血管生成素樣蛋白3抑制劑研究進(jìn)展

于洋杰 謝坤 施海明

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200040)

血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(arteriosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)的重要危險(xiǎn)因素之一。在眾多血脂指標(biāo)當(dāng)中，降低低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)是目前治療動(dòng)脈粥樣硬化最有效的手段。主要針對(duì)LDL-C的調(diào)脂藥物包括他汀類藥物、依折麥布和前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)抑制劑，其均已寫入最新的指南并應(yīng)用于臨床治療中[1]。這些藥物均能在大部分人群中有效地降低LDL-C，并改善ASCVD患者的預(yù)后。用于控制LDL-C的新型藥物的研發(fā)也從未停止。2019年的CLEAR Harmony研究(n=2 230)中應(yīng)用的貝培多酸是一種可降低LDL-C的三磷酸腺苷檸檬酸裂解酶抑制劑[2]。2020年的ORION-10(n=1 561)和ORION-11(n=1 617)研究中應(yīng)用的Inclisiran則是一種小干擾RNA，它可抑制PCSK9合成從而發(fā)揮降低LDL-C的作用[3]。然而，對(duì)于家族性高膽固醇血癥患者，這些藥物的治療效果并不理想。而近期研究表明，血管生成素樣蛋白3(angiopoietin-like protein 3，ANGPTL3)的單克隆抗體可顯著降低家族性高膽固醇血癥患者的LDL-C?，F(xiàn)圍繞ANGPTL3對(duì)血脂和冠心病的影響進(jìn)行綜述。

1 家族性高膽固醇血癥患者的困境

家族性高膽固醇血癥(familial hypercholesterolemia，F(xiàn)H)是一種常染色體顯性遺傳病。FH患者由于基因突變導(dǎo)致低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor，LDLR)缺陷，其臨床特征主要表現(xiàn)為LDL-C水平升高以及早發(fā)冠狀動(dòng)脈疾病風(fēng)險(xiǎn)增加[4]。LDLR存在于肝細(xì)胞表面，可清除血液內(nèi)的LDL-C[5]。雜合子FH(HeFH)患者的血液中LDL-C的水平通常會(huì)比普通人高1～2倍，其ASCVD風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)增加3.5～16.0倍[6]。傳統(tǒng)降脂藥物發(fā)揮其降脂作用均在某種程度上需LDLR的參與[7]。由于HeFH患者仍存在一條編碼LDLR的染色體，傳統(tǒng)的降脂藥物對(duì)他們?nèi)杂幸欢ǖ男ЧＨ欢鴮?duì)于純合子FH(HoFH)患者，其肝細(xì)胞表面的LDLR完全缺陷，傳統(tǒng)調(diào)脂藥物對(duì)于這類患者的效果非常不理想。因此，研發(fā)通過非LDLR途徑降低LDL-C的藥物對(duì)于HoFH患者至關(guān)重要。

2 ANGPTL3概述

1999年Conklin等[8]最早從人的胎兒肝/脾cDNA庫分離出了ANGPTL3 cDNA。他們發(fā)現(xiàn)ANGPTL3蛋白由460個(gè)氨基酸組成，且與血管生成素有類似的結(jié)構(gòu)。Conklin等[8]同時(shí)在小鼠體內(nèi)也找到了由455個(gè)氨基酸組成的ANGPTL3蛋白，該蛋白與人的ANGPTL3有76%的氨基酸序列相同。人類ANGPTL3基因定位于1號(hào)染色體短臂(1p30.3)，包含7個(gè)外顯子。ANGPTL3主要在肝臟表達(dá)，人體組織的Northern印記雜交顯示肝臟中有4種ANGPTL3的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，大小分別為4.5 Kb、3.0 Kb、2.8 Kb和1.7 Kb，其中1.7 Kb的ANGPTL3 mRNA在人腎臟足細(xì)胞中也有微量表達(dá)。該研究還發(fā)現(xiàn)，人類ANGPTL3和小鼠ANGPTL3通過可逆地抑制脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)的催化活性，升高血漿甘油三酯(triglyceride，TG)水平，該結(jié)構(gòu)域的過表達(dá)也可提高小鼠的血漿TG水平。

2002年Yoshida等[9]在具有肥胖、高血糖和高血脂的KK小鼠中發(fā)現(xiàn)了低血脂表現(xiàn)的KK/San小鼠，并最早提出了ANGPTL3與血脂的相關(guān)性。這一亞群小鼠的血漿TG、總膽固醇(total cholesterol，TC)和游離脂肪酸水平均低于KK小鼠。該研究通過基因測序發(fā)現(xiàn)KK/San小鼠幾乎不表達(dá)ANGPTL3。而誘導(dǎo)KK/San小鼠ANGPTL3基因過表達(dá)，或靜脈注射純化的ANGPTL3蛋白則會(huì)提高小鼠血漿TG、TC和游離脂肪酸的水平，從而證實(shí)了ANGPTL3基因是KK/San小鼠低血脂表現(xiàn)的原因。

人群中也存在ANGPTL3基因(OMIM：604774)的天然突變個(gè)體，ANGPTL3基因突變會(huì)導(dǎo)致家族性低β脂蛋白血癥2型。這是一種以極低的血漿TG、LDL-C和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平為特征的常染色體隱性遺傳病。Musunuru等[10]對(duì)低β脂蛋白血癥家族的兩個(gè)成員進(jìn)行了基因組測序，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)患者ANGPTL3基因的第一個(gè)外顯子上攜帶無義突變S17X和E129X，且兩人血液中幾乎檢測不到ANGPTL3，進(jìn)而提出了ANGPTL3基因的功能缺失型突變?yōu)榧易逍缘挺轮鞍籽Y2型的病因。隨后，有研究者觀察并隨訪了數(shù)名家族性低β脂蛋白血癥2型患者，發(fā)現(xiàn)他們均長期處于健康狀態(tài)，且未患脂肪肝、嚴(yán)重頸動(dòng)脈硬化或狹窄和肝功能異常等疾病，提示家族性低β脂蛋白血癥2型本身對(duì)人體健康無明顯不良影響[11]。

后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，ANGPTL3可通過抑制脂LPL和內(nèi)皮脂肪酶(endothelial lipase，EL)的活性從而調(diào)節(jié)TG和HDL-C的水平，而對(duì)于LDL-C的調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不明晰[12]。LPL位于肝外組織的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，能使極低密度脂蛋白和乳糜微粒中攜帶的TG逐步水解并產(chǎn)生甘油和非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acid，NEFA)(圖1)[12-13]。ANGPTL3能使具有催化活性的LPL二聚體解離成無活性的LPL單體，從而導(dǎo)致血漿TG水平升高。EL位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面，可通過水解HDL磷脂降低HDL水平，阻礙膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)[14]。ANGPTL3通過抑制EL的活性來升高血漿HDL-C水平。因此ANGPTL3缺失可導(dǎo)致TG和HDL-C水平的降低。ANGPTL3缺失也可導(dǎo)致LDL-C水平降低，但其機(jī)制目前尚未研究透徹，目前可明確的是ANGPTL3缺失導(dǎo)致的LDL-C降低與LDLR無關(guān)[15]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)敲除小鼠的LDLR和EL后，ANGPTL3抑制劑并不能降低LDL-C，因此ANGPTL3抑制劑很可能是通過EL依賴的途徑降低LDL-C[16]。

圖1 ANGPTL3對(duì)脂質(zhì)代謝的影響及降脂治療方法

3 ANGPTL3抑制劑的臨床研究進(jìn)展

眾所周知，TG和LDL-C的升高均可增加ASCVD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。由于ANGPTL3的缺失可導(dǎo)致TG和LDL-C水平的降低，ANGPTL3抑制劑應(yīng)運(yùn)而生。目前一共有4種方法針對(duì)性地抑制ANGPTL3基因或ANGPTL3蛋白：基因編輯技術(shù)、單克隆抗體、反義寡核苷酸和RNA干擾[17]。真正進(jìn)入臨床研究階段的方法目前僅有兩種——單克隆抗體和反義寡核苷酸。

3.1 基因編輯技術(shù)

從基因?qū)用嬲T導(dǎo)ANGPTL3基因的功能失活的方法被稱為基因編輯技術(shù)。2018年Chadwick等[18]利用堿基編輯器3使C57BL/6J小鼠產(chǎn)生ANGPTL3無義突變。他們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，基因編輯組ANGPTL3、TG和TC分別下降了49%、31%和19%，從而證實(shí)了在小鼠體內(nèi)基因編輯技術(shù)是靶向抑制ANGPTL3的有效策略，但該技術(shù)能否應(yīng)用于人體目前尚無研究。因此基因編輯技術(shù)進(jìn)入臨床研究階段還有很長的路要走。

3.2 單克隆抗體

Evinacumab是ANGPTL3的單克隆抗體。2015年Gusarova等[19]的研究表明，在血脂正?；虍惓Ｐ∈笾?，Evinacumab能增加LPL活性，并降低血漿TG、LDL-C和HDL-C水平。2017年，Dewey等[20]在高膽固醇血癥小鼠中發(fā)現(xiàn)Evinacumab在顯著降低血漿TG和TC的同時(shí)，還能減小動(dòng)脈粥樣硬化病變面積和壞死物質(zhì)含量。同年，Evinacumab在對(duì)HoFH患者的一期臨床試驗(yàn)中顯示出了卓著的療效。經(jīng)過Evinacumab治療4周后，入選的9例HoFH患者LDL-C和TG水平降低了近50%，HDL-C水平降低了40%[21]。2020年Evinacumab的三期臨床研究得到了令人振奮的結(jié)果。該研究最終納入了65例HoFH患者，他們均接受了標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)降脂藥物治療，然而其LDL-C基線水平的均值仍為6.6 mmol/L。在此基礎(chǔ)上，經(jīng)過24周的治療后，Evinacumab組患者(n=43)相較于安慰劑組患者(n=22)LDL-C水平降低49%，TG降低50%，HDL-C降低30%[22]。并且在整個(gè)研究過程中，Evinacumab組的患者未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。

3.3 反義寡核苷酸

ANGPTL3反義寡核苷酸可介導(dǎo)ANGPTL3 mRNA在細(xì)胞內(nèi)的滅活。2017年Graham等[23]的研究表明，在各種高膽固醇血癥小鼠模型中，ANGPTL3反義寡核苷酸可有效降低肝源性ANGPTL3 mRNA的表達(dá)和血漿ANGPTL3的濃度，并劑量依賴性地減少了血漿TG、LDL-C和HDL-C水平，延緩小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。2017年，ANGPTL3的反義寡核苷酸的一期臨床研究也得到了令人興奮的結(jié)果。經(jīng)過不同劑量的IONIS-ANGPTL3-LRx治療6周后，患者的LDL-C降低幅度為1.3%～32.9%，TG降低幅度為33.2%～63.1%[23]。而在2020年ANGPTL3反義寡核苷酸的二期臨床研究中，Vupanorsen顯示出了良好的降脂作用。該研究選擇的人群并非HoFH的患者，而是有高TG血癥、2型糖尿病合并脂肪肝的患者。與安慰劑組相比，每四周給予患者80 mg的Vupanorsen可使患者的TG降低44%，LDL-C降低7%，HDL-C降低24%[24]。整個(gè)研究過程中，Vupanorsen組的患者同樣未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。

3.4 RNA干擾

RNA干擾技術(shù)可對(duì)目標(biāo)mRNA進(jìn)行高效和特異的抑制，引導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄后沉默。Xu等[25]在多種小鼠模型及人肝癌細(xì)胞中利用RNA干擾介導(dǎo)ANGPTL3基因沉默，發(fā)現(xiàn)RNA干擾能降低野生型和肥胖小鼠的血漿TG、HDL-C和LDL-C水平。目前關(guān)于ANGPTL3的RNA干擾技術(shù)相關(guān)研究較少，其作用強(qiáng)度和生物安全性也需更多研究進(jìn)一步的補(bǔ)充及驗(yàn)證。

4 ANGPTL3抑制劑可能存在的問題

既往的重大研究，如IMPROVE-IT、FOURIER和DYSSEY OUTCOMES研究，均證實(shí)LDL-C的降低導(dǎo)致的ASCVD風(fēng)險(xiǎn)的降低源自LDL-C降低本身[26-28]。所以雖然Evinacumab的三期臨床研究并未對(duì)患者的遠(yuǎn)期預(yù)后進(jìn)行隨訪，但從LDL-C的降低幅度和降低的絕對(duì)值來看，可預(yù)測患者遠(yuǎn)期的ASCVD風(fēng)險(xiǎn)會(huì)大幅降低。但Evinacumab降低LDL-C的同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致HDL-C的水平降低，幅度為30%。HDL-C可從動(dòng)脈硬化斑塊中轉(zhuǎn)運(yùn)走多余的膽固醇，故HDL被認(rèn)為是“有益的”脂蛋白。到目前為止，大量相關(guān)研究也已證實(shí)HDL-C的水平與ASCVD患者的預(yù)后有明確的相關(guān)性[29-30]。因此難免會(huì)對(duì)HDL-C的降低有所擔(dān)心。

除此之外，還需思考另外的問題——Evinacumab能否用于非FH患者？是否能用于他汀類藥物、依折麥布和PCSK9抑制劑治療效果不佳的患者？或是否比傳統(tǒng)藥物的使用優(yōu)先級(jí)更高？對(duì)于TG的降低幅度，ANGPTL3的單克隆抗體和反義寡核苷酸均表現(xiàn)出了類似的效果。然而Vupanorsen對(duì)于LDL-C的降低幅度并沒有Evinacumab那么高，其原因可能是兩個(gè)研究所納入的人群不同，基線LDL-C水平不同。這也提示ANGPTL3抑制劑在正常人群中并不能替代傳統(tǒng)的調(diào)脂藥物，或并不優(yōu)于傳統(tǒng)調(diào)脂藥物。這一系列問題還有待未來研究闡明。

5 結(jié)語

ANGPTL3單克隆抗體制劑三期臨床試驗(yàn)的成功使家族性高膽固醇血癥的患者看到了希望。研究人員也期待ANGPTL3的反義寡核苷酸制劑在未來能獲得良好的臨床效果。當(dāng)然，關(guān)于ANGPTL3還有一系列問題有待未來的研究闡明。首先，目前尚且不清楚ANGPTL3影響LDL-C水平的具體機(jī)制；其次，抑制ANGPTL3導(dǎo)致的致動(dòng)脈粥樣硬化脂蛋白減少的獲益是否能彌補(bǔ)HDL-C降低的影響，長期應(yīng)用是否真的能降低ASCVD風(fēng)險(xiǎn)；此外，長期使用ANGPTL3抑制劑的安全性尚不明確。相信隨著對(duì)ANGPTL3的深入研究，上述問題將逐漸被解開。