苦參堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞中Bcl-2/Bax表達(dá)水平及生物學(xué)行為的影響

楊 繁，曾永蕾

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230038)

宮頸癌是威脅女性身體健康的癌癥之一，陰道觸碰性流血、陰道排出白色或血色液體及有腥臭味道是宮頸癌常見(jiàn)的臨床特征，發(fā)病群體無(wú)規(guī)律性[1]。根據(jù)我國(guó)流行病調(diào)查顯示：我國(guó)每年有10萬(wàn)新增宮頸癌患者，以每年1.0%增長(zhǎng)。宮頸癌疾病多為機(jī)體感染HPV病毒導(dǎo)致，HPV屬于DNA病毒，具有快速?gòu)?fù)制和繁殖的特點(diǎn)[2]。隨著宮頸癌篩查力度的增加，該疾病在早期能夠被發(fā)現(xiàn)，臨床手術(shù)及放化療均可以降低死亡率，但是毒副作用的增加，導(dǎo)致宮頸癌治療受限，因此，尋找新的藥物至關(guān)重要[3]。近些年，從植物中提取有效成分應(yīng)用于抗腫瘤的研究逐漸增多，苦參堿是從豆科植物提取的生物堿類，苦參是其中主要成分之一，在抑制炎癥、抵抗病毒方面具有重要作用。幾年來(lái)在廣譜抗腫瘤的作用中備受關(guān)注，對(duì)肝癌、胃癌細(xì)胞均具有較好的抑制作用[4]。凋亡蛋白家族，Bax為促進(jìn)凋亡，Bcl-2、Bcl-xl作用與之相反[5]，均參與癌細(xì)胞的凋亡及增殖，但是在宮頸癌細(xì)胞中的作用還有待商榷，因此，本文主要探討苦參堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞中Bcl-2/Bax表達(dá)水平及生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 宮頸癌Hela細(xì)胞株(美國(guó)ATCC公司)；苦參堿(上海源葉生物科)；鼠抗人Bcl-2、Bax抗體(Santa Cruz公司，USA)；RPMI1640培養(yǎng)基(上海邦景)；電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)。

1.2 苦參堿溶液配制 將苦參堿溶于濃度<0.1的二甲基亞砜溶液中，-2 ℃保存，無(wú)血培養(yǎng)基稀釋為1.0、1.5、2.0 mg/ml。

1.3 宮頸癌Hela細(xì)胞株培養(yǎng)與分組 將低溫冷藏的Hela細(xì)胞，快速移入37 ℃水中溶解，離心后，離棄上清液，加入培養(yǎng)基，無(wú)氧下培養(yǎng)，每隔一日更換培養(yǎng)液，生長(zhǎng)到85%～90%時(shí)，消化傳代，把無(wú)苦參堿處理的Hela細(xì)胞分為宮頸癌組，加入1.0、1.5、2.0 mg/ml濃度藥物的細(xì)胞分為藥物組。

1.4 MTT法檢測(cè)Hela細(xì)胞抑制率 采用10%FBS將濃度為1000 ng/μl的苦參堿溶液分別調(diào)整濃度為1.0、1.5、2.0 g/L，取Hela細(xì)胞數(shù)目為5×103接種到96孔板中，宮頸癌組未加入藥物，藥物組加入多個(gè)濃度以上苦參堿藥物溶液，培養(yǎng)24、48、72 h，后加入20 μl MTT，4 h后，加入150 μl DMSO，采用酶標(biāo)儀測(cè)570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)每個(gè)孔Hela細(xì)胞的抑制率。

1.5 檢測(cè)Hela細(xì)胞遷移能力 Hela細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理，12 h后再加入DMSO，24 h后離心重懸細(xì)胞5×103/ml，將200 μl的細(xì)胞懸液加入小室中，下室中加入含20%血清的培養(yǎng)基600 μl，37 ℃，培養(yǎng)2～3 d，取出小室，用棉簽拭去上室細(xì)胞，進(jìn)行染色，計(jì)算Hela細(xì)胞數(shù)。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡 將Hela細(xì)胞以5×103個(gè)數(shù)量種于96孔板，過(guò)夜培養(yǎng)后按上述分組分別加入不同的藥物濃度，培養(yǎng)1 d后，加入少量胰蛋白酶，消化4 min后，收集細(xì)胞進(jìn)行離心，棄去上清液，采用PBS反復(fù)洗滌3次，后進(jìn)行避光染色，后采用流式細(xì)胞儀分析Hela細(xì)胞凋亡。

1.7 免疫印跡檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白 100 μl濃度為5×103的Hela細(xì)胞溶液，高速離心0.5 h，收集上清液。將蛋白上清處理后加入上樣孔。電泳后，取下PVDF膜TBST浸泡10 min，室溫封閉2 h,TBST洗5 min、3次，然后加一抗(1∶500 ),4 ℃雜交24 h，TBST洗5 min、3次，加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2000)，室溫下雜交2 h，再次TBST洗5 min、3次。將膜浸入ECL工作液，隨后進(jìn)行檢測(cè)，獲取圖像。

2 結(jié) 果

2.1 苦參堿干預(yù)下Hela細(xì)胞活性抑制率 見(jiàn)表1。MTT結(jié)果顯示：宮頸癌組Hela細(xì)胞活性抑制率低于藥物組(P<0.05)，2 g/L藥物組Hela細(xì)胞活性抑制率高于1.0、1.5 g/L藥物組(P<0.05)，同一組中，72 h Hela細(xì)胞活性抑制率高于24、48 h(P<0.05)，隨著藥物濃度及時(shí)間延長(zhǎng)Hela細(xì)胞活性抑制率逐漸升高。

表1 苦參堿干預(yù)下Hela細(xì)胞活性抑制率(%)

2.2 苦參堿對(duì)Hela細(xì)胞侵襲數(shù)目的影響 1 g/L藥物組Hela細(xì)胞侵襲數(shù)目低于宮頸癌組(P<0.05),2 g/L藥物組Hela細(xì)胞侵襲數(shù)目低于1、1.5 g/L藥物組(P<0.05)，四組細(xì)胞侵襲數(shù)目差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.3 苦參堿對(duì)Hela細(xì)胞凋亡周期及凋亡率的影響 見(jiàn)表2。G0-G1期宮頸癌組細(xì)胞凋亡與藥物組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，G0-G1期、G2-M期各組相差較小(P>0.05),2 g/L藥物組Hela細(xì)胞凋亡率最高，宮頸癌組細(xì)胞凋亡率最低，四組Hela細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 苦參堿對(duì)Hela細(xì)胞凋亡周期及凋亡率的影響

2.4 苦參堿對(duì)Bcl-2、Bax蛋白水平的影響 見(jiàn)表3(圖2)。1 g/L藥物組Hela細(xì)胞下Bcl-2蛋白水平低于宮頸癌組(P<0.05)，2 g/L藥物組Hela細(xì)胞下Bcl-2蛋白水平低于1、1.5 g/L藥物組(P<0.05)，Bax表達(dá)與Bcl-2相反。

表3 Hela細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白水平

3 討 論

苦參堿屬于中藥生物調(diào)節(jié)劑，對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞存在潛在的抵抗作用，例如：肺癌、肝癌和胃癌等[6]。本文通過(guò)采用不同濃度的苦參堿對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞活性顯著降低，向周圍擴(kuò)散的能力減慢，在苦參堿劑量增加的同時(shí)細(xì)胞凋亡與劑量成正相關(guān)。

目前抗腫瘤藥物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制方式有很多，如抑制細(xì)胞活性、促進(jìn)凋亡、減少侵襲等。本文通過(guò)MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)苦參堿可以抑制Hela細(xì)胞活性，在72 h時(shí)和濃度為2 g/L時(shí)細(xì)胞活性抑制率達(dá)到頂峰。近些年，從植物中提取抗腫瘤的藥物的研究表現(xiàn)出了巨大的潛力，苦參堿屬于中藥提取物，是從苦參根部提取出的堿性成分物質(zhì)。藥理學(xué)研究表明，苦參堿能夠通過(guò)對(duì)Hela細(xì)胞中線粒體活性進(jìn)行干預(yù)，誘發(fā)癌細(xì)胞基因發(fā)生甲基化模式，調(diào)節(jié)Hela細(xì)胞信號(hào)，抑制腫瘤細(xì)胞活性，加快宮頸癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤的作用[7-8]。毛燕等[9]研究表示苦參堿還能夠通過(guò)激活機(jī)體免疫因子，抑制Hela細(xì)胞活性發(fā)展，并有效降低細(xì)胞毒性，減緩宮頸癌病變，本文與之結(jié)果相似。

本文研究表示，苦參堿可以加快Hela細(xì)胞凋亡，減少侵襲，隨著苦參堿濃度的升高，凋亡加劇，侵襲數(shù)量降低，說(shuō)明苦參堿能夠促使宮頸癌細(xì)胞存活周期縮短，減少擴(kuò)散。眾所周知，細(xì)胞受多種信號(hào)調(diào)節(jié)進(jìn)行多種生物活動(dòng)，但是，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生DNA突變時(shí)，信號(hào)產(chǎn)生抑制，機(jī)體平衡狀態(tài)遭到破壞，癌細(xì)胞產(chǎn)生[10]?？鄥A能夠通過(guò)不同作用形式加快Hela細(xì)胞凋亡，對(duì)宮頸癌細(xì)胞的凋亡信號(hào)進(jìn)行調(diào)節(jié)，能夠減少腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，并發(fā)揮抗Hela細(xì)胞黏性作用，減少Hela細(xì)胞的侵襲和遷移[11-12]。許海等[13]研究表示苦參堿能夠?qū)m頸癌組織進(jìn)行有效干預(yù)，減少毒性和炎癥浸潤(rùn)，緩解組織病變。本文與張悅等[14]研究結(jié)果相似。

隨著對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族在多種惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮作用。其下游因子分為不同亞型，Bcl-2能夠減少宮頸癌細(xì)胞壞死，Bax作用與之相反[15-16]?？鄥A具有促進(jìn)癌細(xì)胞壞死作用，均能夠與線粒體和核孔復(fù)合體的信號(hào)傳導(dǎo)作用，增加腫瘤細(xì)胞壞死，縮短癌細(xì)胞存活期[17]。Jie等[18]研究表示，體外實(shí)驗(yàn)研究表明對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞經(jīng)苦參堿干預(yù)，無(wú)干預(yù)下的宮頸癌細(xì)胞Bcl-2水平活躍，干預(yù)后下的癌細(xì)胞Bcl-2水平降低，同時(shí)能夠減少生物活性，縮短生存時(shí)間。研究表示，苦參堿對(duì)惡性腫瘤具有抑制作用一致時(shí)學(xué)術(shù)界研究的中藥，金暢等[19]研究表示利用苦參堿可以輔助治療宮頸癌患者，對(duì)患者免疫調(diào)節(jié)具有較好的作用。趙林等[20]研究表示Bcl-2與Bax在宮頸癌細(xì)胞作用呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，Bcl-2降低，Bax上升，Bcl-2、Bax對(duì)宮頸癌DNA表型調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。

綜上所述，苦參堿抑制宮頸癌Hela細(xì)胞活性，加快Hela凋亡，減少向周圍細(xì)胞擴(kuò)散的能力，上述原因可能與抑制Bcl-2表達(dá)，增加Bax水平相關(guān)。