尿毒清顆粒微生物限度檢查方法適用性研究及質(zhì)量評(píng)價(jià)

卜紅宇，高瑞霞，滕赟，張茜，周剛

內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020

尿毒清顆粒主要是由黃芪、大黃、白術(shù)、桑白皮、茯苓、丹參、川芎等組成，主要用于慢性腎功能衰竭氮質(zhì)血癥以及尿毒癥，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-229（Z-033）-2000（Z）。查閱文獻(xiàn)，關(guān)于尿毒清顆粒的研究主要集中在治療慢性腎功能衰竭及早期糖尿病腎病的臨床研究方面［1-4］，未見(jiàn)關(guān)于尿毒清顆粒微生物限度檢查的報(bào)道。為了控制藥物質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)按照《中國(guó)藥典》2015 年版四部通則［5］對(duì)尿毒清顆粒微生物限度檢查法進(jìn)行方法適用性研究，在此基礎(chǔ)上評(píng)價(jià)了84 批尿毒清顆粒的微生物污染情況，為全面評(píng)價(jià)尿毒清顆粒質(zhì)量提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

樣品與培養(yǎng)基：84 批尿毒清顆粒（來(lái)源：國(guó)家藥品抽檢，規(guī)格：5 g/袋，處方一致），蛋白胨水、胰酪大豆胨瓊脂、沙氏葡萄糖液體、沙氏葡萄糖瓊脂、胰酪大豆胨液體、麥康凱瓊脂、麥康凱液體；以上培養(yǎng)基均為美國(guó)BD 公司生產(chǎn)。

菌種：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］、大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］（中國(guó)食品藥品檢定研究院提供）。

儀器：AC2-4SI 型生物安全柜（Esco Micro Pte有限公司），PL602-S 型電子天平（梅特勒-托利多集團(tuán)），MIR-554 型培養(yǎng)箱（日本三洋公司），高壓蒸汽滅菌柜（Getinge Sterilization 有限公司），超低溫保存箱（海爾集團(tuán)），Easy MIX 型均質(zhì)器（生物梅里埃法國(guó)股份有限公司），移液器（Eppendorf生命科學(xué)公司）。

1.2 菌液制備

取銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌及白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，制成5 000～10 000 CFU/mL 的菌懸液。取培養(yǎng)5～7 d的黑曲霉培養(yǎng)物，將孢子洗脫，制成5 000～10 000 CFU/mL 的孢子懸液。

1.3 供試液制備

取供試品10 g，置于無(wú)菌均質(zhì)袋中，加100 mL的pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，用均質(zhì)器拍打1 min，搖勻，作為1∶10 的供試液。

1.4 需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌適用性試驗(yàn)

采用平皿法驗(yàn)證供試品有無(wú)抑菌性：取1∶10供試液9.9 mL 和0.1 mL 試驗(yàn)菌混勻，取1 mL 注皿，平行制備2 個(gè)平皿。回收率測(cè)定：回收率=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品組平均菌落數(shù)）÷菌液組平均菌落數(shù)×100%；回收率應(yīng)該在50%～ 200%范圍內(nèi)。試驗(yàn)組為9.9 mL 供試液加入0.1 mL 試驗(yàn)菌；菌液組為9.9 mL 不含中和劑及滅活劑的稀釋液加入0.1 mL 試驗(yàn)菌；供試品組為9.9 mL 供試液加入0.1 mL 稀釋液。

1.5 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

采用常規(guī)法驗(yàn)證供試品有無(wú)抑菌性：大腸埃希菌試驗(yàn)組為取1∶10 供試液10 mL 及不大于100 CFU 的大腸埃希菌加入100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中；依控制菌檢查法，在規(guī)定的溫度和最短的時(shí)間下培養(yǎng)，應(yīng)能檢出所加試驗(yàn)菌的反應(yīng)特征。

2 結(jié)果

2.1 微生物檢查法適用性試驗(yàn)結(jié)果

從表1 中可以看出，供試品銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及黑曲霉的回收率均在50%～200%，說(shuō)明可采用1∶10 平皿法檢測(cè)需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌。從表2 中可以看出，試驗(yàn)組檢出大腸埃希菌的反應(yīng)特征，表明本品在該條件下對(duì)大腸埃希菌的抑制作用可以忽略不計(jì)，可采用常規(guī)法進(jìn)行本品的大腸埃希菌檢查。

表1 需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌適用性試驗(yàn)

表2 大腸埃希菌試驗(yàn)結(jié)果

2.2 84 批樣品微生物限度檢查結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用“2.1”中建立的微生物檢查法對(duì)84 批尿毒清的微生物指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)84 批供試品需氧菌計(jì)數(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，尿毒清顆粒需氧菌總數(shù)X<10 有55 批，約占65.5%；10 ≤X<101有17 批，約占20.2%；101≤X<102有11 批，約占13.1%；X>102有1 批，約占1.2%；需氧菌總數(shù)均未超過(guò)103CFU/g，合格率為100%。對(duì)尿毒清顆粒霉菌及酵母菌統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，霉菌及酵母菌總數(shù)X<10 有71 批，約占84.5%；10 ≤X<101有7 批，約占8.3%；101≤X<102有6 批，約占7.1%；霉菌及酵母菌總數(shù)均未超過(guò)102CFU/g，合格率為100%。84 批尿毒清顆粒均未檢出大腸埃希菌。

表3 84批尿毒清顆粒微生物限度檢查結(jié)果

3 討論

尿毒清顆粒的微生物限度按照《中國(guó)藥典》2015 年版四部通則1107 要求，需氧菌總數(shù)不得過(guò)103CFU/g；霉菌和酵母菌數(shù)不得過(guò)102CFU/g；不得檢出大腸埃希菌（1 g）。本研究中，84 批供試品均符合《中國(guó)藥典》要求，整體質(zhì)量較穩(wěn)定，但供試品的需氧菌、霉菌及酵母菌總數(shù)仍存在較大差異，這說(shuō)明該產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量存在一定問(wèn)題。提示生產(chǎn)企業(yè)加強(qiáng)微生物污染的監(jiān)測(cè)控制，規(guī)范生產(chǎn)。

中藥材易受微生物的污染，細(xì)菌、放線(xiàn)菌和真菌是污染中藥材常見(jiàn)的微生物，致病真菌的污染最嚴(yán)重［6-7］。微生物污染是藥品質(zhì)量評(píng)估的重要指標(biāo)［8］，微生物在自然界分布廣泛，微生物污染的來(lái)源和途徑很多［9-11］，包括藥材原料的種植、晾曬、收集、儲(chǔ)藏等，也包括制劑生產(chǎn)商的各個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)，如生產(chǎn)環(huán)境、設(shè)備、原料、人員等各方面。建議生產(chǎn)商推進(jìn)微生物過(guò)程控制理念的實(shí)施，建立過(guò)程管理控制程序［12］，在整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中監(jiān)測(cè)控制微生物的污染，使微生物負(fù)載降至最低。另外，生產(chǎn)商也應(yīng)該監(jiān)測(cè)產(chǎn)品在存放過(guò)程中微生物的影響因素及變化規(guī)律，以確保產(chǎn)品在有效期內(nèi)不會(huì)受到微生物污染。

本實(shí)驗(yàn)建立了尿毒清顆粒的微生物檢查方法，采用1∶10 平皿法檢查需氧菌總數(shù)和霉菌及酵母菌總數(shù)；采用常規(guī)法檢查大腸埃希菌。檢測(cè)了84 批尿毒清顆粒的微生物限度指標(biāo)，合格率100%，尿毒清顆粒的衛(wèi)生質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。