經(jīng)皮無創(chuàng)耳迷走神經(jīng)刺激對阿霉素所致心臟毒性的保護(hù)作用

郭輔定，殷銘，賴燕秋，劉志豪，劉子韓，金曉星，江洪

阿霉素（DOX）是從鏈霉素菌屬中提取的具有抗腫瘤活性的蒽環(huán)類抗生素，具有作用廣譜、抗瘤效果好等特點，臨床廣泛用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實體腫瘤治療[1,2]。然而，DOX對心臟具有潛在的毒性作用[3]，可漸進(jìn)性、不可逆性的導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷、死亡，出現(xiàn)心肌病、心力衰竭、心律失常和冠狀動脈（冠脈）損傷等多種心血管疾病[4,5]。腫瘤幸存者中，心血管疾病的發(fā)病率與死亡率僅次于腫瘤復(fù)發(fā)[5]，心血管疾病是老年乳腺癌患者首位死因[6]。迷走神經(jīng)耳緣支是迷走神經(jīng)在體表的唯一分支，研究表明，低強(qiáng)度耳緣迷走神經(jīng)刺激（VNS）可顯著降低血清白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子水平，改善心功能指標(biāo)，減輕心肌梗死患者心肌缺血再灌注損傷[7]。此外，VNS可通過抑制炎癥反應(yīng)、減少活性氧（ROS）生成和抑制細(xì)胞凋亡，對心肌缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用[8]。DOX所致心臟毒性與促炎癥因子釋放和ROS生成密切相關(guān)[9]，然而，目前關(guān)于無創(chuàng)耳迷走神經(jīng)刺激（tVNS）對DOX所致心臟毒性的影響尚不清楚。本研究旨在探討tVNS對DOX所致心臟毒性的作用及其潛在機(jī)制，為臨床防治DOX所致心臟毒性提供新型干預(yù)策略。

1 材料與方法

1.1 實驗動物本研究經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。18只健康雄性SD大鼠（180～200 g）由武漢大學(xué)實驗動物中心提供，分籠飼養(yǎng)于SPF，每日給予充足標(biāo)準(zhǔn)飼料和蒸餾水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 模型建立18只健康SD大鼠隨機(jī)分為對照組、DOX組和DOX+tVNS組，每組各6只。對照組腹腔注射等量生理鹽水，常規(guī)飼養(yǎng)6周。DOX組和DOX+tVNS組腹腔注射DOX（Med Chenm Express公司），采用生理鹽水溶解并制備濃度為0.5 mg/ml的DOX溶液，每次5 mg/kg，1/周，共3次，累計劑量15 mg/kg，常規(guī)飼養(yǎng)6周。

1.3 tVNS干預(yù)將2個鱷魚夾與電壓刺激器（成都錦江，S20)相連，放置于DOX+tVNS組大鼠雙側(cè)外耳廓的耳屏內(nèi)側(cè)，即迷走神經(jīng)耳緣支。每天6～9 PM給予短暫重復(fù)電刺激，刺激設(shè)定為2 mA方形波、脈寬0.1 ms、刺激頻率20 Hz，每次持續(xù)刺激30 min，刺激6周。

1.4 超聲心動圖檢測實驗6周后，采用多普勒心臟超聲檢測三組大鼠左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、和左室短軸縮短率（LVFS）。LVFS計算公式如下：LVFS =[（LVEDd-LVESd）/LVEDd]× 100%。

1.5 采集血液和組織樣本安樂死前，通過腹主動脈采集血樣，放入裝有凝血劑的真空管中，常溫放置1 h，以3000 rpm離心15 min，4℃分離血清，置入-80℃冰箱儲存?zhèn)溆?。組織標(biāo)本取自左心室中段心肌用于組織學(xué)分析。

1.6 HE染色心肌組織樣品置于10%多聚甲醛溶液中固定24 h，在乙醇的遞增梯度中依次脫水，在二甲苯中脫蠟，將組織包埋在石蠟中，5 μm厚切片，HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織的形態(tài)學(xué)改變并攝片。

1.7 血清氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量測定將收集的血清樣本，按照SOD和MDA檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書中的操作步驟，測定血清中SOD、MDA含量，評估氧化應(yīng)激水平。

1.8 免疫熒光染色留取各組心肌組織樣本，10%多聚甲醛固定，行石蠟包埋、切片，進(jìn)一步行免疫熒光染色檢測心肌組織中促炎癥因子IL-1β的表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。每張切片隨機(jī)選取3個區(qū)域計數(shù)IL-1β，在400倍鏡下拍照。研究中使用的主要抗體：抗IL-1β（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析采用Graphpad 7.0軟件進(jìn)行分析，計量資料均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。差異采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 tVNS對DOX所致心臟毒性的保護(hù)作用與正常對照組相比，DOX組大鼠LVEF和LVFS均顯著減少，LVESd和LVEDd均明顯增大（P均＜0.05）。與DOX組相比，DOX+tVNS組大鼠LVEF和LVFS均明顯增大，LVESd和LVEDd均明顯減少（P均＜0.05，表1）。

表1 各組大鼠心功能比較

2.2 心肌形態(tài)學(xué)HE染色正常對照組大鼠心肌結(jié)構(gòu)完整，心肌纖維排列整齊，無斷裂，細(xì)胞間質(zhì)均勻，無水腫，細(xì)胞核清晰。DOX組大鼠心肌纖維紊亂、斷裂，可見心肌細(xì)胞壞死和大量炎癥細(xì)胞浸潤。DOX+tVNS組大鼠心肌細(xì)胞破壞較DOX組明顯減輕，心肌纖維無明顯斷裂，心肌細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少（圖1）。

圖1 tVNS對大鼠心肌病理結(jié)構(gòu)的影響（HE，×400）

2.3 各組大鼠血清SOD和MDA水平比較與對照組比較，DOX組SOD水平降低，MDA水平升高（P＜0.05）；與DOX組比較，DOX+tVNS組SOD水平顯著升高，MDA水平顯著降低（P＜0.05），圖2。

圖2 各組大鼠血清SOD和MDA水平比較（與對照組比較，aP＜0.01；與DOX組比較，bP＜0.01）

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞IL-1β的免疫熒光表達(dá)IL-1β蛋白在對照組和實驗組大鼠心肌細(xì)胞中均顯綠色。IL-1β蛋白在對照組中表達(dá)量最少，綠色熒光強(qiáng)度最弱，在DOX組中表達(dá)水平顯著升高，綠色熒光強(qiáng)度最強(qiáng)（圖3A）。與對照組比較，DOX組IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與DOX組比較，DOX+tVNS組IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）（圖3B）。

圖3 免疫熒光染色技術(shù)檢測各組心肌組織中IL-1β的表達(dá)（×400）

3 討論

DOX是臨床常用的有效抗腫瘤藥，但DOX所致的心臟毒性作用限制其應(yīng)用。關(guān)于DOX所致心臟毒性的機(jī)制尚不清楚，現(xiàn)有證據(jù)表明，氧化應(yīng)激及其持續(xù)伴隨的炎癥反應(yīng)是DOX誘導(dǎo)心臟毒性的共同特征和主要機(jī)制[9]。DOX首先蓄積在心肌細(xì)胞線粒體上，與心磷脂結(jié)合阻礙電子傳遞鏈，刺激ROS生成，造成心肌損傷[10]。ROS的積累和氧化損傷與炎癥反應(yīng)活化和心臟抗氧化防御系統(tǒng)紊亂有關(guān)[11,12]，DOX通過破壞ROS和抗氧化酶水平的平衡介導(dǎo)心臟毒性[13]。目前，DOX所致心臟毒性尚缺乏有效治療手段，仍以預(yù)防為主。

研究發(fā)現(xiàn)，蒽環(huán)類藥物使用與心臟交感神經(jīng)系統(tǒng)激活密切相關(guān)[14,15]，但目前關(guān)于自主神經(jīng)調(diào)控對DOX誘導(dǎo)心臟毒性影響的研究較少。新近專家共識表明，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑和β受體阻滯劑在經(jīng)DOX治療的患者中有潛在的心臟保護(hù)作用[16]，作用機(jī)制可能與三者均可降低交感神經(jīng)活性，拮抗交感神經(jīng)過度激活相關(guān)。研究表明，自主神經(jīng)在維持心臟正常功能中發(fā)揮重要作用，心臟自主神經(jīng)失平衡，尤其是交感神經(jīng)過度激活參與并介導(dǎo)了惡性室性心律失常、心力衰竭、心肌缺血等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[17-19]。拮抗交感神經(jīng)過度激活及增強(qiáng)迷走神經(jīng)活性已成為治療心血管疾病的方法。Stavrakis等[20]發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度VNS可顯著降低房顫患者血清炎癥因子水平，抑制房顫發(fā)生。我們近年研究結(jié)果表明，無創(chuàng)VNS可顯著降低心肌炎癥反應(yīng)和心肌纖維化程度，抑制再灌注心律失常的發(fā)生率和慢性心肌梗死后心室重塑[7,21,22]。VNS發(fā)揮心臟保護(hù)作用的機(jī)制可能與降低炎癥因子水平、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)[7,8]。本研究表明，tVNS干預(yù)可顯著改善大鼠心臟功能，減輕心肌結(jié)構(gòu)損傷，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激是目前已知DOX所致心臟毒性的經(jīng)典損傷機(jī)制，減少ROS生成可顯著改善DOX所致心肌損傷[23]。SOD是體內(nèi)一種重要的抗氧化應(yīng)激酶，與脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA一起，可間接反映氧自由基含量和氧化應(yīng)激損傷程度。SOD活性下降和MDA水平增高與DOX所致的心肌損傷密切相關(guān)[24]。既往研究表明，VNS可明顯升高SOD活性同時降低MDA水平，提高心肌抗氧化應(yīng)激能力[8,25]。本研究顯示，SOD活性下降和MDA水平增高共同參與了DOX所致心臟毒性，而tVNS可顯著逆轉(zhuǎn)SOD和MDA異常改變，減輕DOX對心肌細(xì)胞造成的損傷。

持續(xù)的炎癥反應(yīng)是DOX所致心臟毒性的重要因素。DOX可促進(jìn)炎癥因子IL-1β的釋放，造成心肌細(xì)胞損傷[26]。IL-1β是機(jī)體重要的促炎性細(xì)胞因子，可協(xié)同其他炎癥因子引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴。研究表明，VNS能顯著抑制免疫炎癥反應(yīng)，降低TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎癥因子水平[7]。此外，有研究報道，腫瘤微環(huán)境中IL-1β的水平與腫瘤發(fā)生及侵襲性密切相關(guān)[27]。本研究結(jié)果顯示，DOX誘導(dǎo)IL-1β的表達(dá)水平增高，而tVNS干預(yù)可顯著降低IL-1β的表達(dá)水平，提示tVNS可能在減輕DOX所致心臟毒性的同時發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究顯示，tVNS能有效減輕DOX所致心臟毒性，改善心臟功能，機(jī)制可能通過增強(qiáng)心臟抗氧化能力、抑制氧化應(yīng)激水平和下調(diào)炎癥細(xì)胞因子。這些結(jié)果提示，tVNS有望成為臨床防治DOX所致心臟毒性一種潛在的輔助治療策略。