歐李再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究進(jìn)展

郎紹裕 任靜 王迪 笈小龍 宋興舜

摘要：? 通過總結(jié)近年來對(duì)歐李再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1.帶有芽點(diǎn)的莖段是構(gòu)建無性系的主要材料;2.葉片更適合誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生;3.培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的比例接近時(shí)有利于誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，比例升高時(shí)會(huì)促進(jìn)愈傷組織的分化;4.單獨(dú)添加生長(zhǎng)素可以誘導(dǎo)生根;5.歐李遺傳轉(zhuǎn)化的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。同時(shí)總結(jié)和討論了影響歐李再生率、轉(zhuǎn)化率的主要因素。

關(guān)鍵詞：? 歐李;? 組織培養(yǎng);? 植株再生;? 遺傳轉(zhuǎn)化;? 外植體

中圖分類號(hào)：? ?S 662. 5? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：1001 - 9499（2021）03 - 0033- 05

歐李（Cerasus humilis （Bge.） Sok.）是我國(guó)特有的一種薔薇科櫻屬多年生小灌木，也是實(shí)施“退耕還林”的重要樹種之一，具有重要的生態(tài)價(jià)值。歐李適應(yīng)性強(qiáng)，耐干旱、耐貧瘠、耐鹽堿，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較低，具有短期內(nèi)速生繁殖等優(yōu)點(diǎn)[ 1 ]。其果實(shí)顏色鮮艷，含有豐富的天然活性鈣，是一種具有代表性的藥食兩用水果[ 2 ]。同時(shí)其種仁中藥稱之為郁李仁，具有潤(rùn)腸通便，下氣利水的功效[ 3 ]?，F(xiàn)階段對(duì)于歐李幼苗栽培，果實(shí)加工，新品種培育的研究已經(jīng)取得了極大的成果，但是對(duì)其抗逆機(jī)理等分子生物學(xué)問題深入研究較少，主要還是因?yàn)楫?dāng)前歐李的再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建不夠完善，可重復(fù)性較差?；诖?，本文對(duì)近年來相關(guān)研究進(jìn)行歸納和總結(jié)，以期為當(dāng)前歐李再生和遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)遇到的再生率、轉(zhuǎn)化率低下等問題提供一些參考，旨在為建立歐李快速、高效的再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系提供理論依據(jù)。

1 歐李再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系研究進(jìn)展

近年來，已有較多歐李品種的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究。本文將從建立無性系、愈傷組織誘導(dǎo)、誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生和增殖、生根、馴化移栽、遺傳轉(zhuǎn)化等方面對(duì)當(dāng)前的研究進(jìn)行總結(jié)。

1. 1 建立無性系

1. 1. 1 外植體消毒條件

不同歐李品種、不同外植體的消毒條件大致相同。主要步驟是用清水沖洗外植體（可以加入洗衣粉或洗潔精），用0.05%～2%NaClO 或0.1%HgCl2（有時(shí)也加入吐溫）、75%的酒精進(jìn)行消毒，用無菌水涮洗干凈，最后用無菌濾紙吸干水分備用[ 4 - 8 ]。

1. 1. 2 培養(yǎng)條件

再生體系建立的培養(yǎng)條件就是給外植體提供光照、溫度和濕度適宜的環(huán)境以促進(jìn)外植體的生長(zhǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度1 000～? ? 3 000 lx，光照時(shí)間12～16 h/d，空氣相對(duì)濕度60%左右 [ 9 - 12 ]。

1. 1. 3 初代培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基

初代培養(yǎng)基也稱啟動(dòng)培養(yǎng)基，是外植體消毒后第一次接種的培養(yǎng)基，用來篩選無菌苗。將初代培養(yǎng)基篩選后得到的第一批無菌苗轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，建立無性系，可以為之后的實(shí)驗(yàn)提供足夠的無菌材料。近年來研究結(jié)果中初代培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基的配方總結(jié)如表1所示，培養(yǎng)基中添加的蔗糖量為20～40 g/L、瓊脂量為5～8 g/L，pH為5.6～

6.0，繼代周期為1個(gè)月左右。

1. 2 愈傷組織誘導(dǎo)

將無菌外植體接入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)其中的活細(xì)胞恢復(fù)全能性，轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚?xì)胞，分生細(xì)胞分化為薄壁組織最終形成愈傷組織。誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織是分化生成完整植株的前提。由表2可知，不同歐李品種用來誘導(dǎo)愈傷的外植體各有不同，但是利用葉片誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)率可達(dá)95%以上，培養(yǎng)基中添加的蔗糖量為20～40 g/L、瓊脂量為5～8 g/L，pH為5.6～6.0。

1. 3 不定芽的誘導(dǎo)和增殖

不定芽就是從通常不形成芽的組織或者器官上生出芽，這些部位如：愈傷組織、葉、根等。由于在選取植物的器官或組織離體培養(yǎng)時(shí)，難以形成定芽，這時(shí)就需要誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽來發(fā)育成為一個(gè)完整的植株。通過誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽，往往是單個(gè)或者少數(shù)幾個(gè)，這時(shí)就需要對(duì)不定芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)，形成不定芽叢來為后續(xù)研究提供足夠的材料。由表3可知，利用愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽是不定芽獲取的常規(guī)手段，愈傷組織分化穩(wěn)定，且分化率高。培養(yǎng)基中添加的蔗糖量為20～40 g/L、瓊脂量為5～8 g/L，pH為5.6～6.0。

1. 4 誘導(dǎo)生根

無菌苗能否順利馴化移栽，建成再生體系，無菌苗是否生根起著決定性作用。無菌苗生根以后，汲取養(yǎng)分會(huì)更快，植株的生長(zhǎng)也會(huì)加快，繼代培養(yǎng)的苗也會(huì)更加強(qiáng)壯。

莊麗娟[ 5 ]使用L培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基對(duì)“優(yōu)質(zhì)大歐李”的無菌苗進(jìn)行生根誘導(dǎo)，單獨(dú)添加了不同濃度的IAA、NAA、IBA和6-BA來誘導(dǎo)植株生根，通過統(tǒng)計(jì)和觀察生根情況，找出誘導(dǎo)歐李生根的最適培養(yǎng)基。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在添加了IAA、NAA和IBA的L培養(yǎng)基中無菌苗均可以生根，IAA和NAA隨著濃度的提高生根率也有所提高，但I(xiàn)BA的生根效果不是很好。雖然NAA的生根率最高，但是會(huì)在莖基部形成愈傷組織，生出短而粗的根，且植株生長(zhǎng)緩慢，葉片發(fā)黃;當(dāng)IAA的濃度達(dá)到1.0 mg/L時(shí)也會(huì)在莖基部出現(xiàn)愈傷組織，但是IAA濃度降低為0.5 mg/L時(shí)，莖基部很少再出現(xiàn)愈傷組織，生根率也可以達(dá)到83.3%，且可生出側(cè)根，植株長(zhǎng)勢(shì)較好。在加入6-BA的培養(yǎng)基中，沒有生根苗的出現(xiàn)，但是植株長(zhǎng)勢(shì)良好，驗(yàn)證了細(xì)胞分裂素在歐李生根時(shí)不起作用，但有益于植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。綜合考慮選用添加了0.5 mg/L IAA來誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)的組培苗生根。陳書明等[ 6 ]以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基對(duì)“唐山歐李”和“九渡河歐李”進(jìn)行生根誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在添加生長(zhǎng)素之后，再加入0.05 mg/L PP333（多效唑），生根率明顯提高，同時(shí)高濃度的IBA會(huì)導(dǎo)致分化幼苗變黃，從而無法生根;張建英[ 9 ]以“燕山二號(hào)”歐李為材料，在誘導(dǎo)生根時(shí)發(fā)現(xiàn)把幼苗接入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)4～6天后，再轉(zhuǎn)接入不含激素的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可減少愈傷組織的產(chǎn)生，有利于植株的生長(zhǎng);周金梅等[ 24 ]以“吉林歐李”為材料摸索出的最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2mg/L NAA，通過觀察發(fā)現(xiàn)1周左右的生根時(shí)間對(duì)于歐李后期生長(zhǎng)最為有利;Mu等[ 25 ]以“99-02”歐李為材料摸索出的最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.8mg/L IAA;孫新政等[ 4 ]、范小峰等[ 10 ]、徐萍等[ 13 ]、王正德等[ 16]以“農(nóng)大4號(hào)”歐李為材料，1/2MS為基本培養(yǎng)基加入生長(zhǎng)素來誘導(dǎo)無菌苗生根，孫新政除此之外還添加了0.02mg/L KT、徐萍還添加了1%的椰子乳來促進(jìn)無菌苗生根。

綜上所述，誘導(dǎo)無菌苗生根的最適條件為：以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，單獨(dú)添加生長(zhǎng)素，其中培養(yǎng)基中添加的蔗糖量為20～40g/L、瓊脂量為5～8g/L，pH為5.6～6.0。

1. 5 馴化移栽

歐李再生體系建立的最后一步就是馴化移栽組培的幼苗。馴化移栽的步驟主要是先對(duì)組培幼苗進(jìn)行馴化鍛煉、基質(zhì)培養(yǎng)，逐步恢復(fù)其自養(yǎng)功能，然后移栽到自然環(huán)境中幼苗可以自養(yǎng)成活。

韓向峰等[ 11 ]利用光培煉苗、閉瓶煉苗和開瓶煉苗的方法對(duì)植株復(fù)壯，瓶?jī)?nèi)煉苗后將生根苗移至用1 000倍多菌靈液清洗消毒后的基質(zhì)（深層土+泥炭+河沙+珍珠巖）上完成馴化;最后當(dāng)苗在基質(zhì)上長(zhǎng)至5～8 cm，基部開始半木質(zhì)化，根系變?yōu)楹稚?，有大量毛?xì)根產(chǎn)生時(shí)，將幼苗移栽到營(yíng)養(yǎng)杯;經(jīng)過30天的生長(zhǎng)后，去掉營(yíng)養(yǎng)杯帶土坨移栽到大田中，成活率為77.5%。趙昌亮等[ 26 ]將苗置于太陽光下照射3～7天，然后開蓋培養(yǎng)3～5天，洗去根部培養(yǎng)基，將試管苗在15～20 ppm 的多菌靈稀液中浸蘸 3～5 s ，然后移入營(yíng)養(yǎng)缽基質(zhì)中培養(yǎng)90～120天，最后定植于大田中，成活率達(dá)85%以上。曹琴等[ 27 ]在光培煉苗過程中，閉瓶煉苗10天、開瓶煉苗3天，光照強(qiáng)度為0.6～0.9 wlx;移栽的生根幼苗采用0.1%多菌靈藥液浸泡10 min，移栽基質(zhì)采用pH 7.29～7.39，Ec值為0.30×103～0.36×103 mS/cm的混合基質(zhì)和原生土基質(zhì);移栽基質(zhì)用0.2%的五氯硝基苯滅菌或 125 ℃高溫滅菌;基質(zhì)煉苗45～50天后進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)缽移栽。劉春穎等[ 23 ]在幼苗達(dá)到3葉以上時(shí)進(jìn)行移栽，先閉瓶進(jìn)行強(qiáng)光鍛煉，把三角瓶移至光照強(qiáng)度20～35 klx下，繼續(xù)培養(yǎng)10天左右，然后將組培苗去蓋移至通風(fēng)陰涼處，開瓶煉苗2～5 天，在表面出現(xiàn)大量雜菌前取出小苗，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到溫室裝有蛭石、珍珠巖和草炭基質(zhì)（比例為1∶1∶1）的穴盤中，扣上塑料薄膜保溫，加扣遮陰網(wǎng);溫度控制在22～25 ℃，保持空氣相對(duì)濕度90%左右，7～8天后逐漸通風(fēng)，再煉苗5天后，可完全放開;10天澆1次營(yíng)養(yǎng)液，保證此期間的養(yǎng)分供應(yīng)，成活率為85%以上。當(dāng)穴盤內(nèi)幼苗長(zhǎng)到5 cm左右時(shí)，移至裝有營(yíng)養(yǎng)土的營(yíng)養(yǎng)缽（8 cm×8 cm）內(nèi)，營(yíng)養(yǎng)土的構(gòu)成為大田土、腐熟農(nóng)家肥、腐殖土各占1/3，并拌入防病菌的藥劑，加扣遮陰網(wǎng)，澆透水，保持空氣濕度 80%左右。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)幼苗長(zhǎng)至15～20 cm左右時(shí)，定植到生產(chǎn)田。

1. 6 遺傳轉(zhuǎn)化

通過對(duì)薔薇科果樹離體再生于遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展的總結(jié)發(fā)現(xiàn)[ 28 ]，薔薇科果樹通過轉(zhuǎn)基因改善的性狀主要集中在抗性方面，而且運(yùn)用的都是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)杜俊杰教授課題組于2016年發(fā)表了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的歐李遺傳轉(zhuǎn)化體系，選取組培苗腋芽生長(zhǎng)出的1～2 cm葉子，用作外植體再生和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn);將構(gòu)建好的載體用電穿孔法轉(zhuǎn)入LBA4404農(nóng)桿菌中;確定葉片對(duì)于卡那霉素的耐受性為15 mg/L;將葉片浸于農(nóng)桿菌菌液（OD600=0.6）7 min后用無菌濾紙吸干菌液;然后在25 ℃的黑暗環(huán)境下共培養(yǎng)3天;將共培養(yǎng)的外植體進(jìn)行脫菌處理移入M4培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性的篩選和芽系的誘導(dǎo);采用GUS分析和PCR分析進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的驗(yàn)證;最終對(duì)確定轉(zhuǎn)基因的幼苗進(jìn)行生根誘導(dǎo)，最終獲得轉(zhuǎn)基因株系[ 25 ]。

2 討 論

2. 1 影響再生率的原因

歐李再生體系建立在當(dāng)前來看并不完善，體系的可重復(fù)性差?？偨Y(jié)影響再生率的原因可能有以下幾點(diǎn)：

（1）基因型與外植體

歐李廣泛分布在我國(guó)多個(gè)省市自治區(qū)，具有多個(gè)不同的野生品種和培育品種，且不同品種的基因型不同，生長(zhǎng)習(xí)性不同，種間差異明顯，所以組織培養(yǎng)的條件也不相同。葉片、莖段、子葉、胚軸等多種外植體在薔薇科果樹離體再生中均有應(yīng)用[ 28 ]。例如秦偉[ 29 ]研究了新疆蘋果以不同器官為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率，其幼莖的誘導(dǎo)率高于葉、子葉，而誘導(dǎo)根則無愈傷組織形成;范小峰等[ 10 ]利用鈣果四號(hào)的莖段進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo);而武莎莎[ 8 ]則是利用農(nóng)大七號(hào)的葉片來進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。

（2）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

基本培養(yǎng)基是保證外植體生存與生理活動(dòng)的最基本物質(zhì)，而細(xì)胞分裂的啟動(dòng)、培養(yǎng)物的形態(tài)建成、芽的分化和跟的形成則離不開植物激素的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)[ 30 ， 31 ]。在植物組織培養(yǎng)的過程中，細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素是常用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，通過控制二者的配比來達(dá)到定向誘導(dǎo)植物組織形成和發(fā)育的目的。單獨(dú)使用IBA對(duì)于植物生根有一定的幫助[ 14 ， 21 ]。2. 2 影響轉(zhuǎn)化率的原因

關(guān)于歐李遺傳轉(zhuǎn)化體系的報(bào)道較少，現(xiàn)階段取得一定成果的是山西農(nóng)業(yè)大學(xué)杜俊杰教授的團(tuán)隊(duì)。其他研究人員對(duì)于歐李基因功能的研究還是在轉(zhuǎn)化異源植物，重要的原因就是自己開發(fā)的體系轉(zhuǎn)化效率低下無法達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，這是所有薔薇科植物面臨的共同問題。影響轉(zhuǎn)化率的原因有以下幾點(diǎn)：

（1）外植體類型

孫華軍等[ 32 ]認(rèn)為外植體類型是轉(zhuǎn)化的主要影響因素。不同來源和發(fā)育狀態(tài)的受體都會(huì)對(duì)農(nóng)桿菌的侵染產(chǎn)生較大影響。

（2）農(nóng)桿菌菌株類型、濃度和浸染時(shí)間

通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前薔薇科植物的遺傳轉(zhuǎn)化方式大多都是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的。用于遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株有多種，不同菌株的侵染能力不同，并因果樹種類而異。薔薇科果樹遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)農(nóng)桿菌菌液濃度多為A600=0.2～1.0，侵染時(shí)間因菌株和果樹種類不同而異[ 28 ]。Oosumi等[ 33 ]在草莓的遺傳轉(zhuǎn)化過程中分別使用了GV3101和LBA4404兩個(gè)菌種侵染外植體，兩個(gè)菌種浸染時(shí)間分別為20 min和24 h。

（3）篩選劑的種類和濃度

與其他植物類似，薔薇科果樹轉(zhuǎn)基因研究常用的標(biāo)記基因是NptⅡ，對(duì)應(yīng)的抗性篩選劑為卡那霉素[ 28 ]。不同品種、不同外植體和不同生長(zhǎng)時(shí)期的植物對(duì)抗生素的敏感程度不同，因此要根據(jù)實(shí)際情況選擇篩選劑的濃度。

（4）共培養(yǎng)條件

共培養(yǎng)就是將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液和受體在同一環(huán)境中培養(yǎng)，利用細(xì)菌侵染受體，從而達(dá)到將T-DNA整合到受體基因組中的目的。除了常用方法以外，共培養(yǎng)時(shí)可以加一些酚類物質(zhì)和滲透保護(hù)劑來提高轉(zhuǎn)化效率。薔薇科果樹遺傳轉(zhuǎn)化通常也在外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時(shí)，加入或提前加入乙酰丁香酮（As）于菌液中[ 28 ]。

3 展 望

歐李作為潛在價(jià)值巨大的藥食兩用植物，近些年對(duì)其幼苗栽培、果實(shí)加工、新品種培育的研究已經(jīng)取得了極大的成果，但是深入的分子生物學(xué)研究還處于起步階段。究其根本，轉(zhuǎn)化率和再生率低下仍是歐李相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展所面臨的瓶頸問題。建立歐李快速、高效的再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系，在歐李品種改良、了解其抗逆機(jī)制發(fā)揮其更大的生態(tài)價(jià)值以及基因功能研究中起著重要作用。相信隨著再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的深入研究和發(fā)展，同時(shí)借鑒成熟的薔薇科植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究成果，瓶頸終將被打破，歐李相關(guān)產(chǎn)業(yè)也會(huì)得到長(zhǎng)足的進(jìn)步和發(fā)展。

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第1作者簡(jiǎn)介：? 郎紹裕（1995-），? 男，? 在讀碩士研究生，? 主要研究方向?yàn)闅W李遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建。

通訊作者：? 宋興舜（1978-），? 男，? 教授，? 博士生導(dǎo)師，? 主要研究方向?yàn)橹参锬婢成砼c分子生物學(xué)。

收稿日期： 2020 - 10 -? 28

（責(zé)任編輯：? ?張亞楠）