生物菌劑對煙田土壤理化性質?細菌群落的影響及其相關性研究

徐紹偉 林鳳 徐正國 李斌 裴為華 李忠奎 李紅麗 王巖

摘要 為了研究生物菌劑對煙田土壤理化性質和土壤細菌群落的影響，在煙田施用不同微生物組合菌劑，利用高通量基因測序檢測分析不同生長期土壤細菌群落結構，檢測土壤理化性質，分析其變化和相關性。結果表明，菌劑可以使土壤pH提高0.44，復合菌劑能增加土壤細菌的多樣性，改變土壤細菌群落結構，施用菌劑處理與對照之間差異較大。鞘氨醇單孢菌屬和節(jié)桿菌屬含量在施用菌劑的處理土壤中最高，可提高土壤氮素轉化和作物的抗病性。有機質、速效鉀、pH和含水率與土壤細菌極顯著相關，堿解氮和有效磷為顯著相關，可通過調節(jié)這些因子改變土壤細菌群落，進而改變土壤微環(huán)境，增強作物的抗病性。

關鍵詞 生物菌劑; 細菌群落結構;環(huán)境因子;相關性

中圖分類號 S-154.3? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）12-0167-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.043

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effects of Biological Agents on Soil Physical and Chemical? Properties and Bacterial Community in Tobacco Field and the Correlation

XU Shao wei1，LIN Feng2，XU Zheng guo1 et al? （1.Sichuan Provincial Tobacco Company Liangshan Company Dechang Branch，Dechang，Sichuan?? 615500;2.Dechang County Agriculture and Rural Affairs Bureau，Dechang， Sichuan 615500）

Abstract In order to study the influence of biological agents on soil physical and chemical properties and bacterial community in tobacco field，different microbial combination agents were applied in tobacco field.The changes and correlations of soil physical and chemical properties were analyzed by high throughput gene sequencing.The results showed that the bacteria could improve soil pH by 0.44 ，and the compound bacteria could increase the diversity of soil bacteria and change the structure of soil bacteria community，which was different from the control.Sphingomonas and Arthrobacteria had the highest content in the treatment of applying biological agents，which could improve soil nitrogen transformation and crop disease resistance.Organic matter，available potassium，pH and water content were extremely significant correlated with soil bacteria，and alkaline nitrogen and available phosphorus are significant correlation.Therefore，through adjusting these factors，soil bacterial community could be changed，and then soil microenvironment could be changed and disease resistance of crops can be enhanced.

Key words Biological agents;Bacterial community structure;Environmental factors;Correlation

土壤是農業(yè)生產過程中的養(yǎng)分來源和重要載體，良好的土壤條件是生產優(yōu)質作物的基礎。但由于近年來經濟作物如煙草的長期連作致使煙田出現土壤環(huán)境惡化等問題[1]。研究我國各種土壤25年的數據發(fā)現，農田土壤發(fā)生不同程度酸化現象高達90%[2]，土壤pH降低影響相關微生物的多樣性和酶活性[3]，煙葉中煙堿含量呈增加趨勢[4]，同時土壤中鉀、鎂、鈣的有效量下降[5]。煙草健康生長受不良耕作、施肥和管理等因素的影響，這些因素都會導致土壤微生態(tài)環(huán)境失衡，土壤調節(jié)能力降低，最終造成病害的嚴重發(fā)生[6-10]。

生物防治是利用有益微生物殺滅或降低病原菌的數量，豐富微生物種群，從而控制植物病害發(fā)生[11-12]。Phae 等[13]將Bacillus NB22菌株的懸浮液撒入有嚴重病害的土壤中，染病植株的死亡率明顯下降。也可制成生物有機肥施入土壤中，改善土壤微生物的營養(yǎng)，提高土壤微生物的代謝能力，土壤微生物多樣性較高，使土壤微生物群落對抗病原菌的能力提高，降低發(fā)病率。

目前用于防治土傳病害的菌劑較多，大多關注菌劑的篩選和作用結果，而對土壤微生物和土壤理化性狀的影響關注較少。筆者利用一種解淀粉芽孢桿菌菌劑和原位土壤中篩選的黑脛病拮抗菌，進行不同配比施肥，研究不同生物菌劑防控黑脛病的過程中對土壤細菌群落結構和多樣性的影響，以及環(huán)境因子的變化及其與細菌的相關性，為進一步采取措施進行煙草土傳病害的生態(tài)防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況 試驗地位于四川省涼山州會理縣益門鎮(zhèn)，26°50′N，102°17′E，海拔1 900 m，年平均氣溫15.3 ℃。

1.2 試驗設計與土壤采集 選取地塊平整的0.2 hm2煙田，均分為4個處理，每個處理約0.067 hm2，并設3次重復，隨機排列。H2試驗4個處理分別為處理1（H2-1）：對照，常規(guī)施肥;處理2（H2-2）：在對照的基礎上，移栽時施用225 kg/hm2菌劑1，可穴施，也可澆施，團棵期再澆施75 kg/hm2菌劑1;處理3（H2-3）：在對照基礎上施用 45 kg/hm2菌劑2，團棵期澆施45 kg/hm2菌劑2;處理4（H2-4）：處理2和處理3的組合，即移栽時施用45 kg/hm2菌劑2和225 kg/hm2菌劑1，團棵期再澆施75 kg/hm2菌劑1和45 kg/hm2菌劑2。菌劑1是解淀粉芽孢桿菌，菌劑2是生防菌組合，菌劑活菌含量5億/g 以上。供試煙田烤煙品種為云煙87。

在移栽前、煙株團棵期、旺長期和成熟期采集根際土壤土樣，用5點取樣法，去掉煙株根際表層土壤，采5～20 cm耕層土壤，混合后取土樣總量1 kg，每個處理取3個平行樣，編號移栽前YH開頭，團棵期TH開頭，旺長期WH開頭，成熟期CH開頭。每個樣品過篩除去根等雜質后取少量土壤裝入10 mL帶蓋的離心管中，儲存于有冰袋的保溫箱中，帶回實驗室-20 ℃ 保存，并及時送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行多樣性測序與分析。取部分土壤風干，用于常規(guī)分析。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 微生物多樣性分析。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司對樣本土壤微生物進行16S/18S多樣性測序[14]。

1.3.2 土壤養(yǎng)分含量。土壤pH采用電位法測定，土壤有機質和土壤養(yǎng)分測定用國標方法[15]。

1.4 數據處理 試驗數據采用Excel 2010、SPSS 軟件進行統計處理。多樣性基因測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司信息平臺相應軟件進行分析[14]。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質和酶活性

移栽前、團棵期和成熟期土壤理化性質見表1。從表1可以看出，移栽前堿解氮和有效磷含量最低，有機質含量最高，速效鉀與成熟期差不多。有機質和速效鉀含量在煙株生長過程中先降低再升高，堿解氮和有效磷含量先增加成熟期又減少。團棵期4個處理之間，對照的有機質和養(yǎng)分含量均最高，說明加入菌劑后土壤中微生物群落發(fā)生變化，進而使養(yǎng)分發(fā)生改變，添加菌劑后土壤養(yǎng)分轉化為作物容易吸收的成分，作物吸收快，土壤中的養(yǎng)分均比對照低。成熟期4個處理之間，有機質和養(yǎng)分均是對照最少，到煙草成熟期，作物吸收養(yǎng)分的速度大大降低，而微生物持續(xù)轉化養(yǎng)分，CH2-4最高，說明混合施用菌劑和解淀粉芽孢桿菌的土壤微生物轉化速度最高，使土壤有機質和養(yǎng)分較高，對照與CH2-2之間相差不大，說明施用混合生防菌劑2對土壤有機質和養(yǎng)分的影響較大。

移栽前和成熟期土壤酶活性見表2。由表2可知，酶活性在移栽前均高于成熟期土壤，說明移栽前微生物活性比種上煙葉后的成熟期高。成熟期脲酶、過氧化氫酶和轉化酶都是CH2-4最高，CH2-2最低，磷酸酶是CH2-3最高，CH2-2最低，蛋白酶是CH2-2最高，對照最低，說明單獨施用解淀粉芽孢桿菌菌劑，降低了酶活性，但提高了蛋白酶活性，施用混合生防菌劑2提高了磷酸酶活性，混合施用則大大提高了脲酶和轉化酶活性。

2.2 土壤含水率和pH

不同時期土壤含水率變化見表3。由表3可知，2019年移栽前含水率非常低，試驗田移栽前嚴重干旱，在整個煙株生長時期都沒有得到改善，含水率都沒有超過20%，后期煙草花葉病和氣候斑發(fā)病較高，嚴重影響煙株的生長和煙葉質量。

試驗田土壤pH見圖1。試驗田移栽前土壤pH為近中性，種上煙后土壤pH降低較多，移栽前土壤pH為近中性，種上煙后土壤pH先降低后升高。團棵期、旺長期和成熟期其他處理均比對照高，處理H2-4最高，團棵期比對照高0.32，成熟期比對照高0.44。說明混合施用菌劑1和菌劑2可從團棵期開始有效提高土壤的pH，一直到煙葉成熟。

2.3 農藝性狀 試驗田農藝性狀見表4。由表4可知，處理H2-4的農藝性狀最好，添加單類菌劑對煙葉生長有一定的作用，2種菌劑復合施用效果最好。

2.4 微生物基因測序分析

2.4.1 Alpha多樣性。試驗田細菌多樣性見表5。不同時期細菌總數先增加后降低，團棵期最高，成熟期最低，多樣性先降低又稍有增加，都沒有移栽前高。團棵期為TH2-2細菌總數最高，多樣性最低，TH2-3和TH2-4細菌總數和多樣性相差不大。旺長期WH2-4細菌總數和多樣性為最高，WH2-3稍低，對照的多樣性最低。成熟期細菌總數和多樣性均是CH2-3最高，CH2-4稍低，CH2-2最低。說明種上煙后土壤細菌有趨于相同性，細菌多樣性降低。添加菌劑1在團棵期使部分細菌數量大大增加而減少了多樣性，但添加生物菌劑2后，土壤細菌均衡變化，細菌多樣性增加。

2.4.2 微生物群落結構。試驗田不同時期不同處理土壤樣本的細菌在門水平和屬水平上的群落結構見圖2和圖3。從細菌門水平群落結構看出，相對豐度在5%以上的優(yōu)勢細菌門有Proteobacteria（變形菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）和Gemmatimonadetes（芽單孢菌門）。除TH2-2（占總細菌含量的82.71%），厚壁菌門相對豐度較高，占總菌數的13.97%，其余樣本中6個菌門占整個細菌門的93%以上。移栽前土壤中放線菌門和綠彎菌門相對豐度分別為38.12%和15.69%，種上煙草后相對豐度顯著下降，特別是放線菌到成熟期最低，但成熟期中CH2-4最高，團棵期和旺長期則是CH2-3稍高。變形菌門在移栽前土壤中相對豐度為22.82%，種上煙后顯著增加，TH2-1增加到52.49%，為團棵期最高，也是整個樣本中最高，旺長期WH2-4稍高，成熟期還是對照比其他處理稍高。酸桿菌門先降低后增加，成熟期CH2-3和CH2-4稍高，CH2-3增加到整個樣本中最高達14.15%。擬桿菌門種上煙草后顯著增加，特別是團棵期對照增加了近3倍，后3個時期都是CH2-4中相對豐度最高。芽單孢菌門種上煙后逐漸增加。

從土壤細菌在屬水平上的群落結構可以看出，相對豐度在前6的細菌為Sphingomonas（鞘氨醇單孢菌屬）、Arthrobacter（節(jié)桿菌屬）、norank_c_Subgroup_6、unclassified_f_Rhizobiaceae（根瘤菌科未分類菌屬）、norank_f_Roseiflexaceae、norank_f_Gemmatimonadaceae（芽單孢菌科未命名菌屬）。其中鞘氨醇單孢菌屬移栽前相對豐度僅為1.42%，種上煙后顯著增加，到成熟期CH2-2增加到最大為27.96%，對照最低，該菌是土壤有益菌，提高土壤氮素轉化和作物抵抗不良環(huán)境的能力，

施用菌劑利于土壤向健康轉化，與李忠奎等[16]研究結果一致。節(jié)桿菌屬移栽前相對豐度最高為14.37%，種上煙后顯著降低，旺長期稍有增加成熟期又降低，團棵期和旺長期均為H2-3最高，成熟期CH2-4最高。norank_f_Roseiflexaceae在移栽前相對豐度高，種上煙后減少，CH2-2和CH2-4在成熟期相對豐度較高。norank_c_Subgroup_6和norank_f_Gemmatimonadaceae（芽單孢菌科未命名菌屬）種上煙后先降低后增加，norank_c_Subgroup_6在CH2-2和CH2-3增加多，芽單孢菌科未命名菌屬在WH2-2相對豐度較高。unclassified_f_Rhizobiaceae（根瘤菌科未分類菌屬）在種上煙后先增加又降低，TH2-3和WH2-4相對豐度較高。這些菌屬的變化說明施加解淀粉芽孢桿菌對有益菌的生長有利，施用生防菌劑有利于調節(jié)細菌群落。

2.4.3 Beta多樣性分析。

土壤樣本細菌在OTU水平上的主坐標分析（PCoA）見圖4。從圖4可以看出，不同時期土壤樣本之間有差異，特別是移栽前土壤樣本微生物與種上煙后的土壤樣本差異較大。移栽前樣本與其他樣本之間相距較遠，說明他們之間的細菌群落差異較大，團棵期的TH2-4與其余3個樣本之間差異較大，旺長期和成熟期相差較近，其中旺長期的WH2-2與其余3個樣本之間差異較大，WH2-3和WH2-4相差較近，成熟期對照CH2-1與另外3個樣本相差較遠，其余3個樣本相差較近，幾乎重疊在一起，說明這3個樣本的細菌群落非常相似，而與對照之間有一定的差異。

2.4.4 微生物群落與環(huán)境因子關聯分析。

RDA/CCA分析是主要用來反映菌群與環(huán)境因子之間的關系，可以檢測環(huán)境因子、樣品、菌群三者之間的關系或者兩兩之間的關系。對試驗田土壤樣本細菌菌群豐度與土壤性質指標做冗余分析（Redundancy analysis，RDA）。土壤理化性主要有pH、含水率（MC）、有機質（OM）、堿解氮（AN）、速效磷（AP）、速效鉀（AK），分析結果見圖5。

從圖5可以看出，第一主軸RDA1解釋所有變量的84.11%，第二主軸RDA2解釋所有變量的7.18%，共解釋物種和環(huán)境因子總方差的91.29%。OM（r=0.942 3）、AN（r=-0.748 9）、AP（r=-0.945 3）、AK（r=0.972 7）、pH（r=-0.868 1）、MC（r=-0.986 7）都與第一主軸相關，其中AN、AP為顯著相關，其余因子為極顯著相關，放線菌門和綠彎菌門與第一主軸正相關，變形菌門、擬桿菌門和芽單孢菌門與第一主軸負相關，酸桿菌門與第二主軸正相關。AK和OM與放線菌極顯著正相關，特別是速效鉀與放線菌幾乎重疊，與綠彎菌門正相關，其余因子與變形菌門、芽單孢菌門和擬桿菌門正相關，有效磷與擬桿菌門極顯著正相關，二者箭頭方向幾乎重疊。從環(huán)境因子與樣本之間的關系可以看出，移栽前樣本受速效鉀和有機質的影響較大，其余因子則對成熟期樣本影響較大。

3 結論

施用生物菌劑各處理pH比對照稍有增加，混合施用處理的最高，成熟期比對照高0.44。單獨施用解淀粉芽孢桿菌促進了某些細菌的生長，總數增加但多樣性減少，施用生防菌劑可增加土壤細菌的多樣性。

土壤優(yōu)勢細菌門有Proteobacteria（變形菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）和Gemmatimonadetes（芽單孢菌門），與李忠奎等[16]研究一致。菌門的變化說明施加解淀粉芽孢桿菌對有益菌的生長有利，施用生物有機肥對一些菌屬的調節(jié)有利。Beta多樣性分析說明施用生物菌劑影響土壤細菌群落，特別是到成熟期，對照與處理間的細菌群落差異較大。

不同時期有顯著差異的有變形菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，有顯著差異的菌屬有鞘氨醇單孢菌屬、節(jié)桿菌屬、弗拉托氏菌屬、鏈霉菌屬。環(huán)境因子分析表明AN、AP為顯著相關因子，OM、AK、pH、MC為極顯著相關因子，對土壤細菌群落的影響較大，調節(jié)這些因子可以調節(jié)土壤細菌群落，從而改善土壤微環(huán)境，達到防治土傳病害發(fā)生的目的。

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