管花肉蓯蓉多糖水提物的分離及免疫活性研究

艾拉旦·麥麥提艾力 李洋 姚軍 袁潔

摘 要 目的：分離管花肉蓯蓉多糖水提物，考察分離物的體外免疫活性。方法：采用AB-8大孔吸附樹脂法對(duì)管花肉蓯蓉多糖進(jìn)行脫色，以多糖保留率和多糖脫色率為指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，以吸附速率、脫色時(shí)間、上樣質(zhì)量濃度為因素，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化脫色工藝并驗(yàn)證。采用DEAE-650M離子交換柱層析柱對(duì)脫色后的管花肉蓯蓉多糖水提物進(jìn)行分離。采用CCK-8法檢測不用質(zhì)量濃度（6.25～100 μg/mL）分離前、后各種多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖率的影響，采用Griess法和酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測低、中、高質(zhì)量濃度（12.5、25、50 μg/mL）分離前、后各種多糖對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞一氧化氮（NO）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）釋放量的影響。結(jié)果：AB-8大孔吸附樹脂的最優(yōu)脫色工藝為吸附流速1.2 BV/h，脫色時(shí)間9 h，上樣質(zhì)量濃度25 mg/mL;3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的綜合評(píng)分分別為63.43%、63.29%、63.34%，平均值為63.35%（RSD=0.11%，n=3）。從管花肉蓯蓉多糖水提物中分離出1種中性多糖（CTZ）和5種酸性多糖（CT1、CT2、CT3、CT4、CT5），含量分別為299.2、168.0、123.2、121.6、54.4、11.2 mg/g。與對(duì)照組比較，6.25～100 μg/mL的CTZ（6.25 μg/mL除外）、CT2、CT4、CT5和6.25 μg/mL的CTC（即分離前的多糖）均可顯著增加RAW264.7細(xì)胞的增殖率（P<0.05），6.25～100 μg/mL的CT1、CT3和50 μg/mL的CTC均可顯著降低RAW264.7細(xì)胞的增殖率（P<0.05）。與LPS組比較，低、中、高質(zhì)量濃度CTC、CT2、CT3、CT5組和低質(zhì)量濃度CTZ組細(xì)胞的NO釋放量均顯著降低（P<0.05），高質(zhì)量濃度CT1、CT4組細(xì)胞的NO釋放量均顯著升高（P<0.05）;低、中、高質(zhì)量濃度各組細(xì)胞的IL-6（高質(zhì)量濃度CT1組和低質(zhì)量濃度CT5組除外）、TNF-α釋放量（中質(zhì)量濃度CT1組除外）均顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：本研究所優(yōu)化的大孔吸附樹脂脫色工藝穩(wěn)定、可行;管花肉蓯蓉多糖水提物中可分離出1種中性多糖、5種酸性多糖，其中酸性多糖CT2的免疫活性較強(qiáng)。

關(guān)鍵詞 管花肉蓯蓉多糖;脫色;分離;免疫活性

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To isolate the water extract of polysaccharide from Cistanche tubulosa，and to investigate their immunocompetence in vitro. METHODS： AB-8 macroporous adsorption resin was used to decolorize C. tubulosa polysaccharide. The decolorization process was optimized by orthogonal test with retention rate and decolorization rate of polysaccharide as comprehensive score， and using adsorption rate， decolorization time， sample concentration as factors. The verification tests were conducted. DEAE-650M ion exchange column was used to separate the water extract of decolorized C. tubulosa polysaccharide. CCK-8 assay was used to detect the effects of different concentration of polysaccharide （6.25-100 μg/mL） before and after isolation on the proliferation rate of mice macrophage RAW264.7. Griess method and ELISA assay were adopted to detect the effects of low， medium and high concentration of polysaccharide （12.5， 25， 50 μg/mL） on the release of NO， IL-6 and TNF-α in LPS-induced RAW264.7 cells. RESULTS： In the optimal decolorization process of AB-8 macroporous adsorption resin， the adsorption flow rate was 1.2 BV/h， the decolorization time was 9 h， and sample concentration was 25 mg/mL. The comprehensive scores of 3 times of verification tests were 63.43%， 63.29% and 63.34%， respectively， with an average of 63.35% （RSD=0.11%， n=3）. One neutral polysaccharide （CTZ） and 5 acid polysaccharides （CT1， CT2， CT3， CT4， CT5） were isolated from the polysaccharide of C. cistanche， the contents were 299.2， 168.0， 123.2， 121.6， 54.4， 11.2 mg/g. Compared with control group， 6.25-100 μg/mL CTZ （except for 6.25 μg/mL）， CT2， CT4， CT5 and 6.25 μg/mL CTC （the polysaccharide before seperation） could significantly increase the proliferation rate of RAW264.7 cells （P<0.05）， while 6.25-100 μg/mL CT1， CT3 and 50 μg/mL CTC could decrease te proliferation rate of RAW264.7 cells （P<0.05）. Compared with LPS group， the release of NO were decreased significantly in low， medium and high concentration groups of CTC， CT2， CT3 and CT5， CTZ low concentration group （P<0.05）， while were increased significantly in high concentration groups of CT1 and CT4 （P<0.05）. The release of IL-6 （except for CT1 high concentration group and CT5 low concentration group） and TNF-α （except for CT1 medium concentration group） were decreased significantly in low， medium and high concentration groups （P<0.05）. CONCLUSIONS： The optimized decolorization technology of macroporous adsorption resin is stable and feasible in the study. One neutral polysaccharide and 5 acidic polysaccharides can be isolated from water extract of C. tubulosa polysaccharides， among which CT2 polysaccharide has stronger anti-inflammatory ability.

KEYWORDS ? Cistanche tubulosa polysaccharide; Decolorization; Separation; Immunocompetence

管花肉蓯蓉為列當(dāng)科管花肉蓯蓉Cistanche tubulosa（Schenk）Wight的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖?，F(xiàn)代研究表明，管花肉蓯蓉含有苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜苷類、木脂素類、多糖類、生物堿類等多種生物活性物質(zhì)，具有壯陽、通便、保肝、抗衰老、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力及益智等功效[1-4]，可用于臨床治療腎陽不足、精血虧虛、陽痿不孕、腰膝酸軟、筋骨無力、腸燥便秘等癥[5]。

管花肉蓯蓉多糖水提物呈棕黃色，本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該水提物中除含管花肉蓯蓉多糖外，還包含水溶性色素、蛋白質(zhì)等非目標(biāo)成分，這給多糖的分離純化、生物活性研究等造成了很大的困難。傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑脫色處理會(huì)破壞粗提物中目標(biāo)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，降低后者的藥理活性，并引入對(duì)人體有害的成分[6]。大孔吸附樹脂是中藥提取物中多糖脫色的常用材料，是一種性價(jià)比較高的高分子吸附材料，其物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，利用其對(duì)色素成分的選擇吸附和篩分性能，可針對(duì)性地去除中藥提取物中的色素，加之其可通過酸洗堿洗的方式進(jìn)行再生，因而得以廣泛應(yīng)用[7]。本研究擬利用大孔吸附樹脂對(duì)管花肉蓯蓉多糖水提物進(jìn)行脫色處理，并采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)脫色條件進(jìn)行優(yōu)化;提取物經(jīng)脫色處理后，依據(jù)多糖所攜帶基團(tuán)性質(zhì)的不同，擬用離子交換柱層析的方法，進(jìn)一步分離管花肉蓯蓉多糖中的中性、酸性多糖組分。

已有研究表明，植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，是天然的免疫調(diào)節(jié)劑，可以激活補(bǔ)體系統(tǒng)和T/B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞等免疫細(xì)胞，同時(shí)亦可促進(jìn)多種細(xì)胞因子的釋放，并促進(jìn)抗體的生成等[8-11]。脂多糖（LPS）可激活巨噬細(xì)胞的炎癥信號(hào)通路，誘導(dǎo)一氧化氮（NO）和諸如白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)的合成及釋放，從而引發(fā)機(jī)體一系列的炎癥反應(yīng)[12]。本研究擬建立LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型，從管花肉蓯蓉多糖對(duì)巨噬細(xì)胞增殖、炎癥因子分泌和NO產(chǎn)生等方面的影響入手，初步評(píng)價(jià)其對(duì)機(jī)體免疫活性的影響，旨在為深入研究管花肉蓯蓉多糖抗炎活性物質(zhì)基礎(chǔ)以及開發(fā)其多糖資源提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）、Multiskan Go型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Herocell 180型CO2培養(yǎng)箱（上海潤度生物科技有限公司）、AB135-S型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、OSB-2100EYELA型油浴鍋（上海愛郎儀器有限公司）、N-1001EYELA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛郎儀器有限公司）、THZ-100型恒溫?fù)u床（上海一恒儀器有限公司）、3-18K型離心機(jī)（德國Sartorius AG公司）、IX71-12FL/PH型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

管花肉蓯蓉多糖水提物（批號(hào)20180201，每克多糖相當(dāng)于17.36 g管花肉蓯蓉）由新疆和田帝辰醫(yī)藥生物科技有限公司惠贈(zèng)，樣品于密封、陰涼、干燥處存放;蒽酮（批號(hào)20190120）購自上海科豐實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司;無水葡萄糖（分析純，批號(hào)：20181115）購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;DEAE-650M離子交換填料（粒徑40～90 μm）購自日本Tosoh公司;AB-8大孔吸附樹脂（粒徑3.3～1.25 mm）購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;胎牛血清（FBS，批號(hào)1966173C）購自美國Gibco公司;DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)AF29562465）、鏈霉素+青霉素雙抗（批號(hào)AB10166019）、胰蛋白酶（批號(hào)SH30042.01）均購自美國Hyclone公司;磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)2035126，pH 7.4）購自以色列BI公司;NO檢測試劑盒（Griess法）（批號(hào)011020200430）購自北京索萊寶科技有限公司;LPS購自美國Sigma公司;CCK-8細(xì)胞增殖毒性測定試劑盒（批號(hào)BJ05203090）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;IL-6（批號(hào)202012）、TNF-α（批號(hào)201922）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 細(xì)胞株

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 相關(guān)指標(biāo)的檢測

2.1.1 色素波長的選擇及多糖脫色率的計(jì)算 管花肉蓯蓉多糖水提物經(jīng)水適當(dāng)稀釋后，使用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行紫外-可見全波長掃描，結(jié)果未見最大吸收波長。因溶液呈現(xiàn)的顏色是溶液吸收光的互補(bǔ)色，管花肉蓯蓉多糖水提物脫色前后、稀釋前后均為黃棕色，可知溶液主要吸收藍(lán)色波段的可見光[13]。因此，選擇處于該波段吸光度較大的450 nm作為檢測波長，并按如下公式計(jì)算多糖脫色率：多糖脫色率（%）=（A1-A2）/A1×100%（式中，A1和A2分別為管花肉蓯蓉多糖水提物經(jīng)大孔吸附樹脂處理前、后在450 nm波長處的吸光度）。

2.1.2 多糖質(zhì)量濃度的測定及多糖保留率的計(jì)算 按2020年版《中國藥典》（一部）中靈芝多糖含量測定項(xiàng)下的硫酸-蒽酮法處理管花肉蓯蓉中多糖[14]：使用使用紫外-可見分光光度計(jì)于625 nm波長處測定吸光度（A），并根據(jù)回歸方程A=39.603c-0.077 1（R 2=0.999 8）計(jì)算管花肉蓯蓉多糖的質(zhì)量濃度[15]，并按如下公式計(jì)算多糖保留率：多糖保留率（%）=c2/c1×100%（式中，c1和c2分別為管花肉蓯蓉多糖水提物用大孔吸附樹脂處理前、后管花肉蓯蓉多糖的質(zhì)量濃度）。該方法的方法學(xué)考察結(jié)果均符合2020年版《中國藥典》（四部）的相關(guān)規(guī)定[16]。

2.2 吸附脫色實(shí)驗(yàn)

2.2.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 AB-8大孔吸附樹脂（類型據(jù)前期研究結(jié)果選擇）用95%乙醇浸泡24 h，倒去浮在水面的小顆粒樹脂后，用水清洗至澄清、無醇味，然后分別用5%鹽酸溶液和5%氫氧化鈉溶液浸泡24 h，用水清洗至中性，最后用水浸泡并封存，備用。

2.2.2 洗脫方法 取經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹脂1.0 g，置于錐形瓶中，加入質(zhì)量濃度為8 mg/mL的管花肉蓯蓉多糖溶液50 mL，搖床振搖3 h，抽濾，接流出液，濃縮，烘干，備用。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化 在參考文獻(xiàn)[17-19]和前期單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多糖脫色率、多糖保留率為指標(biāo)計(jì)算綜合評(píng)分（根據(jù)前期研究結(jié)果設(shè)置權(quán)重均為50%），選用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)大孔吸附樹脂脫色的洗脫流速（A，BV/h）、脫色時(shí)間（B，h）、上樣質(zhì)量濃度（C，mg/mL）進(jìn)行優(yōu)化，確定管花肉蓯蓉多糖的大孔吸附樹脂脫色最優(yōu)工藝條件。管花肉蓯蓉多糖大孔吸附樹脂脫色的正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

由表2的極差結(jié)果可知，各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響由高到低為C>A>B，說明上樣質(zhì)量濃度對(duì)大孔吸附樹脂脫色效果的影響最大，其次是洗脫流速和脫色時(shí)間。由表3的方差分析結(jié)果可知，上樣質(zhì)量濃度和洗脫流速對(duì)大孔吸附樹脂的脫色效果均有顯著影響，脫色時(shí)間的影響不顯著。根據(jù)上述正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，大孔吸附樹脂脫色的最優(yōu)參數(shù)組合為A2B1C3，即洗脫流速1.2 BV/h，脫色時(shí)間9 h，上樣質(zhì)量濃度25 mg/mL。

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為25 mg/mL的管花肉蓯蓉多糖溶液3份，分別上樣至填有大孔吸附樹脂的層析柱（100 cm×6 cm）中，分別吸附9 h后開始洗脫，洗脫流速為1.2 BV/h，接流出液，濃縮后檢測多糖脫色率、多糖保留率并計(jì)算綜合評(píng)分。結(jié)果，3次重復(fù)試驗(yàn)綜合評(píng)分分別為63.43%、63.29%、63.34%，平均值為63.35%（RSD=0.11%，n=3），表明此脫色方法可行。

2.3 管花肉蓯蓉粗多糖的初步分離

2.3.1 DEAE-650M離子交換填料的預(yù)處理 先把DEAE-650M離子交換填料倒入較大的容器內(nèi)，加入3～4倍體積的水浸泡，等填料大部分沉底后棄去上清液，再加入水重復(fù)以上操作3～5次，備用。

2.3.2 粗多糖分離 將層析柱（80 cm×4 cm）垂直固定在層析架上，裝上經(jīng)預(yù)處理的DEAE-650M離子交換填料，將已脫色的管花肉蓯蓉多糖（記為CTC）溶液250 mL，以25 mg/mL的質(zhì)量濃度上樣至層析柱中，分別用水和系列濃度的氯化鈉溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）依次進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。其中，水洗脫下來的成分為中性多糖，不同濃度的氯化鈉溶液洗脫得到的為酸性多糖。將收集的洗脫液按洗脫曲線合并，經(jīng)濃縮、透析后，凍干得到多個(gè)多糖組分。結(jié)果，分離出1種中性多糖，記為CTZ，含量為229.2 mg/g;0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L氯化鈉溶液洗脫的各酸性多糖分別命名為CT-1、CT-2、CT-3、CT-4、CT-5，含量分別為168.0、123.2、121.6、54.4、11.2 mg/g。

2.4 管花肉蓯蓉多糖對(duì)巨噬細(xì)胞免疫活性的影響

2.4.1 細(xì)胞增殖率的檢測 采用CCK-8法進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)分為空白組[只含完全培養(yǎng)基（含有10%FBS、100 U/mL的鏈霉素和100 U/mL青霉素，下同）]、對(duì)照組（含細(xì)胞與完全培養(yǎng)基）和不同質(zhì)量濃度的CTC、CTZ、CT1、CT2、CT3、CT4、CT5組（含細(xì)胞、完全培養(yǎng)基和6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的管花肉蓯蓉多糖、中性多糖和各酸性多糖，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置質(zhì)量濃度），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，以1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，加入完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，并按1×105 mL-1接種至96孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱（下同）內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，每孔吸棄上清液，按上述分組加入完全培養(yǎng)基或含相應(yīng)藥液的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，室溫孵育1 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各孔的吸光度（A）值并計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值）/（對(duì)照組A值-空白組A值）×100%。采用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。管花肉蓯蓉多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響見表4。

由表4可知，與對(duì)照組比較，6.25～100 μg/mL CTZ（6.25 μg/mL除外）、CT2、CT4、CT5組和6.25 μg/mL CTC組細(xì)胞的增殖率均顯著增加（P<0.05），6.25～100 μg/mL CT1、CT3組和50 μg/mL CTC組細(xì)胞的增殖率均顯著降低（P<0.05）。

按照毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞增殖率≥100%為0級(jí)，75%～99%為1級(jí)，50%～74%為2級(jí)，25%～49%為3級(jí)，1%～24%為4級(jí)，<1%為5級(jí)，其中0和1級(jí)被認(rèn)為對(duì)細(xì)胞無毒性[13]。結(jié)果，當(dāng)CT1、CT3質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，毒性可達(dá)到2級(jí)，因此選擇12.5、25、50 μg/mL作為后續(xù)研究的低、中、高質(zhì)量濃度。

2.4.2 NO釋放量的檢測 采用Griess法進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（含細(xì)胞與完全培養(yǎng)基）、LPS組（含細(xì)胞、完全培養(yǎng)基和終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的LPS）和低、中、高質(zhì)量濃度的CTC、CTZ、CT1、CT2、CT3、CT4、CT5組[含細(xì)胞、完全培養(yǎng)基、終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的LPS和低、中、高質(zhì)量濃度（12.5、25、50 μg/mL）的管花肉蓯蓉多糖、中性多糖和各酸性多糖]，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，按“2.4.1”項(xiàng)下方法消化、重懸后，按1×105 mL-1接種至48孔板中，每孔300 μL，同法培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，吸棄去上清液，按上述分組加入完全培養(yǎng)基或含相應(yīng)藥液的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞上清液，以1 000 r/min離心15 min，取上清液，使用酶標(biāo)儀在540 nm波長處檢測各孔的A值，按NO檢測試劑盒說明書方法計(jì)算NO釋放量，并按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表5。

由表5可知，與對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞的NO釋放量顯著升高（P<0.05）。與LPS組比較，低、中、高質(zhì)量濃度CTC、CTZ（中、高質(zhì)量濃度除外）、CT2、CT3、CT5組細(xì)胞的NO釋放量均顯著降低（P<0.05）;此外，高質(zhì)量濃度CT1、CT4組細(xì)胞的NO釋放量均顯著升高（P<0.05）。

2.4.3 IL-6、TNF-α釋放量的檢測 按ELISA法進(jìn)行檢測。取對(duì)數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，按“2.4.1”項(xiàng)下方法消化、重懸后，按1×105 mL-1接種至48孔板中，每孔500 μL，同法培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，吸棄上清液，按“2.4.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組、加藥、培養(yǎng)，收集細(xì)胞上清液，以1 000 r/min離心15 min，收集上清液，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各孔的A值，按ELISA試劑盒說明書方法計(jì)算IL-6、TNF-α釋放量，并按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表5。

由表5可知，與對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞的IL-6、TNF-α釋放量均顯著升高（P<0.05）。與LPS組比較，除高質(zhì)量濃度CT1組細(xì)胞的IL-6釋放量顯著升高（P<0.05）、中質(zhì)量濃度CT1組細(xì)胞的TNF-α和低質(zhì)量濃度CT5組細(xì)胞的IL-6釋放量均無顯著變化（P>0.05）外，其余各組細(xì)胞的IL-6、TNF-α釋放量均顯著降低（P<0.05）。

3 討論

前期研究發(fā)現(xiàn)，水提管花肉蓯蓉中多糖時(shí)會(huì)有較多水溶性物質(zhì)一同溶出，影響管花肉蓯蓉多糖純度，因此進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分離純化，可為多糖物質(zhì)基礎(chǔ)及生物活性研究奠定基礎(chǔ)。大孔吸附樹脂法是常用的脫色方法[17-19]。由于目前還不清楚管花肉蓯蓉中色素成分的極性，所以課題組前期通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，從不同極性的大孔吸附樹脂中篩選了最適大孔吸附樹脂AB-8，該樹脂對(duì)非目標(biāo)成分具有較好的吸附能力，又對(duì)管花肉蓯蓉多糖具有較好保留能力。為達(dá)到更好的脫色效果，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)脫色工藝（洗脫流速、脫色時(shí)間、上樣質(zhì)量濃度）進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果，管花肉蓯蓉多糖的最優(yōu)脫色方法為洗脫流速1.2 BV/h，脫色時(shí)間9 h，上樣質(zhì)量濃度25 mg/mL。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本脫色方法可行。

天然多糖的純度及種類是影響其活性的重要因素，因此多糖分離純化方法的相關(guān)研究仍然是天然活性多糖研究工作的重點(diǎn)。多糖分離常用的方法有沉淀法、凝膠色譜法、陰離子交換色譜法、大孔樹脂柱色譜法和超濾法等[20]。多糖因單糖組成不同，其所帶電荷性質(zhì)也會(huì)有一定的差異，可被分為中性多糖和酸性多糖。中性多糖是由2種以上不含有機(jī)酸的不同糖基單體構(gòu)成的聚合物;而酸性多糖在組成成分和結(jié)構(gòu)上要比中性多糖復(fù)雜，除含有2種以上的糖基單體外，還含有糖醛酸單體[21]。陰離子交換柱層析法是利用多糖所帶電荷的差異將中性多糖與酸性多糖進(jìn)行分離[22]。為此，本研究采用DEAE-650M離子交換柱層析柱對(duì)管花肉蓯蓉多糖進(jìn)行分離，共分離出1種中性多糖、5種酸性多糖。

巨噬細(xì)胞是免疫活性細(xì)胞，可通過吞噬和殺傷病原微生物，從而起到調(diào)節(jié)免疫的作用。已有研究表明，當(dāng)人體受到病理或機(jī)械損傷刺激時(shí)，藥物干預(yù)可激活巨噬細(xì)胞使LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)，進(jìn)而抑制NO的產(chǎn)生和IL-6、TNF-α等系列炎癥細(xì)胞因子的分泌，從而保護(hù)宿主免受病原體的侵害[23]。為此，本研究檢測了各種管花肉蓯蓉多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響，以及對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO、IL-6、TNF-α的影響。結(jié)果，在12.5、25、50 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，既對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖起一定的促進(jìn)作用，又可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO、IL-6、TNF-α的管花肉蓯蓉多糖為CT2。相關(guān)研究顯示，多糖的單糖組成和分子量會(huì)影響其免疫調(diào)節(jié)活性，半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖以及葡萄糖等單糖與多糖的免疫活性成正相關(guān)[24]，分子量較大的多糖可能含有較多的高度重復(fù)結(jié)構(gòu)，可以多向性交叉連接質(zhì)膜表面受體，特異性增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)效果[25]。因此本研究中的酸性多糖CT2的單糖組成中可能含有特殊的單糖或含多個(gè)與免疫活性正相關(guān)的單糖，且分子量可能較中性多糖和其他酸性多糖大，但有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

綜上所述，本研究所優(yōu)化的大孔吸附樹脂脫色工藝穩(wěn)定、可行;可從管花肉蓯蓉多糖水提物中分離出1種中性多糖、5種酸性多糖，其中酸性多糖CT2的免疫活性較強(qiáng)。本研究可為管花肉蓯蓉多糖的開發(fā)利用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2021-01-24 修回日期：2021-05-31）

（編輯：鄒麗娟）