心氣虛血瘀證動(dòng)物模型的構(gòu)建與評(píng)價(jià)

王云姣,張婉勤,張軍平,呂仕超

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,天津 300193)

證候是證的外候,是疾病某一階段病理狀態(tài)的高度概括,是中醫(yī)學(xué)理論體系的核心內(nèi)容。證候的物質(zhì)基礎(chǔ)是中醫(yī)現(xiàn)代化研究的核心。借助多種現(xiàn)代技術(shù)手段,統(tǒng)一證候名稱,明確辨證分型,規(guī)范證候診斷標(biāo)準(zhǔn),實(shí)現(xiàn)證候的標(biāo)準(zhǔn)化更是當(dāng)務(wù)之急[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“有諸于內(nèi),必形諸于外”,證候的宏觀表現(xiàn)必定伴隨著微觀本質(zhì)的改變[2],而深入探索證候的物質(zhì)基礎(chǔ),需要借助動(dòng)物的證候模型。以中醫(yī)病因病機(jī)理論為基礎(chǔ),利用特定致病因素,模擬疾病發(fā)生發(fā)展的特征,復(fù)制與人體證候特點(diǎn)相似的動(dòng)物模型,是開展中醫(yī)證候研究的必要條件[3]。動(dòng)物證候模型是基礎(chǔ)和臨床相互轉(zhuǎn)化的橋梁,也是中醫(yī)理論闡明與創(chuàng)新的重要方法。氣虛血瘀證是心系疾病的主要證候,其動(dòng)物模型的研究對(duì)詮釋中醫(yī)藥防治心血管疾病的科學(xué)內(nèi)涵具有重大意義。因此,本文以心氣虛血瘀證動(dòng)物模型為切入點(diǎn),梳理其造模與評(píng)價(jià)的方法,以期促進(jìn)心氣虛血瘀證動(dòng)物模型的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程[4]。

1 心氣虛血瘀證的科學(xué)內(nèi)涵

《素問·痿論》云:“心主身之血脈”,心氣通過推動(dòng)和調(diào)控血液在脈管內(nèi)的正常運(yùn)行以維持人體正常生理功能?！吨嗅t(yī)臨床診療術(shù)語國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(證候部分)》將心氣虛血瘀證定義為“心氣虛弱,運(yùn)血無力,心脈瘀阻,以心悸氣短,胸悶心痛,神疲乏力,面色紫暗,舌淡紫,脈弱而澀等為常見癥的證候”。不同心系疾病氣虛血瘀證的特點(diǎn)存在差異,如《急性心肌梗死中西醫(yī)結(jié)合診療指南》[5]指出急性心肌梗死氣虛血瘀證以胸部刺痛、悶滯,活動(dòng)后加重,可伴心悸短氣,汗出乏力,舌質(zhì)黯淡或有瘀斑,苔薄白,脈虛無力或弦細(xì)無力為特征;《慢性心力衰竭中醫(yī)診療專家共識(shí)》[6]指出慢性心衰氣虛血瘀證表現(xiàn)為氣短/喘息、乏力、心悸為主,兼倦怠懶言,自汗,語聲低微,面唇紫暗等,舌質(zhì)紫暗,苔白,脈沉、細(xì)或虛無力;《冠心病穩(wěn)定型心絞痛中醫(yī)診療指南》[7]指出穩(wěn)定型心絞痛氣虛血瘀證以胸痛胸悶,勞則誘發(fā)為特點(diǎn),癥見心悸氣短,倦怠乏力,自汗,面色淡白或晦暗,舌黯淡胖大,脈沉澀。研究顯示,心氣虛血瘀證與心電圖、心功能、血流動(dòng)力學(xué)等理化指標(biāo)密切相關(guān)。心氣虛血瘀證患者心電圖ST段多為上斜型改變,心臟搏出量、心輸出量(cardiac output,CO)、心臟指數(shù)等明顯異常,紅細(xì)胞壓積(red blood cell specific volume,HCT)、纖維蛋白原等明顯升高[8]。目前,心氣虛血瘀證的研究多局限在以癥狀、體征、理化指標(biāo)作為衡量標(biāo)準(zhǔn),缺乏客觀量化的指標(biāo),極大地限制了中醫(yī)現(xiàn)代化的進(jìn)程。

隨著科技進(jìn)步,中醫(yī)證候的內(nèi)涵不斷被揭示,運(yùn)用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)從生物學(xué)層面探討中醫(yī)證候的科學(xué)內(nèi)涵[9]。基因組學(xué)研究顯示,冠脈介入術(shù)后氣虛血瘀組CYP2C19*2基因突變型與非氣虛血瘀組相比顯著升高,其突變可通過降低氯吡格雷的抗血小板作用進(jìn)一步促進(jìn)氣虛血瘀證的形成[10];通過對(duì)冠心病心絞痛氣虛血瘀證患者的基因集群研究,發(fā)現(xiàn)其與內(nèi)分泌、炎癥反應(yīng)及信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)[11]。蛋白組學(xué)研究顯示,在冠心病不穩(wěn)定型心絞痛氣虛血瘀證患者中,銅藍(lán)蛋白、血清淀粉樣蛋白、肌球蛋白H11及補(bǔ)體C6呈現(xiàn)高表達(dá),而凝溶膠蛋白、載脂蛋白A4、血紅蛋白B及轉(zhuǎn)鐵蛋白等6種蛋白呈現(xiàn)為低表達(dá)[12];心衰氣虛血瘀證大鼠心肌線粒體中Stress-70、Nucleophosmin表達(dá)上調(diào)而ATP-α表達(dá)下調(diào)[13]。代謝組學(xué)研究顯示,心肌梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證患者可能存在能量代謝、磷脂代謝、脂肪酸代謝紊亂,其體內(nèi)花生四烯酸、溶血磷脂酰膽堿、亞油酸、鞘氨醇類物質(zhì)的代謝水平均下調(diào)[14];不穩(wěn)定型心絞痛氣虛血瘀證患者代謝產(chǎn)物中檸檬酸、氧化三甲胺、高密度脂蛋白等含量高于痰濁痹阻證組,而N-乙酰糖蛋白、低密度脂蛋白、天門冬氨酸等含量相比較低[15]。證候的科學(xué)內(nèi)涵具有隱匿性、動(dòng)態(tài)性和復(fù)雜性,與中醫(yī)治未病、整體觀念、辨證論治等理論相通,從基因、細(xì)胞、組織等不同層面,運(yùn)用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等方法探討證候的生物學(xué)基礎(chǔ)研究,可能進(jìn)一步豐富氣虛血瘀證的科學(xué)內(nèi)涵。

2 單因素誘導(dǎo)的心氣虛血瘀證模型

單因素誘導(dǎo)模型[16]是選用一種干預(yù)因素復(fù)制心氣虛血瘀證動(dòng)物模型,多是通過藥物誘導(dǎo)、手術(shù)干預(yù)、生活環(huán)境干預(yù)等方式進(jìn)行造模,復(fù)制出臨床上與心氣虛血瘀證表現(xiàn)一致的模型。

2.1 藥物造模法

藥物誘導(dǎo)是構(gòu)建心氣虛血瘀證動(dòng)物模型的重要方法之一。有學(xué)者運(yùn)用去甲腎上腺素、阿霉素、丙基硫氧嘧啶等藥物復(fù)制心氣虛血瘀證模型,通過觀察動(dòng)物一般狀態(tài)、心臟超聲、病理形態(tài)評(píng)價(jià)模型。運(yùn)用去甲腎上腺素構(gòu)建兔氣虛血瘀型充血性心力衰竭模型[17],結(jié)果顯示大耳白兔出現(xiàn)呼吸困難、活動(dòng)減少、食欲不振等氣虛癥狀,左心室收縮壓(left ventricular systolicpressure,LVSP)、左室內(nèi)壓變化速率(left ventricular pressure change rate,±dp/dtmax)顯著降低,左心室舒張期末壓(left ventricular enddiastolic pressure,LVEDP)、HCT、纖維蛋白原明顯升高,病理顯示部分心肌細(xì)胞空泡變性,心肌肌原纖維排列紊亂。運(yùn)用阿霉素和丙基硫氧嘧啶復(fù)制慢性心力衰竭心氣虛兼血瘀水腫證大鼠模型[18-19],結(jié)果顯示大鼠出現(xiàn)精神不振、呼吸頻率加快、毛發(fā)枯槁、爪甲紫紺等癥狀,左室內(nèi)徑縮短、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)降低,B型腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)、心重指數(shù)升高,心肌細(xì)胞明顯腫脹。

2.2 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法

通過結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支建立慢性心力衰竭模型[20-21],結(jié)果顯示術(shù)后第7天大鼠出現(xiàn)精神倦怠、活動(dòng)度下降、呼吸頻率增加、毛發(fā)枯槁、口唇爪甲紫紺等癥狀,足底R(shí)GB值降低,術(shù)后第27～30天大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總運(yùn)動(dòng)距離縮短、游泳力竭時(shí)間下降,左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular systolic diameter,LVEDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd)、LVEDP、-dp/dtmax升高,左室短軸縮窄率(left ventricular minor axis decurtation rate,FS)、LVEF、LVSP、+dp/dtmax下降,體重、心臟質(zhì)量、心臟指數(shù)明顯升高,病理顯示心肌壞死明顯,膠原纖維彌漫性生長(zhǎng),提示冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎術(shù)后第7～28天可以成功誘導(dǎo)慢性心衰氣虛血瘀證大鼠模型。

2.3 游泳力竭法

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“勞則喘息汗出,外內(nèi)皆越,故氣耗矣”,過度勞累易致耗氣,日久則致氣虛,氣虛無力運(yùn)血導(dǎo)致血瘀。有學(xué)者通過游泳力竭模擬過度疲勞復(fù)制心肌缺血?dú)馓撗鲎C大鼠模型[22],結(jié)果顯示大鼠出現(xiàn)體重下降、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、游泳時(shí)間縮短、爪甲色淡、舌質(zhì)紫黯等氣虛血瘀證癥狀,心率減慢,異常Q波增多,LVEDs、LVEDd增加,LVEF、FS下降,提示大鼠左心室功能下降[23-24]。

3 復(fù)合因素誘導(dǎo)的心氣虛血瘀證模型

復(fù)合因素誘導(dǎo)模型是采用2種及以上致病因素或中醫(yī)病因與西醫(yī)病理相結(jié)合的病證結(jié)合的方法復(fù)制心氣虛血瘀證動(dòng)物模型,與單因素方法相比,復(fù)合因素方法更貼合臨床實(shí)際,是當(dāng)前數(shù)量最多,涉及面最廣的一類方法[25]。

3.1 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎聯(lián)合其他因素法

病證結(jié)合造模可以是在中醫(yī)“證”的基礎(chǔ)上建立西醫(yī)“病”的模型,根據(jù)中醫(yī)“谷不入半日則氣衰,一日則氣少矣”、“勞則耗氣”等理論,有學(xué)者通過冠狀動(dòng)脈結(jié)扎聯(lián)合游泳加控食、睡眠剝奪、高脂飲食等因素構(gòu)建心氣虛血瘀證動(dòng)物模型,通過觀察動(dòng)物一般狀態(tài)、心電圖、心功能、病理形態(tài)評(píng)價(jià)模型。例如,通過冠脈結(jié)扎聯(lián)合游泳控食法建立冠心病氣虛血瘀證大鼠模型[26-27],結(jié)果顯示大鼠出現(xiàn)精神萎靡、倦怠乏力、毛發(fā)枯槁、口唇青紫、舌質(zhì)紫暗等癥狀,舌面RGB值下降,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)角落、周邊活動(dòng)時(shí)間減少,中心活動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng),每搏輸出量(stroke volume,SV)、LVEF、組織型纖溶酶原激活劑含量降低,收縮末期容量、舒張末期容量、血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1、血管性假血友病因子含量增高,病理顯示心肌細(xì)胞排列紊亂,心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)增大[28]。采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)聯(lián)合睡眠剝奪法可復(fù)制心力衰竭大鼠氣虛血瘀證模型[29],結(jié)果顯示大鼠倦怠懶行、毛發(fā)脫落、黯淡無光,體重、抓力、脈搏幅度及自主活動(dòng)下降,舌面RGB值明顯降低,CO、SV、LVEF、FS降低,左室收縮末期容積、左室舒張末期容積、左室重量、LVEDs、LVEDd增加。此外,采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)聯(lián)合高脂飲食法復(fù)制高血脂狀態(tài)的冠心病氣虛血瘀證大鼠模型[30],結(jié)果顯示大鼠呼吸頻率加快,曠場(chǎng)內(nèi)3 min自主運(yùn)動(dòng)距離、足底R(shí)GB均值下降,術(shù)后第7天心電圖出現(xiàn)6～8個(gè)病理性Q波,術(shù)后第7～28天總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇均顯著升高,LVEDs、LVEDd增加,LVEF、FS下降,提示該模型在術(shù)后第7～14天可辨證為氣虛血瘀證模型。

3.2 游泳力竭聯(lián)合其他因素法

通過強(qiáng)迫游泳可使大鼠出現(xiàn)氣虛癥狀,可在此基礎(chǔ)上聯(lián)合冰水負(fù)重法、高脂飲食法等因素構(gòu)建心氣虛血瘀證動(dòng)物模型。采用冰水負(fù)重游泳法建立氣虛血瘀證慢性心肌缺血大鼠模型[31],結(jié)果顯示大鼠心電圖ST段抬高總毫伏數(shù)最高,肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)明顯升高,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)降低,病理顯示其心肌梗死面積比例最大。采用力竭游泳聯(lián)合高脂飲食法[32]構(gòu)建氣虛血瘀證大鼠模型,結(jié)果顯示大鼠出現(xiàn)毛發(fā)干燥易脫落、精神不振、活動(dòng)度下降、納差、便溏、眼球暗紅、舌絳紫暗、尾部青斑或皮下瘀紫等氣虛血瘀癥狀,肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CKMB)、LDH、MDA升高,SOD降低,研究表明該方法建立的氣虛血瘀證模型可用于心血管疾病藥物的藥效評(píng)價(jià)。

3.3 其他多因素聯(lián)合法

根據(jù)中醫(yī)“驚則氣亂,勞則氣耗”、“寒凝血瘀”、“饑則損氣”、“甘肥貴人,則高粱之疾”等理論,多數(shù)學(xué)者提出采用驚恐、疲勞、寒濕、饑餓、高脂飲食等多因素復(fù)合方法復(fù)制氣虛血瘀證心力衰竭大鼠模型[33-34],通過觀察動(dòng)物的一般狀態(tài)、血流動(dòng)力學(xué)、血清學(xué)指標(biāo)、病理形態(tài)評(píng)價(jià)模型。通過該方法構(gòu)建心力衰竭氣虛血瘀證大鼠模型,結(jié)果顯示大鼠出現(xiàn)毛發(fā)枯槁、精神不振、活動(dòng)無力、飲食不佳等氣虛癥狀,心率、收縮壓、舒張壓、血管緊張素II、腫瘤壞死因子-α、白介素-6水平升高,LVSP、LVEDP等下降,心臟病理顯示左心重量、左心質(zhì)量指數(shù)增加,心肌細(xì)胞出現(xiàn)水腫、排列紊亂,并伴隨炎性細(xì)胞浸潤(rùn),細(xì)胞凋亡的陽性反應(yīng)面積及凋亡指數(shù)明顯升高[35-36](見表1、2)。

表1 單因素誘導(dǎo)的心氣虛血瘀證模型Table 1 Single factor induced heart-qi deficiency and blood stasis syndrome model

4 小結(jié)

心氣虛血瘀證是心系疾病常見的證候類型,但臨床上不同心系疾病的氣虛血瘀證的證候表現(xiàn)不盡相同。心氣虛血瘀證與多項(xiàng)理化指標(biāo)密切相關(guān),運(yùn)用基因、蛋白質(zhì)、代謝組學(xué)等方法探討證候的生物學(xué)基礎(chǔ)研究,進(jìn)一步體現(xiàn)了心氣虛血瘀證的科學(xué)內(nèi)涵[37]。證候動(dòng)物模型研究是推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié),模型評(píng)價(jià)是其重要內(nèi)容,通常從模型動(dòng)物的宏觀表現(xiàn)和微觀指標(biāo)進(jìn)行客觀評(píng)價(jià),加強(qiáng)了模型科學(xué)性、穩(wěn)定性和可復(fù)制性,促進(jìn)中醫(yī)現(xiàn)代化進(jìn)程[38]。但目前其研究仍處于探索階段,還存在以下不足[39-41]:一是缺乏公認(rèn)、客觀的造模方法,病因造模法盡管可以模擬出所需證型,但人為因素較多導(dǎo)致操作性及穩(wěn)定性差,而病證結(jié)合造模方法雖然符合中醫(yī)理論與臨床,但其操作困難、造模時(shí)間長(zhǎng)、動(dòng)物死亡率高,實(shí)驗(yàn)可行性差;二是人與動(dòng)物體質(zhì)存在差異,人與動(dòng)物生理機(jī)能不同,對(duì)病因的敏感性和耐受性不同,不同品種、年齡的動(dòng)物對(duì)同一種造模方法產(chǎn)生的生理反應(yīng)也不盡相同;三是疾病與證候關(guān)聯(lián)性不強(qiáng),目前仍以西醫(yī)造模方法為主,注重現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的病理檢測(cè),忽視中醫(yī)證候臨床表現(xiàn),導(dǎo)致疾病與證候關(guān)聯(lián)性不強(qiáng);四是缺乏標(biāo)準(zhǔn)模型評(píng)價(jià)體系,目前評(píng)價(jià)動(dòng)物模型的標(biāo)準(zhǔn)是建立在人的證候診斷標(biāo)準(zhǔn)上,故在判斷模型成功與否時(shí)缺少規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)價(jià)。因此,中醫(yī)證候模型的建立可以從以下幾個(gè)方面著手[42-44]:(1)優(yōu)化造模因素,多采用復(fù)合因素造模方法,將中醫(yī)“證”與西醫(yī)“病”結(jié)合,建立符合中醫(yī)理論與臨床實(shí)際的病證結(jié)合動(dòng)物模型;(2)合理選用造模動(dòng)物,應(yīng)注重選擇與人體生理病理特點(diǎn)相近的動(dòng)物以更好模擬臨床證型,從而提高造模成功率;(3)完善和規(guī)范證候動(dòng)物模型評(píng)價(jià)體系,可依據(jù)中醫(yī)證候模型研究“生物表征”理論及“因、脈、證、治”建模思路。總之,以中醫(yī)基礎(chǔ)理論為指導(dǎo),現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)為手段,建立客觀化、標(biāo)準(zhǔn)化的心氣虛血瘀證動(dòng)物模型及其評(píng)價(jià)體系,為疾病的診療和預(yù)后提供了有力支持,可大大推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展[45]。

表2 復(fù)合因素誘導(dǎo)的心氣虛血瘀證模型Table 2 Multiple factor induced heart-qi deficiency and blood stasis syndrome model