抑郁癥失眠大鼠模型的構建與評價

黃會珍,趙洪慶,王宇紅*,張尚霞,金獅,羅薇絮,李姿蓉

(1.湖南中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新中心,長沙 410208;2.山東省藥學科學院,濟南 250013)

近年來,抑郁癥的發(fā)病率逐年遞增。據世界衛(wèi)生組織的最新數據統(tǒng)計,全球共有約3.5億抑郁癥患者,我國抑郁癥患病率達4.2%,每年因抑郁癥而自殺的人數高達100萬人[1],預計到2030年抑郁癥將在全球疾病總負擔中排名首位[2]。睡眠障礙是抑郁癥患者中最常見的軀體癥狀,據調查90%抑郁癥患者存在睡眠障礙,而其中88%抑郁癥睡眠障礙患者主要表現為失眠[3]。目前關于抑郁癥失眠的研究大多集中于臨床[4-5],主要是因為缺乏一種穩(wěn)定性高、可實施性強又能最大限度模擬抑郁癥失眠患者臨床發(fā)病特征的動物模型及一套相關的評價體系。目前可以肯定的是生物、心理與社會環(huán)境等諸多因素參與了抑郁癥失眠的發(fā)病過程,且這些因素并不是單獨起作用的,而是各因素聯合作用導致疾病的發(fā)生[6]。所以復合模型比單純的軀體應激或藥物刺激更能模擬該病的臨床表征。因此,本實驗旨在構建一種最佳的慢性應激聯合睡眠剝奪的方法,為抑郁癥失眠的實驗研究提供一種相對可靠的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

84只6～7周齡SPF級SD雄性大鼠,體重180～200 g,購自湖南斯萊克景達實驗動物操作有限公司【SCXK(湘)2016-0002】。實驗單位為湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心SPF級動物房【SYXK(湘)2020-0010】。研究內容和過程涉及的實驗動物操作均符合國家對醫(yī)學實驗動物的有關要求(倫理批準編號:HN-LL-KY-2019-012-01)。實驗條件為:室溫(25±2)℃、房間相對濕度(50%±5%)、保持12 h/12 h光暗周期,動物可自由攝取食物與水。

1.1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(69020183,國藥集團)、CORT、ACTH、CRH、Glu、GABA酶聯免疫試劑盒均購自上海晶天生物科技有限公司、NE(B24713)、DA(B25300)、5-HT(B21833)對照品均購自上海源葉生物科技有限公司、生理、藥理電子刺激儀(YLS-9A型,濟南益延科技)、高效液相色譜儀(1260型,Aglient)、ECD電化學檢測器(Antec)、生物組織包埋機(BM-Ⅷ型,湖北孝感宏業(yè))、石蠟切片機(HM325型,Thermo Scientific)、酶標儀(MK3型,Thermo Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模

適應性飼養(yǎng)5 d后將所有大鼠按體重隨機分為7組,慢性不可預見性中度應激組(chronic unpredictable middle stress,CUMS)、72 h睡眠剝奪組(72 h sleep deprivation,72 h SD)、慢性不可預見性中度應激+72 h睡眠剝奪組(CUMS+72 h SD)、21 d睡眠剝奪組(21 d SD)、慢性不可預見性中度應激+21 d睡眠剝奪組(CUMS+21 d SD),另設空白組、環(huán)境對照組,每組12只。造模前14 d為CUMS造模,CUMS具體方法為:動物實行孤籠飼養(yǎng),應激方法包括禁食24 h、4℃冰水4 min、傾籠45℃+噪音4 h、潮濕墊料+晝夜顛倒24 h、電壓70 V,電流強度2 mA,間斷持續(xù)1 min的足底電擊、禁水24 h、夾尾1 min。每天1種刺激,7種刺激不重復出現[7-8]。15～35 d為SD造模,采用改良多平臺水環(huán)境法對大鼠進行快速眼動睡眠剝奪,睡眠剝奪箱為本課題組自制玻璃箱體,箱內置若干個連體不銹鋼平臺,其直徑為6.5 cm,高為10 cm,注水至平臺下方1 cm。平臺上的大鼠進入快波睡眠時全身肌張力下降,身體接觸到水面而不能完全入睡,達到睡眠剝奪的目的。環(huán)境對照組箱內放置一鐵絲網,大鼠可在上面自由活動。所有大鼠均可自行飲水和攝食。21 d SD組每天15:00至隔天9:00進行18 h SD[9],連續(xù)21 d;72 h SD組于造模最后3 d進行連續(xù)72 h SD[10];復合模型組在進行失眠造模期間均不間斷抑郁造模。分別于應激造模14 d后和復合造模結束后對各組部分大鼠進行行為學檢測,取各大鼠血液、腦區(qū)進行多方面指標檢測。

1.2.2 動物行為學檢測

(1)體重變化情況:體重變化率(%)=(第7、14、21、28、35天的體重-第1天的體重)/第1天的體重。

(2)攝食量變化情況:每周對各組大鼠進行1次攝食統(tǒng)計。

(3)曠場實驗:將大鼠從敞箱底面中央一格放入,適應30 s,記錄4 min內大鼠水平活動次數、垂直站立次數和糞便粒數。

(4)強迫游泳實驗:將大鼠放入水缸中計時30 s使其適應,記錄4 min內大鼠的不動時間。大鼠僅留鼻孔露出水面呼吸呈自然漂浮狀態(tài)即記為游泳不動時間。

(5)糖水消耗實驗:禁食禁水24 h,每只大鼠放置1瓶1%的蔗糖水和1瓶蒸餾水,1 h后調換水瓶位置,計算2 h內蔗糖水消耗量,糖水消耗率(%)=蔗糖水總消耗量/(蔗糖水總消耗量+蒸餾水總消耗量)×100%。

(6)戊巴比妥鈉翻正實驗:經過預實驗得出大鼠戊巴比妥鈉閾上劑量為35 mg/kg。禁食不禁水12 h,腹腔注射,記錄以下數據:①注射戊巴比妥鈉的時間。②入睡時間:大鼠背向下姿勢保持30 s以上,并且1 min內不出現翻正反射。③覺醒時間:大鼠自動翻轉至背向上姿勢且保持30 s以上,認為其翻正反射恢復。計算入睡潛伏期和睡眠時長。

1.2.3 ELISA法檢測各組大鼠血清中HPA軸指標和下丘腦中Glu、GABA含量

收集血液于不含添加劑的采血管中,3500 r/min,10 min離心取上清液即為血清樣本。大鼠下丘腦按質量體積比1:20比例加入磷酸緩沖鹽溶液,冰上勻漿。4℃、12 000 r/min離心10 min后取上清液。根據試劑盒中的說明書進行操作,以標準品濃度與其對應的校正OD值作出線性回歸方程,將樣品的OD值代入回歸方程中計算出每個樣品濃度。

1.2.4 HPLC-ECD檢測大鼠下丘腦中單胺遞質含量

取冷凍保存的下丘腦,精密稱重,按質量體積比為1∶3加入0.01 mol/L高氯酸溶液,冰上勻漿,4℃、13 000 r/min離心10 min后取上清液,0.22 μm針頭過濾器過濾,進樣。色譜條件為:色譜柱:Quattro 4 C18柱;流動相:磷酸二氫鈉/檸檬酸混合液-甲醇(90∶10);流速:0.3 mL/min;柱溫:35℃;進樣量:20μL。精密稱取適量對照品溶于0.01 mol/L高氯酸溶液中,配成1 mg/mL儲備液,依次稀釋成7個濃度點,根據各峰面積計算標準曲線(見表1)。

表1 單胺遞質對照品的回歸方程和濃度梯度Table 1 Regression equation and concentration gradient of monoamine transmitter control

1.2.5 HE染色觀察下丘腦-海馬組織病理狀態(tài)

取4%多聚甲醛固定好的下丘腦組織,進行常規(guī)石蠟包埋,4μm切片后進行以下步驟。脫蠟、水化、染色、脫水、封片,玻片晾干后,即可觀察下丘腦神經元細胞的形態(tài)學變化,顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件分析,數據以平均值±標準差(±s)表示,多組間比較采用One-Way ANOVA分析,滿足方差齊性采用LSD檢驗;方差不齊時選擇Dunnett’s T3檢驗,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。每周1次的體重增長率和攝食量統(tǒng)計為重復測量數據,需用重復測量資料方差分析進行Mauchly球形檢驗,P>0.05即符合球形對稱Huynh-Feldt條件,采用One-Way ANOVA分析;若P<0.05,說明不符合Huynh-Feldt條件,需對組內效應進行校正,選用多元方差分析。

2 結果

2.1 大鼠體重增長率變化

與空白組比較,各模型組中尤以CUMS+21 d SD組大鼠體重增長率下降明顯;后期與CUMS+72 h組相比,CUMS+21 d SD組大鼠的體重增長率是顯著下降的(P<0.01)(見圖1)。

圖1 各組大鼠體重增長率比較(±s,n=10)Note.Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.Compared with CUMS group,▲P<0.05,▲▲P<0.01.Compared with CUMS+72 h SD group,#P<0.05,##P<0.01.(The same in the following figures and tables)Figure 1 Comparison of body weight growth rate of rats in each group(±s,n=10)

2.2 大鼠攝食量變化

與空白組相比,各模型組大鼠攝食量均呈逐漸減少的趨勢(P<0.05或P<0.01);與CUMS+72 h組相比,造模結束后CUMS+21 d SD組大鼠的攝食量是顯著減少的(P<0.01)(見表2)。

表2 造模期間大鼠平均每天攝食情況(±s,n=10)Table 2 Average daily intake of rats(±s,n=10)

表2 造模期間大鼠平均每天攝食情況(±s,n=10)Table 2 Average daily intake of rats(±s,n=10)

組別Groups 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d空白組Control group 23.04±0.86 25.65±1.46 29.74±1.83 30.69±0.53 30.29±0.69環(huán)境對照組Environental control group 22.99±0.57 24.49±0.81 28.99±0.77 29.98±2.81 29.64±1.17 CUMS組CUMSgroup 21.33±1.45* 21.20±0.27** 21.66±1.98** 20.33±1.29** 19.07±0.32**72 h SD組72 h SD group 22.75±0.70 25.10±0.99 29.48±1.13 29.78±0.42 24.44±1.24**CUMS+72 h SD組CUMS+72 h SD group 21.50±0.20* 22.15±1.20** 21.56±2.50** 21.42±0.39** 17.71±0.75**21 d SD組21 d SD group 22.89±0.45 25.73±0.57 18.93±0.40** 18.19±0.14** 17.99±0.27**CUMS+21 d SD組CUMS+21 d SD group 21.80±0.51 22.11±0.91** 17.88±0.44**▲▲## 17.65±0.18**▲## 15.98±0.51**▲▲#F 2.872 11.805 36.125 71.487 169.083 P 0.049 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 CUMS造模14 d和復合造模結束各行為學結果

2.3.1 曠場實驗

與空白組相比,CUMS造模兩周后,經過應激的各組大鼠均表現出了自主活動降低的趨勢,糞便粒數增多。與CUMS+72 h SD組比,CUMS+21 d SD組大鼠的水平活動次數下降,站立次數明顯減少(P<0.05),糞便粒數顯著增加(P<0.05)(見圖2)。

圖2 各組大鼠結束曠場實驗結果(±s,n=8)Figure 2 Open field test results of rats in each group(±s,n=8)

2.3.2 強迫游泳實驗

與空白組比,經過CUMS造模的模型組大鼠不動時間明顯增加(P<0.05),復合造模結束后,CUMS+21 d SD組大鼠不動時間明顯較長(見表3)。

表3 各組大鼠強迫實驗結果(±s,n=8)Table 3 Force swimming test results of rats in each group(±s,n=8)

表3 各組大鼠強迫實驗結果(±s,n=8)Table 3 Force swimming test results of rats in each group(±s,n=8)

組別Groups 14 d不動時間14 d immobility time造模結束不動時間Immobility time at the end of modeling空白組Control group 1.67±1.64 6.68±3.52環(huán)境對照組Environental control group 1.60±0.80 6.45±2.04 CUMS組CUMSgroup 3.63±3.38* 14.17±6.81*72 h SD組72 h SD group 1.55±1.26 8.01±4.01 CUMS+72 h SD組CUMS+72 h SD group 3.54±2.28* 12.14±6.70*21 d SD組21 d SD group 2.90±2.65 13.54±6.28*CUMS+21 d SD組CUMS+21 d SD group 3.66±2.62* 18.31±12.50**F 1.613 3.469 P 0.164 0.006

2.3.3 糖水消耗實驗

與空白組相比,經過14 d CUMS,各造模組的平均糖水消耗率顯著下降(P<0.01);復合造模結束后,與CUMS+72 h SD組相比,CUMS+21 d SD組大鼠的糖水消耗率明顯下降(P<0.05)。與上述兩個行為學結果一致(見表4)。

表4 各組大鼠糖水消耗實驗結果(±s,n=12)Table 4 Sugar water consumption test results of rats in each group(±s,n=12)

表4 各組大鼠糖水消耗實驗結果(±s,n=12)Table 4 Sugar water consumption test results of rats in each group(±s,n=12)

組別Groups 14 d糖水消耗率14 d sugar consumption rate造模結束糖水消耗率Sugar consumption rate at the end of modeling空白組Control group 67.91±16.61 69.82±14.52環(huán)境對照組Environental control group 64.23±11.56 73.80±15.24 CUMS組CUMSgroup 41.19±11.88** 39.69±13.52**72 h SD組72 h SD group 68.14±11.94 60.97±20.59 CUMS+72 h SD組CUMS+72 h SD group 40.63±15.61** 51.20±15.24**21 d SD組21 d SD group 66.18±9.15 50.92±17.30**CUMS+21 d SD組CUMS+21 d SD group 42.69±14.14** 35.72±11.40**#F 10.857 9.654 P 0.000 0.000

2.3.4 戊巴比妥鈉翻正實驗

與空白組相比,各模型組大鼠睡眠潛伏期顯著增長(P<0.05或P<0.01),睡眠時長明顯縮短(P<0.01);與CUMS+72 h SD組相比,CUMS+21 d SD組大鼠表現雖無統(tǒng)計學差異,但睡眠潛伏期有所增加,睡眠時長有所減少(見表5)。

表5 造模結束翻正實驗結果(±s,n=10)Table 5 Experimental results of righting at the end of modeling(±s,n=10)

表5 造模結束翻正實驗結果(±s,n=10)Table 5 Experimental results of righting at the end of modeling(±s,n=10)

組別Groups 睡眠潛伏期Sleep latency 睡眠時長Sleep duration空白組Control group 6.30±1.42 111.50±47.09環(huán)境對照組Environental control group 6.44±1.67 95.56±18.40 CUMS組CUMSgroup 8.50±4.06 64.42±16.00**72 h SD組72 h SD group 11.10±10.42 89.30±29.97 CUMS+72 h SD組CUMS+72 h SD group 13.92±8.74* 61.08±24.90**21 d SD組21 d SD group 15.40±9.05** 58.60±26.29**CUMS+21 d SD組CUMS+21 d SD group 16.42±8.38**▲▲ 51.58±26.50**F 3.580 6.692 P 0.004 0.000

2.4 ELISA測定血清中HPA軸各指標和下丘腦中Glu、GABA含量

2.4.1 血清中HPA軸各指標含量

與空白組相比,CUMS+21 d SD組大鼠血清中各指標含量升高最明顯(P<0.01);與CUMS+72 h SD組相比,CUMS+21 d SD組三個指標含量均顯著增加(P<0.05或P<0.01)(見表6)。

表6 各組大鼠血清CRH、ACTH、CORT含量變化(±s,n=6)Table 6 Changes of CRH,ACTH and CORT in serum of rats in each group(±s,n=6)

表6 各組大鼠血清CRH、ACTH、CORT含量變化(±s,n=6)Table 6 Changes of CRH,ACTH and CORT in serum of rats in each group(±s,n=6)

組別Groups CRH(ng/mL) ACTH(ng/L) CORT(ng/mL)空白組Control group 3.27±0.18 26.66±3.59 6.37±0.32環(huán)境對照組Environental control group 3.28±0.17 28.46±3.78 5.52±0.26 CUMS組CUMSgroup 3.56±0.14* 35.28±5.76* 7.54±0.35*72 h SD組72 h SD group 2.87±0.12* 32.66±2.83 6.58±0.75 CUMS+72 h SD組CUMS+72 h SD group 3.63±0.20* 35.27±4.30* 7.58±1.33*21 d SD組21 d SD group 3.63±0.34* 33.79±2.04 7.73±0.36*CUMS+21 d SD組CUMS+21 d SD group 4.56±0.14**▲▲## 48.60±2.90**▲▲## 9.04±0.13**▲#F 21.161 11.688 9.918 P 0.000 0.000 0.000

2.4.2 下丘腦中Glu、GABA含量

與空白組相比,各模型組大鼠下丘腦Glu含量上升,GABA含量下降(P<0.05或P<0.01),與CUMS+72 h SD組比較,CUMS+21 d SD組Glu和GABA含量均有明顯變化(見表7)。

表7 各組大鼠下丘腦Glu、GABA含量變化(±s,n=3)Table 7 Changes of Glu and GABA contents in hypothalamus of rats in each group(±s,n=3)

表7 各組大鼠下丘腦Glu、GABA含量變化(±s,n=3)Table 7 Changes of Glu and GABA contents in hypothalamus of rats in each group(±s,n=3)

組別Groups Glu(nmol/mL) GABA(nmol/L)空白組Control group 6918.62±106.19 5682.22±144.94環(huán)境對照組Environental control group 6986.98±247.27 5617.50±121.60 CUMS組CUMSgroup 7373.52±467.17 5090.00±106.77**72 h SD組72 h SD group 7298.85±89.48 5364.80±187.62*CUMS+72 h SD組CUMS+72 h SD group 7866.22±47.63**▲ 5005.10±144.65**21 d SD組21 d SD group 8007.98±257.98** 5315.47±50.59**CUMS+21 d SD組CUMS+21 d SD group 8690.24±519.04**▲▲## 4316.00±210.23**▲▲##F 13.230 29.824 P 0.000 0.000

2.5 HPLC-ECD法測定大鼠下丘腦單胺類神經遞質含量

與空白對照組比,各模型組大鼠下丘腦中三種單胺遞質含量均明顯下降(P<0.05或P<0.01);與CUMS+72 h SD組比,CUMS+21 d SD組三種單胺遞質含量明顯減少(P<0.01)(見圖3)。

圖3 各組大鼠下丘腦單胺遞質含量變化(±s,n=3)Figure 3 Changes of monoamine transmitters in hypothalamus of rats in each group(±s,n=3)

2.6 HE染色觀察下丘腦組織病理狀態(tài)

空白對照組大鼠下丘腦細胞大小均勻,排列有序,細胞無空泡樣現象;CUMS+72 h SD和CUMS+21 d SD兩個復合模型組下丘腦神經元細胞形態(tài)結構損傷嚴重,后者更為明顯,細胞排列紊亂、間隙變大,空泡樣性狀顯著(見圖4)。

圖4 各組大鼠下丘腦HE染色結果Figure 4 HE staining results of hypothalamus in each group

3 討論

目前,關于抑郁癥失眠大鼠模型的建立大致分為兩種方法:一種是僅對動物進行抑郁癥造模處理,認為抑郁癥能夠自發(fā)產生失眠,失眠是抑郁癥發(fā)病的一種癥狀。通常在抑郁癥造模期間進行腦電圖監(jiān)測睡眠情況,沒有進行復合造模[11-12]。另一種是復合因子造模方法,通常采用慢性應激先建立抑郁癥模型,后采用72 h睡眠剝奪建立失眠模型,認為抑郁癥狀態(tài)下不可能有100%的概率自發(fā)產生失眠,單一的造模方法無法完全模擬抑郁癥失眠特征[13-14]。本實驗在前人基礎上同時設置快速和慢性睡眠剝奪兩種方法,進行對比,選出能最大限度模擬臨床發(fā)病特點的模型。

SD大鼠的神經系統(tǒng)與人類相似,廣泛用于獎賞機制、認知記憶等高級神經活動的研究,且其垂體-腎上腺系統(tǒng)功能發(fā)達[15],常用作應激反應和腎上腺、垂體的反饋調節(jié)研究[16]。另外,此種屬還具有獲取簡便、模擬率高、敏感度強及重復性好等特點。

本實驗分別于抑郁造模14 d后和復合造模結束后對各組大鼠進行了行為學評價,目的是保證復合模型大鼠在抑郁狀態(tài)前提下進行的失眠造模。結果顯示,經過14 d的應激造模,CUMS+21 d SD組大鼠的各行為學已顯示出抑郁樣趨勢;造模結束后,對比兩個復合模型組,CUMS+21 d SD組大鼠表現精神萎靡、空間探索主動性降低、緊張恐懼心理增加。同樣地,強迫游泳實驗和糖水消耗實驗結果顯示經過長期的應激和慢性持續(xù)性的睡眠剝奪可大大增加大鼠的絕望程度,降低求生欲望,使得大鼠快感缺失嚴重,獎賞行為減少。

戊巴比妥鈉翻正實驗結果顯示CUMS組大鼠睡眠潛伏期增長,睡眠時長顯著縮短,說明抑郁癥本身具有誘發(fā)失眠的傾向,但復合模型組比單純抑郁癥組的睡眠潛伏期更長,睡眠時長更短,進一步體現出復合因子造模的優(yōu)勢。且通過對比兩個復合模型組,CUMS+21 d SD組大鼠的睡眠潛伏期有所增加,睡眠時長有所減少,進一步說明使用慢性應激聯合長期睡眠剝奪復制抑郁癥失眠模型成功率更高,穩(wěn)定性更強。

下丘腦與垂體-腎上腺組成的HPA軸被稱為是內分泌系統(tǒng)和神經系統(tǒng)的中心[17],HPA軸的活性中樞驅動因子CRH主要是由下丘腦室旁核分泌,故實驗選擇下丘腦作為關鍵區(qū)域。長期慢性應激狀態(tài)下,CRH過度分泌,負反饋調節(jié)失靈,ACTH、CORT濃度顯著增加,過多的CORT與其相應受體結合異常刺激CRH的分泌,這種惡性循環(huán)使得CORT一直處于高濃度狀態(tài),引發(fā)抑郁癥慢性失眠[18]。同時,GABA對室旁核中的CRH神經元有抑制作用[19],HPA軸異?；罨瘜е履X內Glu濃度明顯上升,神經元興奮性毒性增加,加重上述惡性循環(huán),削弱下丘腦功能[20],這可能是抑郁癥失眠的發(fā)病機制。另外,腦內單胺遞質的含量常常作為評價抑郁模型的重要指標,許多研究表明單胺類神經遞質與失眠的發(fā)生發(fā)展密切相關,對于睡眠-覺醒節(jié)律的調節(jié)具有重要意義[21]。本實驗結果顯示CUMS+21 d SD組大鼠相比于其他模型組大鼠血清中HPA軸指標水平較高,下丘腦中Glu含量增加、GABA含量減少、三種單胺遞質水平降低。

綜上所述,采用慢性不可預見性中度應激聯合21 d睡眠剝奪的方法可以穩(wěn)定復制抑郁癥失眠大鼠模型,為后續(xù)實驗的開展提供了一定的實踐依據。