橘皮素通過抑制ERK1/2信號通路干預(yù)小鼠腹主動脈瘤的進(jìn)展

喬曉博 羅倩文 趙鵬 劉冉 王樂 呂曉 張明明

(1.河北省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050051； 2.華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063210； 3.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北 石家莊 050051)

腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)是動脈管壁在病理因素的作用下局部發(fā)生病變或損傷后于薄弱處向外膨出而發(fā)生的擴(kuò)張，瘤體一旦發(fā)生破裂，死亡率高達(dá)80%，嚴(yán)重威脅中老年人的生命健康[1]。炎癥反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)降解、膠原蛋白沉積和血管彈力纖維斷裂是主要病理學(xué)特征[2]。隨著動脈管壁的逐漸變薄，無法阻抗動脈血流的壓力時便發(fā)生破裂。胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通過磷酸化的形式可將細(xì)胞外各種信息傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化等相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄激活[3]，ERK1/2信號的過度激活和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2和MMP-9的高表達(dá)均與AAA相關(guān)[4-5]。另外，Notch信號通路可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)促進(jìn)AAA的病理進(jìn)程[6-7]，并且與其他細(xì)胞內(nèi)信號通路相互作用，例如c-Jun[8]和ERK1/2[9]等。

橘皮素是于橘皮中提取出來的一種天然化合物，可特異性抑制Notch1受體蛋白的表達(dá)，并在抵抗炎癥反應(yīng)和阻斷氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮著重要作用[10]。研究表明，橘皮素可抑制炎性因子介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞的釋放以及ERK1/2的磷酸化，對動脈炎癥性疾病如動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展起到一定程度的抑制作用[11]，但橘皮素是否通過ERK1/2信號抑制AAA的發(fā)展仍未見報(bào)道。因此，課題組通過構(gòu)建小鼠AAA模型去證實(shí)Notch1信號抑制劑橘皮素是否能抑制AAA的進(jìn)展以及是否與ERK1/2信號通路的干預(yù)相關(guān)，為臨床AAA的藥物治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

Notch1抑制劑橘皮素(純度為98.98%)購于北京百奧萊博科技有限公司；藥物緩釋泵(Alzet公司)購于明陽科華生物科技有限公司；血管緊張素Ⅱ購于Solarbio公司；吸入式麻醉劑異氟烷購于深圳市瑞沃德生命科技有限公司；ERK1/2和p-ERK1/2抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；兔抗鼠抗體MMP-2和MMP-9購于Abcam公司；抗體稀釋液購于Absin公司；凝膠配制試劑盒(SDS-PAGE Gel Kit)、二辛可寧酸蛋白濃度測定試劑盒、總蛋白提取試劑盒、硝酸纖維素膜(Immobilon-Nc)均購于Solarbio公司；Masson三色染色試劑盒(Solarbio公司)、彈力纖維染色試劑盒(Servicebio公司)、高脂飼料(含0.15%膽固醇、21%脂肪，美迪森公司)和抗熒光淬滅封片液(含4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

低溫離心機(jī)(天美科學(xué)儀器有限公司)，Epoch CHS酶標(biāo)儀(賽默飛世爾公司)，石蠟切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司)，光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯)和熒光顯微鏡(天津眾邦企業(yè)國際貿(mào)易有限公司)。

1.3 小鼠AAA模型及樣本制備

1.3.1 動物模型的建立

7～8周齡雄性ApoE-/-小鼠購自卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司[生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2016-0010]，體重(22±1)g，動物實(shí)驗(yàn)在河北省人民醫(yī)院臨床研究中心SPF級動物房[SYXK(冀)2015-0065]進(jìn)行，該動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過了河北省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)(201922)。以1 000 ng·kg-1·min-1持續(xù)4周劑量的血管緊張素Ⅱ緩釋泵植入小鼠皮下，同時用含0.15%膽固醇的高脂飼料常規(guī)飼養(yǎng)，構(gòu)建小鼠AAA模型，超聲檢查評估腹主動脈擴(kuò)張情況，4周后將造模成功的小鼠隨機(jī)分為兩組：對照組和治療組，各10只，治療組中每只小鼠予以100 mg/kg的橘皮素溶液灌胃，對照組給予同等劑量的生理鹽水，每日1次，共4周。

1.3.2 標(biāo)本取材

0.2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，由下腹部向上剪開至頸部，剝離肌肉及結(jié)締組織，充分暴露心臟及相連的血管和腎臟，勻速輸注4 ℃肝素生理鹽水沖洗心臟，分離心臟、主動脈及腎臟，剝離血管外膜脂肪組織后置于解剖顯微鏡下觀察主動脈血管形態(tài)，游標(biāo)卡尺測量血管最大直徑并拍照記錄，統(tǒng)計(jì)測量后進(jìn)行分析。每組5只小鼠瘤體組織4%多聚甲醛固定，石蠟包埋；另外5只瘤體組織置于液氮中保存。

1.4 檢測方法

1.4.1 Masson染色

石蠟切片浸入二甲苯液中進(jìn)行脫蠟，梯度酒精入水處理后，用免疫組化筆在載玻片上將組織畫圈，Weigert鐵蘇木素染色10 min，水洗后置于酸性乙醇液分化1 min，流水沖洗并滴加Masson藍(lán)化液5 min返藍(lán)，再次沖洗，麗春紅品紅染液滴染10 min，之后用磷鉬酸溶液洗3 min，滴加苯胺藍(lán)染液3 min，弱酸工作液洗1 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%、100%Ⅰ和100%Ⅱ的酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4.2 彈力纖維染色

制備好的石蠟切片依次脫蠟至水，將酒精蘇木素、三氯化鐵和碘液按照5∶2∶2的比例混合為彈力纖維染色(Elastic Van Gieson，EVG)染液，避光滴加至切片組織上10 min，水洗，酸性乙醇分化液分化數(shù)秒，水洗終止分化，顯微鏡下控制分化程度，直至彈力纖維呈紫黑色細(xì)絲狀為佳，苦味酸與酸性品紅按9∶1混合配置VG染液，滴染10 s后浸入梯度酒精(95%、100%Ⅰ和100%Ⅱ)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4.3 Western blot檢測

取出凍存的血管組織，用眼科剪剪碎，置冰上充分研磨后加入組織裂解液，4 ℃離心提取蛋白；配制SDS-PAGE凝膠，蛋白加樣連接電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，置于5%脫脂奶粉中封閉2 h，滴加稀釋后的一抗4 ℃過夜，TBST洗5 min×5次，置于帶有辣根過氧化物酶的二抗溶液中振蕩孵育2 h，TBST洗5 min×5次，滴加電化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影。

1.4.4 免疫熒光染色

4 μm切片石蠟切片，脫蠟至水，檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)，冷卻后磷酸緩沖鹽溶液浸洗5次，10%山羊血清室溫封閉30 min，一抗(抗體1∶50比例稀釋)4 ℃孵育過夜，PBS浸洗5次，熒光二抗避光室溫孵育60 min，PBS浸洗5次，抗熒光淬滅封片液染核并封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠AAA的膨脹尺寸比較

測量兩組小鼠瘤體尺寸后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，治療組小鼠腹主動脈血管的持續(xù)擴(kuò)張明顯被抑制[(1.812±0.143) mm vs(2.549±0.265) mm，n=10]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如圖1所示。

2.2 兩組小鼠AAA的病理學(xué)觀察

Masson和EVG染色發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠AAA腔體增大，中膜層平滑肌細(xì)胞數(shù)減少且排列紊亂，膠原纖維溶解，含量減少；中層彈力蛋白結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，原有曲度消失，甚至變直、變細(xì)和缺失，膠原沉積，斷裂明顯；經(jīng)橘皮素干預(yù)后，AAA組織形態(tài)較為完善，膠原纖維排列均勻，中膜層彈力蛋白結(jié)構(gòu)相對完整，縱行分裂較少，連續(xù)性好，彈力纖維曲度可見。如圖2所示。

注：組織形態(tài)學(xué)顯示橘皮素減弱了ApoE-/-小鼠AAA的膨脹尺度(*P<0.05)。圖1 橘皮素對小鼠AAA膨出直徑的影響

注：A和B：Masson染色中藍(lán)色代表膠原纖維，橘皮素抑制了治療組小鼠膠原纖維的溶解(放大倍數(shù)：10×)；C和D：EVG染色中黑色代表彈力纖維，和對照組相比，橘皮素治療組小鼠彈力纖維相對完整(放大倍數(shù)：10×)。圖2 Masson和EVG染色兩組小鼠AAA組織結(jié)果

2.3 兩組小鼠AAA組織中ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)

與對照組相比，100 mg/kg的橘皮素治療組ApoE-/-小鼠動脈瘤組織中ERK1/2蛋白表達(dá)無明顯變化，而其活化形式p-ERK1/2活性降低，隨之其下游分子蛋白MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)亦有所下降，提示橘皮素對ERK通路蛋白的調(diào)控作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

注：A：和對照組相比，橘皮素治療組total-ERK1/2蛋白表達(dá)無明顯變化，但其活化狀態(tài)的p-ERK1/2以及MMP-9和MMP-2的表達(dá)明顯降低(＊＊P<0.01，＊P<0.05)，GAPDH為內(nèi)參；B：橘皮素治療組p-ERK1/2、MMP-9和MMP-2的表達(dá)水平明顯降低(＊＊P<0.01，＊P<0.05)。圖3 Western blot檢測兩組小鼠AAA組織中ERK通路蛋白的表達(dá)

2.4 兩組小鼠AAA組織中MMP-2、MMP-9的定位

免疫熒光染色結(jié)果顯示，在AAA組織中MMP-2表達(dá)主要分布于血管中膜部分，MMP-9主要分布在外膜區(qū)域；并且與對照組比較，治療組主動脈壁綠色和紅色熒光的強(qiáng)度明顯減弱，進(jìn)一步表明橘皮素對MMP-2和MMP-9表達(dá)的抑制作用。見圖4。

注：A：綠色熒光區(qū)域代表MMP-2在各組小鼠AAA中的表達(dá)情況(放大倍數(shù)：40×)；B：橙紅色熒光區(qū)域代表MMP-9在各組小鼠AAA中的表達(dá)情況(放大倍數(shù)：40×)；C：免疫熒光染色顯示橘皮素降低了MMP-2和MMP-9在小鼠AAA中的表達(dá)(＊＊P<0.01)。圖4 免疫熒光法檢測橘皮素對ERK通路下游蛋白的影響

3 討論

腹主動脈血管中膜層以層狀排列的血管平滑肌細(xì)胞為主，其可分泌大量的彈力蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)，用以維持并修復(fù)血管壁正常彈性狀態(tài)。在AAA的形成過程中，炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)趨化因子的分泌，招募單核巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞在血管壁聚集，大量的炎性細(xì)胞可降解細(xì)胞外基質(zhì)并促使血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，致使正常血管組織結(jié)構(gòu)被破壞，血管穩(wěn)態(tài)及順應(yīng)性降低，最終促進(jìn)了血管壁的局部擴(kuò)張。大量研究證實(shí)，動脈瘤的發(fā)生機(jī)制與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和MMPs家族的水解有關(guān)，而炎癥反應(yīng)貫穿于動脈瘤病程的始終[12-13]。以巨噬細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞聚集和炎性因子的釋放激活血管平滑肌細(xì)胞中ERK信號通路，該通路的激活促進(jìn)MMP-2和MMP-9表達(dá)的上調(diào)，溶解細(xì)胞外基質(zhì)成分，血管組織屏障進(jìn)一步被破壞[14]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，Notch1信號通路可能是通過影響血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞參與動脈粥樣硬化和AAA的發(fā)展進(jìn)程[15]，并且該信號通路與ERK等多種信號傳導(dǎo)途徑交匯[16]。并且在小鼠動脈瘤模型中，ERK磷酸化水平明顯高于正常小鼠，通過抑制ERK通路蛋白的活化可明顯延緩AAA的進(jìn)展[17-18]，提示Notch1可能是ERK1/2的上游信號并促進(jìn)下游分子MMP-2和MMP-9的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)成功的小鼠AAA模型中，血管組織中ERK磷酸化水平顯著升高且MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量亦增加；與此同時，MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)主要位于血管中膜和外膜組織，并伴隨彈力纖維斷裂以及大量膠原沉積，增加了動脈壁的擴(kuò)張程度和動脈瘤破裂的風(fēng)險；而在治療組中小鼠的腹主動脈壁結(jié)構(gòu)趨于相對完整，擴(kuò)張度明顯降低，膠原纖維分布均勻，彈力纖維斷裂程度減緩，說明橘皮素顯著保護(hù)了動脈壁結(jié)構(gòu)的完整性，具有抑制AAA進(jìn)展的作用。這與已有的橘皮素具有抗炎功能的報(bào)道結(jié)果一致。另外，橘皮素作為特異性阻斷Notch1受體表達(dá)的天然產(chǎn)物[19-20]，具有毒副作用少的優(yōu)勢，配合其他信號分子化學(xué)抑制劑的效果值得進(jìn)一步研究。

盡管本研究證實(shí)了橘皮素抑制小鼠AAA的作用是通過ERK1/2信號通路的干預(yù)，但以下幾點(diǎn)限制仍值得研究者的關(guān)注：(1)對照組和治療組中整體Notch家族1～4分子的表達(dá)情況如何需進(jìn)一步檢測，以期全面了解該信號通路在AAA中的作用；(2)橘皮素與ERK1/2信號抑制劑聯(lián)合應(yīng)用是否在抑制AAA進(jìn)展中的作用更為突出；(3)細(xì)胞水平的分子機(jī)制闡述仍必不可少。

綜上所述，橘皮素作為Notch信號通路抑制劑可通過與ERK1/2的通路相互作用延緩AAA擴(kuò)張的進(jìn)程，抗血管重塑并降低AAA破裂的風(fēng)險，有望成為有效緩解和治療AAA進(jìn)展的藥物分子。