左乙拉西坦片仿制藥與原研藥溶出度一致性評(píng)價(jià)*

劉明鷺，李 震 ，楊龍華 ，朱雙鵬，楊 釗

（1. 山東省青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266000； 2. 浙江京新藥業(yè)股份有限公司，浙江 紹興 312500）

左乙拉西坦（LEV）為西坦類藥物，屬吡咯烷酮類，可視為 γ－氨基丁酸（GABA）的環(huán)狀衍生物，是一種新型抗癲癇藥物。左乙拉西坦片由比利時(shí)優(yōu)時(shí)比制藥公司［1］研發(fā)，商品名 KEPPRA（開浦蘭），于 2000 年獲美國食品藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)，在美國和歐盟上市，并于2006 年11 月獲國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準(zhǔn)進(jìn)口［1］。目前在全球超過66 個(gè)國家和地區(qū)上市，有超過100 萬人的治療記錄，是目前美國癲癇治療中心應(yīng)用最多的抗癲癇藥物［2］。仿制藥與原研藥的質(zhì)量差異主要采用溶出度試驗(yàn)評(píng)價(jià)，通過在體外模擬口服固體制劑在胃腸道的溶出，以評(píng)價(jià)口服固體制劑的內(nèi)在質(zhì)量。而多種溶出介質(zhì)下測(cè)定的溶出曲線可有效反映藥物在體內(nèi)的釋放過程，本研究中比較并分析了左乙拉西坦片仿制藥與原研藥在4 種不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線，為評(píng)價(jià)仿制藥質(zhì)量和療效的一致性提供參考［3－5］?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 708DS 型溶出儀、Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Sartorius Bt 125D 型天平（德國賽多利斯公司，精度為十萬分之一）；AS10200BT 型超聲儀（美國賽默飛世爾科技公司，功率為300 W，頻率為50 ／60 Hz）；Mettler MP200 型 pH 計(jì)（瑞士梅特勒公司）；ZKT－18F 型真空脫氣儀（天津天大天發(fā)科技公司）。

1.2 試藥

左乙拉西坦對(duì)照品（A 公司，批號(hào)為R039L0，含量為99.9%）；左乙拉西坦酸（雜質(zhì)C）對(duì)照品（歐洲藥品質(zhì)量管理局，批號(hào)為4.0，含量為100.0%）；左乙拉西坦片（仿制制劑，B 公司，批號(hào)分別為 A1802061，A1701202，A1701203，A1701204，規(guī)格為每片 0.25 g）；左乙拉西坦片（原研制劑，商品名開浦蘭，比利時(shí)優(yōu)時(shí)比制藥公司，批號(hào)為 195846，規(guī)格為每片 0.25 g）；乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；純化水（實(shí)驗(yàn)室自制）；磷酸氫二鉀、鹽酸、無水乙酸鈉、氫氧化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色 譜 柱 ：Agilent Eclipse XDB － C18柱 （150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.2% 磷酸氫二鉀溶液 － 乙腈（950 ∶50，V ／ V，用稀磷酸調(diào) pH 值至 6.0）；流速：1.0 mL ／ min；檢測(cè)波長：205 nm；柱溫：30 ℃ ；進(jìn)樣量：20 μL。分別取雜質(zhì)C 對(duì)照品與左乙拉西坦對(duì)照品適量，加水 － 乙腈（950 ∶50，V ／ V）溶解，稀釋，制成每 1 mL 各含0.1 mg 的溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用溶液。理論板數(shù)按左乙拉西坦峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，雜質(zhì)C 與左乙拉西坦峰之間的分離度應(yīng)大于1.5。結(jié)果左乙拉西坦峰的理論板數(shù)為8 715，分離度為2.7。

2.2 溶出條件選擇

首先采用《美國藥典》（USP）收載的左乙拉西坦片的溶出條件對(duì)原研藥進(jìn)行測(cè)定［6］，轉(zhuǎn)速為 50 r／min，15 min時(shí)溶出量約為85%，觀察溶出杯中崩解現(xiàn)象，原研藥為溶蝕型，在50 r／min 條件下在杯底靜水區(qū)沉積，薄膜包衣片明顯崩解偏慢，推測(cè)在50 r／min 條件下可能存在過度區(qū)分。根據(jù)原國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《普通口服固體制劑溶出度試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》［7］《普通口服固體制劑溶出曲線測(cè)定與比較指導(dǎo)原則》［8］《人體生物等效性試驗(yàn)豁免指導(dǎo)原則》［9］，并參考文獻(xiàn)［10 －11］，溶出條件設(shè)定：溶出介質(zhì)體積為500 mL，溫度為（37±0.5）℃ ，轉(zhuǎn)速為 75 r／min；4 種溶出介質(zhì)（純化水，經(jīng)測(cè)定 pH 為 6.20），pH 1.0 鹽酸溶液（取鹽酸 9.0 mL，用水稀釋至 1 000 mL，搖勻，即得），pH 4.5 醋酸鹽緩沖液（取醋酸鈉2.99 g，冰醋酸1.6 mL，加水溶解并稀釋至1 000 mL，即得），pH 6.8 磷酸鹽緩沖液（量取 0.2 mol／L磷酸二氫鉀溶液250mL，0.2mol／L 氫氧化鈉溶液112mL，混勻，加水稀釋至1 000 mL，即得），上述溶出介質(zhì)均采用脫氣裝置經(jīng)42 ℃ 脫氣1 h 后立即使用；取樣時(shí)間為5，10，15，30，45 min。

2.3 溶液制備

取左乙拉西坦對(duì)照品25 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，分別用 pH 1.0 鹽酸溶液、pH 4.5 醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液和水4 種溶出介質(zhì)溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制得每1 mL 中約含0.5 mg 的對(duì)照品溶液。取每批樣品（批號(hào)分別為 195846，A1802061，A1701202，A1701203，A1701204）各 12 片，分別在 pH 1.0 鹽酸溶液、pH 4.5 醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液和水4 種溶出介質(zhì)中進(jìn)行試驗(yàn)，取溶出液，用 0.45 μm 聚醚砜微孔濾膜（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取左乙拉西坦對(duì)照品50 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，用水溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為左乙拉西坦對(duì)照品貯備液，分別精密量取對(duì)照品貯備液 0.2，0.6，1.0，1.4，1.8 mL，置 10 mL 容量瓶中，用 pH 1.0 鹽酸溶液、pH 4.5 醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液和水4 種溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以左乙拉西坦對(duì)照品的質(zhì)量濃度（X，mg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。結(jié)果在上述4 種溶出介質(zhì)中，左乙拉西坦對(duì)照品質(zhì)量濃度在 0.10 ～0.90 mg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。詳見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n ＝5）Tab.1 Results of linear relation test（n ＝ 5）

精密度試驗(yàn)：取 2.3 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6 次。結(jié)果水、pH 1.0 鹽酸溶液、pH 4.5 醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液 4 種溶出介質(zhì)的 RSD 分別為 0.15% ，0.20% ，0.27% ，0.21%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：吸取2.3 項(xiàng)下4 種溶出介質(zhì)45 min時(shí)的供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，16 h時(shí)，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果左乙拉西坦的峰面積幾乎無變化，水、pH 1.0 鹽酸溶液、pH 4.5 醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液的 RSD 分別為0.75% ，0.66% ，0.49%，0.70% （n ＝5），表明供試品溶液在室溫條件下放置16 h 穩(wěn)定性良好。另分別取4 種溶出介質(zhì)在45 min 時(shí)的供試品溶液適量，置37 ℃水浴中保溫，同法測(cè)定，結(jié)果的 RSD 分別為 0.83% ，1.06% ，0.79%，0.85%（n ＝5），表明供試品溶液在 37 ℃放置 16 h穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取左乙拉西坦對(duì)照品適量，精密稱定，置容量瓶中，按處方量加入輔料，分別用4 種溶出介質(zhì)溶解，稀釋，配制成相當(dāng)于制劑中藥物含量80%，100%，120%的濃度，混勻，制成低、中、高3 種濃度的溶液，各3 份，離心，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 4 種溶出介質(zhì)中左乙拉西坦加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（%，n ＝9）Tab.2 Results of the recovery test of levetiracetam in four dissolution media（%，n ＝ 9）

濾膜吸附試驗(yàn)：取左乙拉西坦原研藥1 片，置500 mL容量瓶中，加500 mL 水，于 37 ℃水浴振搖 45 min，放冷至室溫，搖勻，離心（轉(zhuǎn)速為 5 000 r／min）10 min，0.45 μm 聚醚砜微孔濾膜濾過，分別棄去 1，2，3，4，5 mL 后，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果棄去 1，2，3，4，5 mL 后的回收率分別為98.68% ，99.22% ，99.10% ，99.83% ，99.55% ，表明使用0.45 μm 聚醚砜微孔濾膜過濾對(duì)左乙拉西坦基本無吸附作用，不干擾測(cè)定結(jié)果。

管路吸附試驗(yàn)：在水的溶出曲線的最后1 個(gè)取樣點(diǎn)分別進(jìn)行手動(dòng)取樣和儀器自動(dòng)取樣，并進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果2 種溶出液測(cè)定峰面積基本一致，表明溶出儀管路對(duì)左乙拉西坦基本無吸附干擾。

2.5 溶出度測(cè)定

取1 批（批號(hào)為195846）左乙拉西坦片原研制劑與4 批（批號(hào)分別為 A1802061，A1701202，A1701203，A1701204）左乙拉西坦片仿制制劑（各12 片），按2015年版《中國藥典（四部）》通則0931 第二法進(jìn)行溶出度測(cè)定。分別取2.2 項(xiàng)下4 種溶出介質(zhì)，依法操作，分別于5，10，15，30，45 min 時(shí)取溶出液 5 mL 后補(bǔ)充相同溶出介質(zhì)，溶出液用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取供試品溶液及2.3 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并按外標(biāo)法計(jì)算每片樣品在各時(shí)間點(diǎn)的累積溶出度，繪制溶出曲線。詳見圖1。

圖1 仿制和原研左乙拉西坦片在4 種溶出介質(zhì)中的溶出曲線（n ＝12）A. water B.pH 1.0 hydrochloric acid solution C.pH 4.5 acetate buffer solution D.pH 6.8 phosphate buffer solutionFig.1 Dissolution profiles of generic and original Levetiracetam Tablets in four dissolution media（n ＝12）

2.6 溶出一致性評(píng)價(jià)

由圖1 可知，4 批仿制制劑與原研參比制劑在水、pH 1.0 鹽酸溶液、pH 4.5 醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液中15 min 時(shí)的溶出量均大于85%，可直接判定二者溶出行為相似，故不再計(jì)算 f2值［12］。

3 討論

國務(wù)院于2012 年發(fā)布的《國務(wù)院關(guān)于印發(fā)國家藥品安全“十二五”規(guī)劃的通知（國安〔2012〕5 號(hào)》中明確提出，要推進(jìn)仿制藥質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)，全面提高仿制藥質(zhì)量［13］。測(cè)定在多種溶出介質(zhì)中仿制藥與參比制劑的溶出曲線，是多國評(píng)價(jià)口服固體制劑內(nèi)在質(zhì)量的重要手段，也廣泛用于預(yù)測(cè)生物等效性［14］。本研究中選取4 批左乙拉西坦仿制藥與1 批同規(guī)格原研藥在4 種溶出介質(zhì)中進(jìn)行溶出度測(cè)定試驗(yàn)，并繪制溶出曲線，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，仿制藥與原研藥在4 種溶出介質(zhì)中的溶出曲線具有相似性，屬于快速溶出，表明左乙拉西坦仿制藥與原研藥體外溶出行為一致，其質(zhì)量一致性較好。