雞柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶DNA疫苗免疫保護(hù)效果研究

包夢瑩，鄒志萱，樊慧琴，黃媛媛，王佃云，劉立恒

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330045）

危害養(yǎng)雞業(yè)的胞內(nèi)寄生性原蟲病，呈世界范圍分布，發(fā)病率高達(dá)50%～70%，死亡率為20%～30%，嚴(yán)重者可達(dá)80%[1～2]。傳統(tǒng)的抗球蟲藥物和活疫苗控制方法有其自身的局限性和不足[3]。本實驗通過使絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)純化，將DNA苗通過肌肉注射進(jìn)入雞只體內(nèi)，分析結(jié)果，檢測該DNA疫苗的抗柔嫩艾美耳的能力，為新型抗球蟲疫苗的開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

健康的1日齡海蘭褐蛋公雞，將其飼養(yǎng)在經(jīng)甲醛和高錳酸鉀熏蒸嚴(yán)格消毒，高溫火槍烘烤、高壓水槍沖洗的雞舍，以保證雛雞生活環(huán)境為健康無球蟲環(huán)境。所用飼料中均不含有任何抗球蟲藥物，雞只飼養(yǎng)至14日齡備用。

1.2 基因工程疫苗

pVAX 1.0-絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶DNA，pVAX 1.0-空質(zhì)粒，-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實驗方法

2.1 DNA疫苗質(zhì)粒大量提取與純化

將帶有重組質(zhì)粒的宿主菌取出，取200μL加入到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中復(fù)蘇過夜。次日繼續(xù)用1000mL新鮮LB培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，12000 rpm離心10min收集沉淀，放入-4℃保存。后采用大提質(zhì)粒法大量提取DNA疫苗（具體流程參考分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)）。

2.2 試驗設(shè)計

飼養(yǎng)于無球蟲環(huán)境之中的1日海蘭褐蛋公雞，試驗組雞共分為4組，其中每組雛雞30羽，進(jìn)行隨機(jī)分組，分為感染非免疫組（紅對照組，攻蟲，不免疫，注射TE）、非感染非免疫組（白對照組，不攻蟲、不免疫，注射TE）、pVAX 1.0-絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶DNA組（注射DNA疫苗，攻蟲）以及pVAX 1.0-空質(zhì)粒組（注射空質(zhì)粒，攻蟲）。14日齡首免：雞只腿部肌肉注射200μl pVAX -絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶DNA質(zhì)粒/只。紅對照組和白對照組注射同體積TE緩沖液。一周后二免，每只雞腿部肌肉注射200μL pVAX-絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶DNA疫苗。紅對照組和白對照組注射同體積TE緩沖液。二免后第14天，對照組和試驗組雞只經(jīng)口接種柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊1×105個/只。在攻蟲后第7天，稱重、撲殺雞只后，取盲腸用于盲腸病變計分和克盲腸卵囊計數(shù)。

3 檢測指標(biāo)

3.1 OPG的計算

按照麥克馬斯特法（McMaster’s method）計算OPG（克腸卵囊值）?？嗣つc內(nèi)容物卵囊減少率（%）=（感染對照組卵囊數(shù)-各組卵囊數(shù)）/感染對照組卵囊數(shù)×100%。

按角田清[4]的方法對盲腸內(nèi)容物中卵囊數(shù)（OPG）與卵囊值進(jìn)行轉(zhuǎn)換。

3.2 存活率

存活率=（試驗結(jié)束時存活雞只羽數(shù)/試驗組雞只羽數(shù)）×100%

3.3 相對增重率

相對增重率=（試驗組增重率/非感染非免疫組增重率）×100%

3.4 抗球蟲指數(shù)（ACI）

ACI=（存活率+相對增重率）-（病變值+卵囊值)

3.5 對小腸進(jìn)行盲腸病變計分

病變值為最終宰殺雞后通過盲腸情況來反映各組實驗對象的病變情況，通過各組實驗對象的病變值來判斷實驗過程中是否發(fā)生交叉感染。

3.6 統(tǒng)計學(xué)分析

試驗結(jié)果采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析，采用Student-Newman-Keuls Test進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 實驗結(jié)果

根據(jù)體重增加、存活率、病變評分、卵囊減少率和抗球蟲指數(shù)（ACI）評價pVAX載體-670DNA疫苗的保護(hù)作用。試驗證明：雞球蟲的攻毒量，DNA疫苗注射途徑，雞的生長環(huán)境以及其他客觀因素都可能影響實驗結(jié)果；基因工程疫苗是時代的新方向，是值得深入探究的一個領(lǐng)域，每一次實驗都是一次寶貴的經(jīng)歷；完成動物試驗后，可進(jìn)行血清抗原抗體檢測，肌肉蛋白表達(dá)檢測等進(jìn)一步的探索實驗，使實驗更具條理性。見表1。

表1 免疫雞以柔嫩艾美耳球蟲攻蟲后的康球蟲指數(shù)分析

5 討論

根據(jù)本課題所進(jìn)行免疫性保護(hù)性實驗結(jié)果可知，實驗組的存活率相對于其它三組有明顯降低，初步判定實驗組疫苗具有一定的免疫保護(hù)效果。

分析OPG數(shù)據(jù)，可以得出感染非免疫組（紅對照）與免疫試驗組卵囊減少效果較為理想。分析病變計分?jǐn)?shù)據(jù)，可得出pVAX-絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶疫苗組病變計分較低，其次是pVAX 1.0-空質(zhì)粒組。分析ACI數(shù)據(jù)，pVAX-絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶疫苗組ACI值為146.99。

綜合以上各試驗組數(shù)據(jù)的評價參數(shù)，可以得出pVAX 1.0-SHMTDNA疫苗組在卵囊計數(shù)、相對增重、盲腸病變計分以及ACI指數(shù)方面都有一定效果，對比判定標(biāo)準(zhǔn)可知該DNA疫苗具有良好的免疫保護(hù)效果。