫毛、蜷縮少動、行動遲緩、捕捉反抗減少、進食減少、呼吸加快、體重增長緩慢、體溫下降等；干預(yù)組心衰體征表現(xiàn)較模型組有所改善。

2.2 各組小鼠心肌病理變化對照組小鼠心肌結(jié)構(gòu)和形態(tài)正常，心肌細(xì)胞橫紋清晰，無腫脹、變性、壞死，心肌纖維排列有序，心肌間質(zhì)未見明顯炎性細(xì)胞浸潤；模型組小鼠心肌細(xì)胞肥大，橫紋模糊，心肌組織間可見大量炎性細(xì)胞浸潤，結(jié)締組織及膠原纖維明顯增加；干預(yù)組小鼠心肌結(jié)構(gòu)和形態(tài)趨于正常，橫紋較清晰，心肌細(xì)胞稍腫脹，結(jié)締組織及膠原纖維減少，組織間少量炎性細(xì)胞浸潤（圖1）。

圖1 各組小鼠心肌病理變化（HE染色×400；A：對照組；B：模型組；C：干預(yù)組）

2.3 各組小鼠心功能指標(biāo)及室性心律失常誘發(fā)率對比模型組小鼠LVESP、LVEDP、血清BNP水平較對照組高（Q=6.994、11.258、35.502，P均＜0.05）；干預(yù)組小鼠LVESP、LVEDP、血清BNP水平較對照組高（Q=3.419、6.853、25.110，P均＜0.05）；干預(yù)組小鼠LVESP、LVEDP、血清BNP水平較模型組低（Q=3.575、4.405、10.392，P均＜0.05）；模型組小鼠室性心律失常誘發(fā)率較對照組高（χ2=12.461，P＜0.001）；干預(yù)組小鼠室性心律失常誘發(fā)率較對照組高（χ2=2.889，P=0.089）；干預(yù)組小鼠室性心律失常誘發(fā)率較模型組低（χ2=4.248，P=0.039），表1。

表1 各組小鼠心功能指標(biāo)及室性心律失常誘發(fā)率對比

2.4 各組小鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β、TGF-β蛋白表達量比較模型組小鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β、TGF-β蛋白表達量較對照組高（Q=6.643、7.918、7.929，P均＜0.05）；干預(yù)組小鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β、TGF-β蛋白表達量較對照組高（Q=5.536、4.131、4.142，P均＜0.05），但干預(yù)組小鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β、TGF-β蛋白表達量較模型組低（Q=12.179、3.796、3.787，P均＜0.05），表2。

表2 各組小鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β、TGF-β蛋白表達量對比

3 討論

心力衰竭是一種復(fù)雜的臨床癥狀群，以組織血液灌注不足、體循環(huán)淤血為主要病理變化，以呼吸困難、體力活動受限、體液潴留為主要臨床表現(xiàn)，為心肌炎、高血壓性心臟病、高脂血癥、冠心病、急性心肌梗死（AMI）等心血管疾?。–VD）發(fā)展的終末階段[8]。其發(fā)病誘因繁多，病理機制復(fù)雜，涉及心臟負(fù)荷過度增加、炎癥損傷、心室重構(gòu)、內(nèi)分泌異常等[9]。因猝死而死亡的心衰患者約占總病死的40%～60%，其中多與心律失常有關(guān)，特別是室性心律失常[10]，因此，研究心力衰竭后室性心律失常的發(fā)病機制具有重要臨床指導(dǎo)意義。

NLRP3是一種大分子多蛋白復(fù)合體，分子量約700 Kda，分布于細(xì)胞內(nèi)。NLRP3也是重要的炎癥反應(yīng)調(diào)控因子，能與接頭蛋白ASC、半胱氨酸天冬氨酸酶-1結(jié)合形成炎性復(fù)合體，從而促進經(jīng)典炎癥因子IL-1β活化，調(diào)控促纖維化因子TGF-β表達。NLRP3活化與K+外流、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、組織蛋白酶釋放、活性氧族形成關(guān)系密切[11]。NLRP3在自身炎性反應(yīng)、動脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷等病理過程中具有重要作用[12]。研究顯示，活化后的NLRP3可通過促進IL-1β、IL-18合成，引起下游的炎癥反應(yīng)。文獻報道[14]，NLRP3可介導(dǎo)心肌細(xì)胞的炎癥聯(lián)級反應(yīng)，且能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化。研究顯示[15]，以NLRP3炎性小體為中心的IL-1β/TGF-β信號通路在心肌缺血再灌注損傷、心衰、心律失常、心室重構(gòu)等病理過程中具有重要作用。本研究中，模型組小鼠出現(xiàn)明顯心衰體征，心肌細(xì)胞肥大，心肌間質(zhì)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，結(jié)締組織及膠原纖維明顯增加，干預(yù)組小鼠心衰體征及心肌病理變化較模型組有所改善，提示下調(diào)NLRP3表達能夠改善心衰小鼠心衰體征及心肌病理變化。此外，模型組小鼠LVESP、LVEDP、血清BNP水平、室性心律失常誘發(fā)率較對照組顯著升高，干預(yù)組小鼠LVESP、LVEDP、血清BNP水平、室性心律失常誘發(fā)率較模型組顯著下降，提示下調(diào)NLRP3表達能夠改善心功能及降低室性心律失常易感性。此外，模型組小鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β、TGF-β蛋白表達量較對照組顯著升高，干預(yù)組小鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β、TGF-β蛋白表達量較模型組顯著下降，提示NLRP3、IL-1β、TGF-β在心衰小鼠中呈現(xiàn)高度激活狀態(tài)，而下調(diào)NLRP3水平后，IL-1β、TGF-β水平亦明顯下降，因此，下調(diào)NLRP3表達后心衰小鼠心衰體征及心肌病理變化改善、心功能改善、室性心律失常易感性降低可能與IL-1β/TGF-β信號通路受阻有關(guān)。分析得出，心衰時炎癥因子如IL-1β大量分泌，心肌發(fā)生持續(xù)的炎癥反應(yīng)，促纖維化因子如TGF-β1大量釋放，使心肌成纖維細(xì)胞活化，引起心肌組織纖維化，而成纖維細(xì)胞又能分泌促炎因子，促進炎癥細(xì)胞向心肌轉(zhuǎn)移，從而形成惡性循環(huán)；此外，心肌組織中的炎癥細(xì)胞也可直接分泌炎癥介質(zhì)來促進心肌纖維化，心肌纖維化后會造成心肌細(xì)胞排列不規(guī)整，結(jié)構(gòu)形態(tài)異常，心肌局部傳導(dǎo)異常，這種傳導(dǎo)異常會增加心律失常發(fā)生率。

綜上所述，NLRP3可能通過激活I(lǐng)L-1β/TGF-β信號通路而增加心力衰竭小鼠室性心律失常易感性，為臨床用藥提供新的方向。但本研究屬于小樣本研究，數(shù)據(jù)結(jié)果可能存在偏倚，尚待進一步考證。