大腸桿菌檢驗(yàn)方法的探究與分析

劉慶紅，楊銘

（重慶市江津區(qū)疾病預(yù)防控制中心，重慶）

0 引言

人類及其他恒溫動(dòng)物的糞便中含有致病菌，不過一般情況下由于數(shù)量比較少而在檢測上存在一定的困難。大腸桿菌也就是大腸埃希菌，是人和溫血?jiǎng)游锬c道中檢出率最高的一種菌種[1,2]，如果從食物或者藥品中檢驗(yàn)出大腸桿菌，則有可能意味著糞便對其造成了污染進(jìn)而受到了致病菌的影響。故大腸桿菌常被看作是藥品受到糞便污染的指南菌種。在大腸桿菌、痢疾桿菌引發(fā)的腸炎及菌痢等疾病的治療中經(jīng)常被使用的抗菌藥物有呋喃哇酮片。這種抗菌藥物具有較好的抗菌特性，但是在受到污染的呋喃哇酮片含有大腸桿菌的檢驗(yàn)上存在一定的困難。用于檢驗(yàn)大腸桿菌的方法有很多，但是適宜應(yīng)用在呋喃哇酮片這類抗菌藥物的大腸桿菌的檢驗(yàn)中的方法比較少。下面采用四種檢驗(yàn)方法對呋喃哇酮片中大腸桿菌進(jìn)行檢驗(yàn)，探究哪種方法更適宜應(yīng)用在呋喃哇酮片的大腸桿菌的檢驗(yàn)中。

1 資料和方法

1.1 基本資料

備有呋喃哇酮片、不同孔徑的混合纖維素酯微孔濾膜、乳糖膽鹽培養(yǎng)液、含伊紅美藍(lán)瓊脂的大腸桿菌生化反應(yīng)培養(yǎng)基以及大腸桿菌使用CMCC(B)44102。

1.2 方法

提取適量的呋喃哇酮片和大腸桿菌CMCC(B),制成研究所需要的供試液備用，供試液中含有大腸桿菌和呋喃哇酮成分。方法一：采用一次離心法，即采用轉(zhuǎn)速3000r/ min對供試液進(jìn)行0.5h 的離心操作,提取適量的上清液。在乳糖膽鹽培養(yǎng)液中置入上清液，進(jìn)行36℃±1℃、48h±2h的培養(yǎng)，對有無渾濁、產(chǎn)氣情況出現(xiàn)進(jìn)行嚴(yán)密的觀察。在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上接種上清液實(shí)施平板分離檢驗(yàn)，完成36℃±1℃、18-24h 的培養(yǎng)后，對該培養(yǎng)基上是否長出菌落進(jìn)行嚴(yán)密的觀察。方法二：采用二次離心法，即采用轉(zhuǎn)速3000r/min 對供試液進(jìn)行0.5h 的離心操作,提取足夠的上清液，以轉(zhuǎn)速3000r/min 再次實(shí)施0.5h 的離心操作，提取適量的上清液。在乳糖膽鹽培養(yǎng)液中置入上清液，進(jìn)行36℃±1℃、48h±2h 的培養(yǎng)，對有無渾濁、產(chǎn)氣情況出現(xiàn)進(jìn)行嚴(yán)密的觀察。在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上接種適量的上清液實(shí)施平板分離檢驗(yàn)，完成36℃±1℃、18-24h 的培養(yǎng)后，對該培養(yǎng)基上是否長出菌落進(jìn)行嚴(yán)密的觀察。方法三：采用離心-濾膜法，即采用轉(zhuǎn)速3000r/ min 對供試液進(jìn)行0.5h 的離心操作,提取上清液通過0.45μm 混合纖維素酯微孔濾膜實(shí)施過濾,在乳糖膽鹽培養(yǎng)液中置入所得的溶液，進(jìn)行36℃±1℃、48h±2h 的培養(yǎng)，對有無渾濁、產(chǎn)氣情況出現(xiàn)進(jìn)行嚴(yán)密的觀察。在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上接種適量的所得溶液實(shí)施平板分離檢驗(yàn)，完成36℃±1℃、18-24h 的培養(yǎng)后，對該培養(yǎng)基上是否長出菌落進(jìn)行嚴(yán)密的觀察。方法四：采用離心-雙重濾膜法，即采用轉(zhuǎn)速3000r/min 對供試液進(jìn)行0.5h 的離心操作,提取上清液分別通過3.0μm 和0.45μm 孔徑的混合纖維素酯微孔濾膜實(shí)施過濾。在乳糖膽鹽培養(yǎng)液中置入所得的溶液，進(jìn)行36℃±1℃、48h±2h 的培養(yǎng)后，對有無渾濁、產(chǎn)氣情況出現(xiàn)進(jìn)行嚴(yán)密的觀察。在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上接種適量的所得溶液實(shí)施平板分離檢驗(yàn)，完成36℃±1℃、18-24h 的培養(yǎng)后，對該培養(yǎng)基上是否長出菌落進(jìn)行嚴(yán)密的觀察。

1.3 觀察指標(biāo)

以大腸桿菌的檢驗(yàn)結(jié)果作為觀察指標(biāo)。膽鹽乳糖培養(yǎng)液試驗(yàn)中完成培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)渾濁(+)、產(chǎn)氣情況(+)存在于液體中，則視為有大腸桿菌 (+/+)檢出,反之視為無大腸桿菌檢出 (+/-、-/+、-/-)。伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基試驗(yàn)中完成18-24h 的培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)金屬光澤的紫色菌落長在培養(yǎng)基上,則視為有大腸桿菌檢出(+),反之視為無大腸桿菌檢出(-)。

2 結(jié)果

一次離心法應(yīng)用在大腸桿菌檢驗(yàn)中的結(jié)果是乳糖膽鹽培養(yǎng)液稍微呈現(xiàn)出渾濁狀態(tài)，沒有產(chǎn)生氣體，伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基沒有長出菌落。二次離心法、離心-濾膜法應(yīng)用在大腸桿菌檢驗(yàn)中的結(jié)果是乳糖膽鹽培養(yǎng)液呈現(xiàn)出澄清狀態(tài)，沒有產(chǎn)生氣體,伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基沒有長出菌落、離心-雙重濾膜法應(yīng)用在大腸桿菌檢驗(yàn)中的結(jié)果是乳糖膽鹽培養(yǎng)液呈現(xiàn)出渾濁狀態(tài)，產(chǎn)生氣體,伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基中有顯著性的菌落長出。離心-雙重濾膜法檢出大腸桿菌，其他方法未檢出大腸桿菌。見表1。

表1 四類檢驗(yàn)大腸桿菌的方法對吠喃哇酮片大腸桿菌的檢驗(yàn)結(jié)果的對比

3 討論

大腸桿菌在人和溫血?jiǎng)游锏哪c道中存在，且數(shù)量多，隨著糞便排出體外，會(huì)對土壤、水源、食物、藥品等造成污染[3,4]。基于大腸桿菌是否存在于藥品中可以判定藥品是否被糞便所污染，一旦從藥品中檢出大腸桿菌，就意味著該藥品受到了糞便的污染，如果患者服用受到污染的飲品則有可能患上消化道傳染病[5,6]。故被看作糞便污染指南菌種的就包括大腸桿菌，檢驗(yàn)大腸桿菌成為口服藥物常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目之一[7,8]。為了探究哪種大腸桿菌檢驗(yàn)方法適用在呋喃哇酮片這類本身具有抑菌特性的抗菌藥物的大腸桿菌檢驗(yàn)中，進(jìn)行了四類檢驗(yàn)方法的對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一次離心法、二次離心法、離心-濾膜法的乳糖膽鹽培養(yǎng)液試驗(yàn)結(jié)果和伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果顯示無大腸桿菌檢出，雖然一次離心法的應(yīng)用顯示出乳糖膽鹽培養(yǎng)液有些許的渾濁，但這并不能意味著檢出大腸桿菌，這種渾濁情況的出現(xiàn)可能是因?yàn)殡x心不徹底。而離心-雙重濾膜法應(yīng)用在大腸桿菌檢驗(yàn)中的結(jié)果是乳糖膽鹽培養(yǎng)液呈現(xiàn)出渾濁狀態(tài)，產(chǎn)生氣體,伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基中有顯著性的菌落長出，視為檢出大腸桿菌。這種檢驗(yàn)方法之所以對大腸桿菌的靈敏度高是因?yàn)槠洳坏?jīng)過了離心操作還經(jīng)過了兩次濾膜過濾,在一定降低了呋喃哇酮的藥物濃度，使之低于有效抑菌濃度。

由上可見，不同于其他三種檢驗(yàn)方法，離心-雙重濾膜法應(yīng)用在大腸桿菌檢驗(yàn)中，其檢出大腸桿菌的概率更高一些，且具有操作簡便的優(yōu)勢，更適宜在呋喃哇酮這類抗菌藥物大腸桿菌的檢驗(yàn)中應(yīng)用。