系統(tǒng)評價胎盤差異表達蛋白對妊娠糖尿病大鼠模型胎盤生長發(fā)育的影響

陳凡,葛莉,黃萍萍,江心泳,賴玉婷,龐書勤

(福建中醫(yī)藥大學護理學院,福州 350003)

妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是妊娠常見并發(fā)癥之一,其發(fā)病率逐年上升。目前,GDM的臨床篩查診斷主要基于妊娠28周的口服葡萄糖耐量試驗,操作復雜且缺乏統(tǒng)一的篩查和診斷標準[1-2]。另外,研究表明經(jīng)胰島素治療血糖控制良好并不能改善胎兒代謝異常情況,并可引起胎盤屏障結(jié)構和功能受損[3],表明存在高血糖以外的因素可能導致GDM的發(fā)生發(fā)展。胎盤是母兒物質(zhì)交換的重要產(chǎn)所,最近研究發(fā)現(xiàn)GDM與胎盤異常有關,包括胎盤功能改變、血管功能障礙和氧化應激[4]。因醫(yī)學倫理學限制,人類胎盤在妊娠過程中難以獲得[5],人和大鼠胎盤同屬于半側(cè)型絨毛胎盤,且二者由糖尿病引起的分子機制改變非常相似[6],因此,常被用作分析GDM胎盤相關病理生理變化的關鍵工具。已有研究證實大鼠胎盤蛋白的差異表達引起的胎盤結(jié)構和功能改變可導致胎盤生長發(fā)育異常,且與GDM的發(fā)生發(fā)展密切相關[7-10],但研究所涉及的蛋白種類繁多,蛋白提取時間和表達結(jié)果不一。因此,本研究通過系統(tǒng)評價的方法,對GDM大鼠胎盤差異表達蛋白對胎盤生長發(fā)育的影響進行總結(jié)和分析,以期為推斷人類GDM發(fā)病機理提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 資料來源

計算機檢索PubMed、Web of Science、EMBase、Cochrane Library、Ovid和Scopus、知網(wǎng)、萬方、維普和中國生物醫(yī)學文獻數(shù)據(jù)庫,檢索時間自建庫以來至2020年9月30日。

1.1.2 納入與排除標準

(1)納入標準:①研究類型:對照實驗;②實驗對象:大鼠,實驗組為GDM大鼠,對照組為正常妊娠大鼠,兩組均不給予除造模外的其它措施或僅給予生理鹽水或蒸餾水;③結(jié)局指標:影響大鼠胎盤生長發(fā)育的胎盤差異表達蛋白,和(或)蛋白定位,和(或)胎盤病理。

(2)排除標準:①重復發(fā)表;②綜述、會議摘要、個案研究;③非中英文文獻;④無法獲取全文。

1.2 方法

1.2.1 文獻檢索策略

檢索策略為主題詞和自由詞相結(jié)合。中文檢索詞為“糖尿病,妊娠”、“糖尿病,妊娠性”、“糖尿病,妊娠引致”、“妊娠糖尿病”、“糖尿病妊娠”、“大鼠”、“胎盤”、“蛋白質(zhì)類”、“蛋白”;英文檢索詞為“Diabetes,Gestational”、“Pregnancy in Diabet*”、“Gestational Diabetes”、“GDM”、“Gestational Diabetes Mellitus”、“Diabetes Mellitus,Gestational”、“Diabetes and Pregnan*”、“Pregnancy Diabetes Mellitus”、“Diabetes Mellitus in Pregnancy”、“Glucose Intolerance and Pregnan *”、 “Pregnancy Hyperglycemia”、“Diabetes and Pregnancy Induced”、“Diabetes Mellitus Gravidarum”、“Pregnancy Glucose Abnormalities”、“Rat”、“Rats”、“Placenta”、“Placentas”、 “ Placentation”、 “ Placenta Development”、“Proteins”、“Protein”。此外,對最終納入研究的參考文獻進行手工檢索,以防漏檢。

1.2.2 文獻篩選與資料提取

由2名研究者獨立進行文獻篩選和資料提取,并交叉核對,遇分歧雙方討論或咨詢第三方意見。采用預先制定的資料提取表進行資料提取,包括:第一作者、年份、大鼠品系、體重、樣本量、造模方法、造模時間、檢測時間、蛋白名稱、檢測方法和結(jié)局指標。

1.2.3 文獻質(zhì)量評價

由2名研究者使用SYRCLE動物實驗偏倚評估工具(SYRCLE’s risk of bias tool for animal studies)[11]對納入研究進行獨立評估和交叉核對,遇分歧雙方討論或咨詢第三方意見。SYRCLE包括6種偏倚類型,10個條目,具體為序列生成、基線特征、分配隱藏、動物安置隨機化、盲法(實施偏倚)、隨機性結(jié)果評估、盲法(測量偏倚)、不完整數(shù)據(jù)報告、選擇性結(jié)果報告和其他偏倚來源。該評估工具結(jié)果以“是”,“否”和“不確定”表示,其中,是代表“低偏倚風險”、否代表“高偏倚風險”、不確定代表“不確定偏倚風險”。

1.3 統(tǒng)計學分析

由于納入研究胎盤蛋白種類分散、檢測時間不一,故本研究對胎盤蛋白功能、蛋白時空定位和胎盤病理進行描述性分析。

2 結(jié)果

2.1 文獻檢索結(jié)果

初檢獲得文獻794篇,排除重復文獻235篇,初篩排除453篇,復篩排除90篇,最終納入16篇,具體見圖1。

圖1 研究篩選流程圖Figure 1 Flowchart of study screening

2.2 納入文獻基本特征

納入研究的基本信息見表1、2。實驗對象包括SD大鼠和Wistar大鼠,體重集中在120～300 g。12項研究采用化學誘導法建立GDM模型;2項聯(lián)合化學和飲食誘導;2項采用自發(fā)性GDM模型。共檢測到23個胎盤蛋白,提取時間為妊娠11～21 d(G11-21),其中妊娠早期為G1～G9,妊娠中期為G10～G15,妊娠晚期為G16～G21。蛋白表達通過蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)或免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)檢測,IHC也用于蛋白定位;蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)檢測胎盤病理;血管伊文思藍(evans blue,EB)檢測血管通透性。

表1 納入文獻的基本特征Table 1 Characteristics of included studies

表2 納入文獻的基本特征Table 2 Characteristics of included studies

2.3 文獻質(zhì)量評價

納入研究偏倚風險評估如圖2。在納入的16篇研究中,僅3篇提及具體的隨機序列生成方法[14,16,18];5篇基線特征均衡[12-14,16,18];13篇報道動物安置環(huán)境具有一致性[9,13-14,16-19,21-26];1篇未對退出動物是否會影響研究結(jié)果進行分析和說明[13];另外,納入研究均未具體描述是否進行分配隱藏、隨機性結(jié)果評估和盲法(實施/測量偏倚)。

圖2 偏倚風險評估表Figure 2 Risk of bias assessment form

2.4 不同妊娠天數(shù)大鼠胎盤蛋白表達變化

GDM大鼠胎盤蛋白表達變化如圖3所示。雖然納入研究均報告了GDM大鼠妊娠期間存在胎盤蛋白表達異常,但由于大鼠品系、造模藥物劑量和時間、蛋白種類和測量時間存在較大差異,因此無法對不同研究間的數(shù)據(jù)進行Meta分析。

圖3 GDM大鼠胎盤蛋白表達水平Figure 3 Expression level of placental protein in GDM rats

2.5 胎盤差異表達蛋白對大鼠胎盤生長發(fā)育的影響

2.5.1 影響大鼠胎盤滋養(yǎng)細胞增殖和凋亡

6項研究檢測了與GDM大鼠不同妊娠時間胎盤滋養(yǎng)細胞異常行為相關的蛋白(圖4)。妊娠中早期Akt和ERK1/2活力降低使滋養(yǎng)細胞凋亡增加[22]。妊娠中早期p57表達上調(diào)、PCNA下調(diào),晚期p57下調(diào)、PCNA上調(diào),引起細胞周期紊亂,導致妊娠早期小胎盤和晚期胎盤腫大[23,26]。妊娠晚期GR高表達促進糖皮質(zhì)激素介導的滋養(yǎng)細胞增殖[24];Ki67表達上調(diào)促進滋養(yǎng)層細胞增殖[25];p-JNK表達上調(diào)誘導Bax過表達,引起滋養(yǎng)細胞凋亡[16]。

2.5.2 干擾大鼠胎盤血管生成、增加通透性

5項研究報道GDM大鼠不同妊娠時間胎盤蛋白表達失調(diào)參與胎盤血管異常發(fā)育(圖4)。妊娠中期ZO-1和OCLN表達下調(diào)使胎盤血管完整性破壞,通透性增加[15,17]。妊娠晚期,VEGF及其受體VEGFR2表達上調(diào)促進胎盤血管生成,且二者表達模式與胎盤重量呈正相關[9];PRL片段(14×103PRL和16×103PRL)高表達使胎盤血管生成缺陷[21];CTGF和MMP2表達上調(diào)使胎盤動脈血管重塑缺損[19]。

2.5.3 增強大鼠胎盤妊娠晚期氧化應激反應

6項研究報道了6個參與GDM大鼠妊娠晚期胎盤氧化應激的蛋白(圖4)。其中Nrf2高表達增強細胞清除氧自由基和抗氧化能力[14,18];p-JNK高表達激活JNK信號通路,增強組織氧化損傷,最終導致細胞凋亡和病理改變[16];PPARγ及p-AMPK表達下調(diào),增強胎盤局部氧化應激[12];PPARα和PPARγ低表達上調(diào)氧化應激標志物TBARS,引起胎盤脂質(zhì)過氧化[19-20]。

2.5.4 增強大鼠妊娠晚期胎盤炎癥反應

3項研究報道了3個參與GDM大鼠妊娠晚期胎盤炎癥反應的蛋白(圖4)。其中TLR4表達上調(diào)使胎盤局部慢性炎癥增強并呈持續(xù)性狀態(tài)[13];PPARγ表達下調(diào)及NF-κB表達上調(diào),引起炎癥細胞因子表達和釋放增多[12]。PPARα和PPARγ表達下調(diào)使胎盤蛋白硝基甲基化增強和硝化蛋白量增多,進而引起胎盤發(fā)生炎癥反應[19-20]。

圖4 胎盤差異表達蛋白對大鼠胎盤生長發(fā)育的影響Note.Green.Up-regulation.Blue.Down-regulation.Red.Up-regulation/dowm-regulation in the first trimester was reversed in the third trimester.Figure 4 Effects of differentially expressed placental proteins on the growth and development of placenta in rats

2.6 大鼠胎盤差異表達蛋白時空定位

納入研究結(jié)果顯示:p-JNK在胎盤絨毛膜層及蛻膜細胞(decidual cells,DCs)的胞漿和胞核表達,Bax在合體滋養(yǎng)細胞(syncytiotrophoblasts,Syns)、間質(zhì)細胞(stroma cells,StCs)及胎兒血管內(nèi)皮細胞(fetal vascular endothelial cells,FVECs)胞漿表達[16];ZO1、OCLN主要分布在Syns胞膜上,定位于Syns和FVECs的緊密連接處[17];p-Akt主要于海綿滋養(yǎng)細胞(spongiotrophoblasts,STPs)和巨細胞(giant cells,GCs)胞漿中免疫定位;p-ERK1/2主要分布在DCs、GCs、STPs和FVECs胞漿[22];ERK1/2在大鼠妊娠期間幾乎表達于所有細胞[22];P57主要定位于迷路滋養(yǎng)細胞(labyrinth trophoblasts,LTs)、FVECs和STPs胞核[23];GR主要于FVECs和STPs胞漿中免疫定位[24];Ki67主要定位于STPs、LTs和GCs胞核[25];PNCA主要定位于LTs、FVECs、SPTs和GCs胞核[26],具體時空定位如圖5所示。

圖5 大鼠胎盤差異表達蛋白時空定位Note.Left side is a simplified diagram of rat placenta,and the right side is a simplified diagram of cells.LZ.Labyrinth zone.JZ.Junction zone.DC.Decidual layer.DCs.Decidual cells,located in DC.STPs.Spongiotrophoblast cells.GCs.Giant cells,located in JZ.FVECs.Fetal vascular endothelial cells.LTs/Syns.Labyrinth/synchrotrophoblast cells.StCs.Stromal cells,located in LZ.Green.Up-regulation.Blue.Down-regulation.G.Days of pregnancy.Figure 5 Spatiotemporal localization of differentially expressed placental proteins in rats

2.7 大鼠胎盤妊娠晚期病理改變

3項研究報道GDM大鼠妊娠晚期胎盤病理改變。其中1項研究發(fā)現(xiàn)GDM大鼠胎盤絨毛腫脹,間質(zhì)水腫,滋養(yǎng)層細胞增生,毛細血管管腔空虛狹窄,細小的空泡化,正常細胞減少,組織結(jié)構紊亂[16]。1項研究表明胎盤重量顯著增加,海綿滋養(yǎng)層面積增加和滋養(yǎng)層巨細胞分布的經(jīng)典模式的改變[25]。1項研究顯示胎盤表面血管密度減少,毛細血管管腔狹窄[21]。

3 討論

妊娠糖尿病是妊娠期間的高發(fā)疾病,是全世界面臨的重要公共衛(wèi)生問題。GDM的發(fā)病機制較為復雜,經(jīng)典的觀點認為胎盤分泌的胰島素拮抗激素可介導機體產(chǎn)生胰島素抵抗,進而促進GDM發(fā)生。近年來,研究發(fā)現(xiàn)GDM所致高血糖可導致胎盤蛋白表達異常,反之,胎盤蛋白表達異常又可促進GDM及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展,可作為GDM篩查的特異性生物標志物和治療靶點[27-29]。因醫(yī)學倫理學限制,人類胎盤在妊娠期間難以獲得。正常妊娠大鼠胎盤主要由蛻膜層、交界區(qū)和迷路區(qū)三層構成,其病理結(jié)構呈中央厚、邊緣薄、細胞分布均勻、毛細血管豐富的暗紅色半側(cè)型結(jié)構[30-32],與人類胎盤在結(jié)構和功能有許多相似之處,可將其用于推斷人類胎盤相關疾病方面提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示GDM大鼠胎盤交界區(qū)與迷路區(qū)GR、p-Akt、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、Bax和細胞周期相關蛋白(p57、PCNA和Ki67)表達異常影響滋養(yǎng)細胞的存活、增殖、遷移、侵襲和凋亡功能。胎盤的生長發(fā)育本質(zhì)上是滋養(yǎng)細胞增殖、分化和侵襲適當協(xié)調(diào)的結(jié)果[31]。大鼠胎盤滋養(yǎng)細胞異常行為可引起滋養(yǎng)層面積增加,細胞間間隙變大,細胞松散無序,胎盤出現(xiàn)明顯水腫和重量改變等病理變化,這與先前的研究一致[32]。糖皮質(zhì)激素是機體應激和免疫反應的主要介質(zhì),細胞實驗表明高表達的GR具有刺激糖皮質(zhì)激素介導的滋養(yǎng)細胞增殖、遷移和侵襲作用[33]。與GDM大鼠模型一致,免疫組化顯示GDM孕婦胎盤Bax主要定位于合體滋養(yǎng)細胞[34],p-JNK可促進Bax過表達并向線粒體膜移位,使線粒體膜通透性增加,并通過與其它凋亡因子相互作用誘導滋養(yǎng)細胞凋亡[35]。細胞實驗表明ERK1/2和Akt活性降低可抑制滋養(yǎng)細胞增殖,促進滋養(yǎng)細胞凋亡[36-37],造成GDM大鼠妊娠早期小胎盤形成;妊娠晚期活性降低可對高血糖條件起防御作用,抑制滋養(yǎng)細胞過度增殖,為正常胎盤和胎兒生長創(chuàng)造最佳條件[22]。此外,研究發(fā)現(xiàn)維持妊娠期間胎盤細胞周期相關蛋白穩(wěn)態(tài)水平也是控制滋養(yǎng)細胞存活、增殖和侵襲的重要機制[38-39]。由此推斷,上述胎盤蛋白異常表達通過影響GDM大鼠胎盤滋養(yǎng)細胞存活、增殖、遷移、侵襲和凋亡能力,引起胎盤發(fā)生病理改變,導致胎盤生長發(fā)育異常,這可能是促進或加重GDM發(fā)生發(fā)展的原因之一。

除滋養(yǎng)細胞外,胎盤蛋白的異常表達還可通過干擾GDM大鼠胎盤血管生成、重塑和增加血管通透性來改變胎盤的結(jié)構和功能,影響胎盤的生長發(fā)育,從而進一步引起GDM的發(fā)生或加重[40]。正常的血管生成和轉(zhuǎn)化是胎盤生長和發(fā)育所必需的[30]。妊娠中期迷路區(qū)緊密連接蛋白ZO1、OCLN表達下調(diào)不僅可引起血管內(nèi)皮細胞通透性增加[41],還可使迷路滋養(yǎng)層細胞緊密連接結(jié)構破壞進而影響胎盤功能的正常發(fā)揮[42]。基質(zhì)細胞蛋白CTGF和重塑因子MMP2是血管重塑的關鍵,二者表達上調(diào)可能通過促進內(nèi)皮細胞的異常增殖、遷移和侵襲,使細胞外基質(zhì)膠原沉積減少和動脈螺旋重塑缺陷,且MMP2已被證實可作為檢測糖尿病嚴重程度的臨床指標[43-44]。PRL具有血管收縮功能,其水解片段于妊娠晚期高表達可刺激內(nèi)皮細胞凋亡,引起血管通透性增加、胎盤表面血管密度降低和血管管腔塌陷,從而導致胎盤功能障礙[45]。與之相反,VEGF作為內(nèi)皮細胞和血管生成的主要介質(zhì)[46],VEGF及其受體VEGFR2表達上調(diào)可誘導內(nèi)皮細胞增殖和遷移,促進血管生成,進而導致胎盤增大[47-48]。由此,推斷胎盤血管生成發(fā)育障礙可能導致胎盤結(jié)構和功能異常,進而誘發(fā)或加重GDM。

此外,胎盤差異表達蛋白還可增強GDM大鼠胎盤氧化應激和炎癥水平。有研究發(fā)現(xiàn)一定程度的氧化應激可使胎盤形成缺氧狀態(tài),維持GDM大鼠胎盤氧化還原穩(wěn)態(tài),緩解氧化應激并預防GDM并發(fā)癥的發(fā)生[49]。臨床、細胞和動物實驗均表明PPARα和PPARγ減少或缺失可使胎盤產(chǎn)生過量的一氧化氮和活性氧,引起胎盤氧化應激因子和炎癥因子釋放增多,使胎盤脂質(zhì)過氧化和蛋白硝基甲基化增加,進而影響滋養(yǎng)細胞的增殖、分化、浸潤、遷移和細胞外基質(zhì)的重塑,引起血管內(nèi)皮損傷,加劇胎盤氧化應激和炎癥狀態(tài)形成的惡性循環(huán),誘發(fā)胎盤發(fā)生病理改變[50-54],這可能是促進或加重GDM發(fā)生發(fā)展的另一重要原因。

本研究對符合納入標準的16個動物實驗進行系統(tǒng)評價,尚存在一定的局限性。其一,由于納入研究在實驗動物品系、造模藥物劑量和時間、結(jié)局指標的種類和測量時點方面存在較大的異質(zhì)性,使得納入研究數(shù)據(jù)無法進行Meta分析,在一定程度降低結(jié)論的可靠性。其二,大鼠胎盤蛋白表達水平均采用定性或相對定量分析方法進行檢測,包括Westen Blot和IHC;二者為蛋白檢測的傳統(tǒng)技術方法,尚存在操作步驟多,實驗可控性、穩(wěn)定性和一致性差,以模擬信號展示的實驗結(jié)果易受人為因素影響等問題[55-56],使得納入研究結(jié)論可信度降低。今后研究可考慮采用單分子陣列(Simoa)和iTRAQ蛋白組學等新技術對胎盤蛋白進行檢測,以獲得更精準、更全面、接受度高和可靠的數(shù)字信號證據(jù)[57-58]。其三,納入實驗忽視了對研究方法的詳細介紹,降低了研究內(nèi)在真實性;其中,13/16的研究隨機分組方法不確定,僅5/16的基線特征均衡,所有研究均未報道分配隱藏、動物安置隨機化和盲法(實施/測量偏倚),1/16項研究未對失訪動物是否會對結(jié)局造成偏倚進行評估,上述均可引起文獻偏倚風險評估困難。因此,今后的動物實驗應更加科學合理地設計并描述實驗方案,以降低偏倚風險和提高證據(jù)質(zhì)量。

綜上所述,GDM大鼠胎盤差異表達蛋白分布具有時間性和空間性,其在妊娠期間異常表達可能通過影響胎盤滋養(yǎng)細胞的存活、增殖、遷移、侵襲和凋亡,干擾胎盤血管生成、重塑和增加血管通透性,增強胎盤氧化應激和炎癥反應,引起大鼠胎盤發(fā)生一系列生理病理改變,進而促進GDM及妊娠并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。但其結(jié)果由于偏倚風險難以評估、內(nèi)部真實性較差和檢測方法易受人為因素影響等原因,結(jié)論尚需大量設計科學嚴謹、檢測方法精準全面的實驗研究進行進一步驗證。此外,本項研究雖是關于動物實驗的系統(tǒng)評價,但GDM動物實驗模型將允許更好地區(qū)分孕前糖尿病和GDM的發(fā)病機制,并且其結(jié)果可能有助于推斷人類GDM發(fā)病機制。