電針聯(lián)合有氧運動對腦梗死后缺血半暗帶cAMP/PKA通路的影響

張良兵，操禮瓊，董 巍

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶市第一人民醫(yī)院， 安徽 安慶 246003)

電針是目前改善腦梗死后運動功能障礙的重要補充手段，以改善中風(fēng)后遺諸癥[1-2]。有數(shù)據(jù)證實電針與有氧運動可協(xié)同改善腦梗死患者的神經(jīng)功能缺損癥，但其作用機制目前尚無統(tǒng)一定論。有學(xué)者[3]證實腦組織細胞內(nèi)cAMP/PKA通路的活化是修復(fù)神經(jīng)元功能的靶點，更有研究人員[4]將cAMP/PKA通路作為非影像學(xué)標(biāo)志軸突再生的指標(biāo)。本研究通過觀察腦組織超微結(jié)構(gòu)及cAMP、PKA蛋白表達變化，結(jié)合實驗性大鼠的運動功能評價，旨在探討電針結(jié)合有氧運動改善腦梗死后運動功能障礙的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動 物 選用SPF級成年雄性SD大鼠[初始體重(220±20)g]92只，由中國上海SLAC實驗動物有限責(zé)任公司提供[合格證號：SCXK(滬)2017-0005],于安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心適應(yīng)性喂養(yǎng)，體重達(280±20)g進行實驗研究。食物和水在整個實驗過程中由動物自由索取。實驗經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物管理制度和使用委員會批準(zhǔn)后進行，嚴(yán)格按照國際道德準(zhǔn)則和國家健康指南關(guān)于維護和使用實驗動物相關(guān)條例進行處理實驗動物。

1.2 試劑及儀器 TTC染液、PMSF、SDS-PAGE電泳膠、BCA工作液(碧云天公司，中國)，PKA ELISA試劑盒(CST公司，美國)，DAPI染色液(CST公司，美國)，cAMP、β-actin一抗和堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔(Promega公司，美國)等。

電針儀(G6805，中國上海醫(yī)療儀器廠)，小動物跑臺(軟隆科技，中國)，高速冷凍離心機(Thermo Fisher，美國)，切片機(Leica，德國)，激光共聚焦熒光顯微鏡(Bio-rad，美國)，透射電鏡(TACHI，日本)酶標(biāo)儀(Leica，德國)，電泳槽(Bio-rad，美國)，轉(zhuǎn)膜儀(Bio-rad，美國)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad，美國)。

1.3 實驗分組 本研究共分五組，將SD大鼠進行兩次隨機，第1次分組：以1∶4 的比例用隨機數(shù)字表法隨機分配空白組18只和造模組74只；第2次分組：根據(jù)神經(jīng)行為學(xué)評估，將腦缺血造模失敗大鼠剔除(本實驗造模成功72只大鼠，成功率97.3%)，用隨機數(shù)字表法隨機分配分為模型組18只、電針組18只、有氧運動組18只、電針+有氧運動組18只，分別于干預(yù)后7 d留取標(biāo)本。

1.4 模型制備 接受模型制備的大鼠禁食12 h后腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)，待大鼠充分麻醉后將大鼠呈仰臥位固定于實驗架上，剔除頸部毛發(fā)，常規(guī)消毒術(shù)野區(qū)域，沿著頸部正中線剪開皮膚，鈍性分離充分暴露左頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)，從ECA尾端沿著ICA緩慢插入線栓至左側(cè)大腦中動脈入口，造成供血區(qū)急性缺血，固定線栓后逐層縫合皮膚，常規(guī)消毒，2 h后拔出線栓形成缺血再灌注。

1.5 干預(yù)方法

1.5.1 有氧運動：本研究中的有氧運動采用跑臺訓(xùn)練方式進行，運動強度參考文獻[4]，具體運動過程如下：大鼠于每日8∶00開始進行跑臺運動，跑臺坡度設(shè)置為0°，先將大鼠以10 m/min速度訓(xùn)練15 min以便大鼠熟悉跑臺環(huán)境，隨后以20 m/min的速度運動30 min，連續(xù)訓(xùn)練7 d。訓(xùn)練結(jié)束后對大鼠進行急性腦梗死模型制備。判斷力竭標(biāo)準(zhǔn)[4]：大鼠訓(xùn)練出現(xiàn)動作僵硬吃力，80%以上的訓(xùn)練時間呈半臥位跑，降低跑臺速度后大鼠體力未恢復(fù)，對外界刺激反應(yīng)明顯遲鈍。

1.5.2 電針治療：造模24 h后對大鼠進行電針干預(yù)，先將大鼠固定于實驗架上，參照李忠仁主編的《實驗針灸學(xué)》中曲池穴、足三里穴定位，將30#1寸不銹鋼毫針快速刺入上述穴位，進針深度2 mm，接上 G6805 電針儀，電壓峰值為6 V，以針體輕輕抖動為度，疏密波，頻率1～20 Hz，每次電針 30 min，1次/d，連續(xù)干預(yù)7 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 神經(jīng)行為學(xué)檢測：造模24 h后對大鼠進行神經(jīng)行為學(xué)評分，評分方法參照Bederson等的5級分類法，具體評分內(nèi)容如下：造模后大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)缺損癥狀(0分)；提尾時大鼠右前肢屈曲，伸展不充分(1分)；提尾時大鼠右前肢屈曲，置于地面時向右側(cè)推動時阻力低于對側(cè)(2分)；提尾時大鼠右前肢屈曲，步行時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈(3分)；造模后意識不清，甚至死亡(4分)。

1.6.2 TTC染色：干預(yù)后每組隨機選取3只大鼠，腹腔注射10%是水合氯醛(0.3 ml/100 g)，待大鼠充分麻醉后脫頸處死，冰上快速將腦組織取出后置于-20 ℃冰凍30 min，用鋒利刀片將腦組織冠狀位方向平均切成5片，每片約2 mm，將腦片置于TTC溶液中，避光染色30 min，期間依照著色程度對腦片進行翻動。正常腦組織經(jīng)過TTC溶液著色后呈現(xiàn)鮮紅色，梗死區(qū)域呈蒼白色。染色結(jié)束后利用高清掃描儀對腦片進行掃描，Image J軟件對梗死區(qū)域大小進行分析統(tǒng)計。腦梗死體積=腦梗死面積×2 mm/全部腦片體積×100%。

1.6.3 透射電鏡觀察缺血半暗帶超微結(jié)構(gòu)：干預(yù)后每組隨機選取3只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)，待大鼠充分麻醉后腹腔注射4%多聚甲醛對腦組織進行灌流固定，冰上快速取出缺血半暗帶，將組織修切成大小約1 mm3置于后2.5% 戊二醛磷酸緩沖液中24 h，隨后將樣本置于0.1 mol/L 的磷酸緩沖液漂洗3次，5 min/次，再進行常規(guī)脫水、包埋后烘干，再制成60 mm的薄切片，充分干燥后透射電子顯微鏡下觀察缺血半暗帶的超微結(jié)構(gòu)。

1.6.4 ELISA檢測外周血cAMP、PKA濃度：干預(yù)后每組隨機選取3只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)，待大鼠充分麻醉后取腹主動脈血10 ml，4 ℃條件下進行3000 g離心5 min后收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)對樣本進行檢測。利用0.05 mol/L的碳酸鹽包備緩沖液將樣本稀釋至蛋白質(zhì)含量5 μg/ml，將96孔板中的反應(yīng)孔中加入0.1 ml，4 ℃靜置5 h后摒棄反應(yīng)孔溶液，用洗滌緩沖液洗滌反應(yīng)孔，再將待測樣本加入反應(yīng)孔中，室溫下靜置60 min后再次洗滌反應(yīng)孔，分別加入酶標(biāo)抗體、TMB底物后室溫下靜置30 min，再加入2 mmol/L的硫酸靜止反應(yīng)后將反應(yīng)孔置于MTT酶標(biāo)儀中進行檢測。以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分比較 見表1。造模24 h后，除空白組外，其余四組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分均升高(P<0.05)，且四組間差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)，說明本研究的造模是成功的；經(jīng)干預(yù)7 d，電針組、有氧運動組、電針+有氧運動組的神經(jīng)行為學(xué)評分均較治療前及模型組有所下降(P<0.05)；且電針+有氧運動組的神經(jīng)行為學(xué)的改善程度明顯大于電針組、有氧運動組(P<0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分比較(分)

2.2 各組大鼠腦梗死體積的比較 干預(yù)7 d，與空白組比較，模型組、電針組、有氧運動組、電針+有氧運動組大鼠的腦組織均出現(xiàn)不同程度的梗死灶(P<0.05)；與模型組比較，電針組、有氧運動組、電針+有氧運動組的腦梗死體積百分比下降(P<0.05)，且電針+有氧運動組下降程度大于電針組、有氧運動組(P<0.05)。見圖1。

A：各組大鼠腦組織TTC染色情況(n=4)；B：各組大鼠腦梗死體積比較；與空白組比較，*P<0.05；

2.3 各組大鼠缺血半暗帶組織超微結(jié)構(gòu)比較 透射電鏡提示空白組大鼠缺血半暗帶的神經(jīng)元細胞排列整齊，可見完整的細胞膜及細胞器、飽滿的細胞核，模型組大鼠腦組織見排列紊亂的神經(jīng)元、溶解的細胞器，且無法識別，與模型組比較，電針組、有氧運動組及電針+有氧運動組大鼠神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)較模型組明顯改善，細胞膜、細胞器及細胞核完整度明顯改善，且電針+有氧運動組優(yōu)于電針組、有氧運動組(圖2)。

圖2 各組大鼠缺血半暗帶腦組織超微結(jié)構(gòu)比較(n=4，×15000)

2.4 各組大鼠外周血PKA蛋白表達比較 見表2。與空白組比較，模型組大鼠血清cAMP、PKA蛋白表達模型組下降(P<0.05)，經(jīng)治療7 d后，電針組、有氧運動組及電針+有氧運動組大鼠血清cAMP、PKA蛋白表達均增加，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但電針+有氧運動組的cAMP、PKA蛋白表達均高于電針組、有氧運動組(P<0.05)。

表2 各組大鼠外周血PKA蛋白表達比較(pg/ml)

3 討 論

腦梗死以其高致死率、高發(fā)病率、高致殘率的特點成為臨床研究重點[5]，隨著醫(yī)療水平日益提升，腦梗死患者的生存率及發(fā)病率得到明顯改善，但其遺留的運動功能障礙仍是亟待解決的關(guān)鍵問題[6-7]。研究表明有規(guī)律的有氧運動對腦神經(jīng)有良好的保護效應(yīng)[8]，有氧訓(xùn)練可以從行走能力、姿勢反射、肌力、平衡功能等角度促進腦梗死癱瘓肢體的運動功能恢復(fù)，本研究結(jié)果顯示有氧訓(xùn)練可明顯降低MCAO模型大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分，縮減其腦梗死體積，這一研究結(jié)果與國內(nèi)外諸多文獻所得數(shù)據(jù)一致。

針灸作為目前臨床重要的中醫(yī)治療手段被廣泛應(yīng)用于改善腦梗死的功能障礙[9-10]?！鹅`樞·口問》中云：“夫十二經(jīng)脈者，內(nèi)屬于府藏，外絡(luò)于支節(jié)”，認(rèn)為刺激特定的穴位可將全身上下、內(nèi)外、前后、左右形成一個有機整體，從而直達病所。曲池穴是手陽明大腸經(jīng)合穴，清代吳謙在其《醫(yī)宗金鑒》中寫道：“曲池主治中風(fēng)是”；《針灸資生經(jīng)》亦明確“刺風(fēng)疹疼痛冷緩，捉物不得，挽弓不開，屈身難隱，脈風(fēng)臂肘細無力”，可見歷代醫(yī)家均肯定了曲池穴在治療腦卒中引起的運動障礙中的作用。足三里乃足陽明胃經(jīng)的合穴，陽明經(jīng)多氣多血，刺激足陽明胃經(jīng)可調(diào)暢氣血、扶助正氣?！夺樉姆暝础罚骸鞍肷聿凰欤捍擞蓺庋恢堋贂⒓缇?、肩髃、曲池、手三里、 列缺、風(fēng)市、絕骨、足三里。以上穴，先針無病手足，后針有病手足”[11-12]。可見刺激曲池穴、足三里穴是促進腦梗死后肢體功能恢復(fù)的特定穴。本研究亦發(fā)現(xiàn)電針上述穴位后大鼠運動能力較前改善，缺血半暗帶的超微結(jié)構(gòu)亦在一定程度上得到修復(fù)，可見曲池穴、足三里穴、可作為腦梗死后康復(fù)治療的重要組成部分，且我們還發(fā)現(xiàn)大鼠在進一步接受電針聯(lián)合有氧運動干預(yù)后神經(jīng)功能修復(fù)程度更為凸顯，由此可見電針聯(lián)合有氧運動對腦梗死后運動功能障礙的改善確有協(xié)同效應(yīng)。

大量實驗研究結(jié)果證實cAMP廣泛參與神經(jīng)元突觸相關(guān)物質(zhì)的合成、傳遞等環(huán)節(jié)，對神經(jīng)元存活及軸突生長發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[13-15]。內(nèi)源性或外源性的刺激引起特定部位神經(jīng)元細胞的興奮性增加，從而釋放神經(jīng)遞質(zhì)，由此導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶AC的活化，AC被激活后可將ATP轉(zhuǎn)化為cAMP，由此使得特定部位cAMP水平增加，隨后促使更多的cAMP與PKA調(diào)節(jié)亞基相結(jié)合[16-18]，由此PKA結(jié)構(gòu)域發(fā)生變化，使得催化亞基PKAc解離后發(fā)生核移位，進入細胞核的PKAc誘發(fā)CREB發(fā)生磷酸化，由此引起pCREB蛋白構(gòu)象產(chǎn)生變化致其酸性增強，隨后引起負(fù)電荷增多，據(jù)目前研究可知與DNA相結(jié)合的組蛋白均帶有正電荷，由此在正負(fù)電荷相吸下pCREB與DNA上組蛋白大量結(jié)合，由此DNA從組蛋白上分離出來，故組蛋白對DNA的抑制效應(yīng)被解除，從而促使DNA啟動轉(zhuǎn)錄程序，實現(xiàn)對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[19-20]。本研究我們發(fā)現(xiàn)腦梗死發(fā)生后大鼠腦組織的cAMP、PKA濃度減少，可見當(dāng)腦組織急性缺血時該通路被抑制，隨著電針聯(lián)合有氧運動的介入，cAMP、PKA表達明顯上調(diào)，提示電針聯(lián)合有氧運動激活了cAMP/PKA通路，促進缺血神經(jīng)功能的修復(fù)，適應(yīng)腦組織內(nèi)環(huán)境的變化。

由此可見電針聯(lián)合有氧運動可激活腦組織cAMP/PKA通路，實現(xiàn)腦保護效應(yīng)。