PMP柱前衍生化-HPLC法分析不同生長年限黃芪中6種單糖的含量

余亦婷 皮文霞 謝輝 曹麗娟 李西文 李霞 陸兔林 嚴(yán)國俊

摘 要 目的：分析并比較不同生長年限黃芪中6種單糖的含量。方法：取來自3個(gè)產(chǎn)地的2～4年生黃芪藥材，經(jīng)水提醇沉、Sevage除蛋白后制得黃芪多糖;將上述多糖經(jīng)三氟乙酸水解和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化后，采用高效液相色譜法測(cè)定其中甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等6種單糖的含量。以Symmetry C18為色譜柱，以磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）-乙腈（84 ∶ 16，V/V）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長為245 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為20 ?L。結(jié)果：黃芪多糖中甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的含量分別為0.50～0.94、0.76～1.60、3.35～7.86、87.33～275.77、1.95～8.96、2.35～14.04 mg/g，2、3、4年生黃芪中上述單糖的總含量分別為98.26～139.92、173.81～295.71、122.37～182.41 mg/g。3年生黃芪中葡萄糖的含量與2、4年生黃芪有顯著差異（162.71～275.77 mg/g vs. 87.33～107.70、111.54～167.26 mg/g，P<0.05）。結(jié)論：2、3、4年生黃芪中均檢出上述6種單糖，其中葡萄糖含量最高，且3年生黃芪中葡萄糖含量顯著高于2、4年生黃芪。

關(guān)鍵詞 黃芪;多糖;單糖;柱前衍生化;高效液相色譜法

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To analyze and compare the contents of 6 kinds of monosaccharide in Astragalus membranaceus from different growth years. METHODS： 2-4 years old A. membranaceus from three areas were extracted with water extraction and alcohol precipitation， Sevage deproteinization to obtain A. membranaceus polysaccharide. The samples were firstly hydrolyzed with trifluoroacetic acid （TFA） and then derivatized by 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone（PMP）. HPLC analysis was adopted to determine the contents of 6 kinds of monosaccharide as mannose， rhamnose， galacturonic acid， glucose， galactose， arabinose. The determination was performed on Symmetry C18 column with phosphate buffer solution （pH 6.8）-acetonitrile （84 ∶ 16， V/V） as mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 245 nm， and column temperature was 35 ℃. The sample size was 20 ?L. RESULTS： The contents of mannose， rhamnose， galacturonic acid， glucose， galactose and arabinose were 0.50-0.94， 0.76-1.60， 3.35-7.86， 87.33-275.77， 1.95-8.96， 2.35-14.04 mg/g， respectively. Total contents of monosaccharide from 2， 3， 4 years old A. membranaceus were 98.26-139.92， 173.81-295.71， 122.37-182.41 mg/g， respectively. There was significant difference in the contents of glucose between 3 old years A. membranaceus and 2， 4 old years A. membranaceus （162.71-275.77 mg/g vs. 87.33-107.70， 111.54-167.26 mg/g， P<0.05）. CONCLUSIONS： Above 6 monosaccharides are detected in 2， 3， 4 years old A. membranaceus， among which the content of glucose is the highest. The content of glucose in 3 years old A. membranaceus is higher than that in 2 and 4 years old A. membranaceus.

KEYWORDS ? Astragalus membranaceus;Polysaccharides;Monosaccharides;Pre-column derivatization;HPLC

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根[1]，主產(chǎn)于我國山西、內(nèi)蒙古等地[2]。作為常用傳統(tǒng)中藥之一，黃芪味甘、性平，具有補(bǔ)氣固表、利水生津、托毒排膿、斂瘡生肌等功效，臨床上主要用于治療氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、久瀉脫肛、血虛萎黃、內(nèi)熱消渴等癥[1，3]?，F(xiàn)有研究指出，黃芪具有調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)心血管與神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤、護(hù)肝等藥理作用，其主要化學(xué)成分包括黃酮類、皂苷類、多糖類化合物[4-5]。

作為大宗藥材之一，黃芪在臨床上使用較廣，已有研究表明不同生長年限黃芪藥材的成分含量存在較大差異，其中黃酮類和皂苷類成分的含量隨生長年限的延長而逐年升高，而多糖類成分的含量則變化趨勢(shì)不一[6-9]。黃芪藥材中的黃芪多糖是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、抑制人肝癌細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)免疫等作用[10-13]。由于非專屬且可控性不強(qiáng)，黃芪多糖未能作為質(zhì)控指標(biāo)以評(píng)價(jià)黃芪種質(zhì)資源[14]。多糖的生物活性與其單糖組成密切相關(guān)，且單糖組成及其含量測(cè)定是進(jìn)行多糖質(zhì)量控制的重要依據(jù)[15]。近年來對(duì)黃芪多糖的探索研究也成為了醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)之一。目前，研究者多利用紫外分光光度法測(cè)定總多糖含量，并以此作為藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)的手段，然而總多糖含量缺乏特異性，故2020年版《中國藥典》（一部）并未收載黃芪多糖的相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[16]。為此，本研究對(duì)不同生長年限黃芪藥材中的黃芪多糖進(jìn)行水解，并對(duì)其進(jìn)行柱前衍生化處理;再基于文獻(xiàn)[15，17-20]的研究結(jié)果，采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)黃芪藥材中甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等6種單糖的含量進(jìn)行測(cè)定，考察黃芪藥材中這6種單糖含量隨生長年限變化的規(guī)律，旨在為不同生長年限黃芪藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Waters e2695型HPLC儀及配套的四元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器和Empower 3工作站（美國Waters公司），RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），HWS-24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），BSA-124S型分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），X-30R型高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

無水葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖對(duì)照品（批號(hào)分別為YG8510、YR8080、YG8010、YG8420、YA8500，HPLC均大于98%）均購自南京翼飛雪生物科技有限公司;半乳糖醛酸對(duì)照品（批號(hào)B21894，HPLC大于98%）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，分析純）均購自上海源葉生物科技有限公司;三氟乙酸（TFA，分析純）購自上海麥克林生化科技有限公司;氫氧化鈉（NaOH，批號(hào)20181113，分析純）、三氯甲烷（批號(hào)20191216，分析純）、正丁醇（批號(hào)20210119，分析純）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈（色譜純）購自德國Merck公司;其余試劑均為分析純，水為超純水。

9批黃芪藥材分別產(chǎn)自我國山西、甘肅、內(nèi)蒙古等地，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陸兔林教授鑒定為蒙古黃芪A. membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根，其來源信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪多糖的提取

稱取黃芪藥材約20 g，加10倍量（mL/g，下同）水，于100 ℃下提取2 h，濾過;藥渣加5倍量水同法提取30 min，濾過;合并濾液濃縮至50 mL，再加入Sevage試劑（氯仿-正丁醇=4 ∶ 1，V/V）10 mL以除去蛋白質(zhì)（下層）。取上清液，以8 000 r/min離心10 min，除去不溶物，再加無水乙醇至總體積的90%，靜置12 h，以8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，收集沉淀并置于45 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥，即得黃芪多糖，得率見表2。

2.2 黃芪多糖的水解

稱取“2.1”項(xiàng)所得黃芪多糖約0.25 g，精密稱定，用水定容于5 mL量瓶中，搖勻，制成黃芪多糖供試液。量取上述黃芪多糖供試液1 mL，加入2 mol/L的TFA溶液2 mL，封口后于110 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)水解6 h，取出，放冷，水浴蒸干，殘?jiān)尤爰状? mL，攪拌，蒸干以去除TFA，共重復(fù)3次，殘?jiān)铀芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，用水定容，搖勻，即得黃芪多糖水解溶液。

2.3 單糖對(duì)照品的衍生化

分別精密稱取甘露糖對(duì)照品2.45 mg、鼠李糖對(duì)照品2.45 mg、半乳糖醛酸對(duì)照品2.05 mg、無水葡萄糖對(duì)照品260.15 mg、半乳糖對(duì)照品2.10 mg和阿拉伯糖2.15 mg，分別用水溶解后定容至2 mL量瓶中，充分搖勻，得各成分單一對(duì)照品溶液。量取上述單一對(duì)照品溶液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加水定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。分別量取該混合對(duì)照品溶液100 μL、0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液50 μL、0.3 mol/L的NaOH溶液50 μL，搖勻，于70 ℃水浴下反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，加入0.3 mol/L的鹽酸（HCl）溶液50 μL進(jìn)行中和，再加入氯仿1 mL進(jìn)行萃取，以10 000 r/min離心10 min，棄去有機(jī)層，共重復(fù)萃取3次，得上層水相溶液，經(jīng)0.22 ?m微孔濾膜濾過后，取續(xù)濾液，備用。

2.4 黃芪多糖水解樣品的衍生化

精密吸取“2.2”項(xiàng)下黃芪多糖水解溶液400 μL、0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液200 μL、0.3 mol/L的NaOH溶液200 μL，混勻，于70 ℃水浴下反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，加入0.3 mol/L的HCl溶液200 μL進(jìn)行中和，再加入氯仿400 μL進(jìn)行萃取，以10 000 r/min離心10 min，棄去有機(jī)層，共重復(fù)萃取3次，得上層水相溶液，經(jīng)0.22 ?m微孔濾膜濾過后，取續(xù)濾液，備用。

2.5 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）-乙腈（84 ∶ 16，V/V）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長為245 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為20 ?L。

取衍生化后的2、3、4年生黃芪藥材的多糖水解溶液和混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液（水），按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，不同生長年限黃芪藥材中多糖的色譜圖與混合對(duì)照品相似，各單糖成分的分離度良好，理論板數(shù)均大于2 500，陰性對(duì)照對(duì)單糖的測(cè)定無干擾，詳見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.3”項(xiàng)下甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖單一對(duì)照品溶液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加水定容，搖勻。分別吸取上述混合溶液800、400、200、100、80、40、20 ?L，置于4 mL離心管中，加水稀釋至500 ?L，置于安瓿瓶中，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理（衍生化試劑加入量等比例增加，下同），制備成系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以6種單糖的質(zhì)量濃度（x，?g/mL）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析。結(jié)果，甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖在各自檢測(cè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系均良好（R 2均大于0.999 0），詳見表3。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取衍生化后的黃芪多糖水解溶液（編號(hào)H-01），分別在室溫下放置0、4、8、12、16、24 h時(shí)按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為1.37%、1.24%、0.95%、1.77%、1.12%、1.62%（n=6），表明衍生化后的黃芪多糖水解溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一編號(hào)（編號(hào)H-01）黃芪藥材樣品共6份，依次按“2.1”“2.2”“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并代入回歸方程計(jì)算單糖含量。結(jié)果，樣品中甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖含量的RSD分別為2.13%、1.96%、2.38%、1.64%、1.99%、1.82%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下已知含量的供試品溶液（編號(hào)H-01）共6份，每份1 mL，每份加入各單糖對(duì)照品溶液（取“2.3”項(xiàng)下各單糖單一對(duì)照品500 μL，分別定容至10 mL量瓶中，即得）1 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理后，再按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并代入回歸方程計(jì)算含量，再計(jì)算加樣回收率和RSD值。結(jié)果，樣品中甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的平均加樣回收率分別為96.65%、99.56%、95.92%、101.48%、93.87%、99.80%，RSD分別為1.85%、1.12%、1.05%、0.95%、0.83%、0.44%（n=6），表明本方法準(zhǔn)確度好。

2.10 精密度試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下衍生化后的單糖混合對(duì)照品溶液適量，按“2.5”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為1.67%、1.08%、1.29%、1.81%、1.42%、1.92%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.11 黃芪多糖中單糖含量的測(cè)定

分別稱取9批黃芪藥材約20 g，依次按“2.1”“2.2”“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并代入回歸方程計(jì)算單糖含量，結(jié)果見表4。

由表4可以看出，黃芪多糖中各單糖的含量為0.50～275.77 mg/g;各批黃芪藥材中黃芪多糖均含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等6種單糖，其中葡萄糖含量最高。采用Excel 2016軟件對(duì)2、3、4年生黃芪藥材中各單糖含量進(jìn)行兩兩t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)僅3年生黃芪藥材中葡萄糖含量顯著高于2、4年生黃芪（P<0.05），其他單糖含量均無顯著差異（P>0.05）。同時(shí)，3個(gè)產(chǎn)地黃芪藥材中黃芪多糖含量不一致，其中山西省產(chǎn)含量最高。

3 討論

本研究采用水提醇沉法提取了黃芪多糖，并建立了測(cè)定其中6種單糖含量的PMP柱前衍生化-HPLC法。該方法的靈敏度高、分離效果好，線性范圍寬，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率良好，操作簡便，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于黃芪藥材中多糖的單糖定量測(cè)定，為藥材中多糖的組成研究提供了參考。

在流動(dòng)相比例的選擇中，本課題組前期考察了不同流動(dòng)相比例[磷酸鹽緩沖液-乙腈（85 ∶ 15、84 ∶ 16、83 ∶ 17，82 ∶ 18，V/V）]對(duì)單糖測(cè)定色譜峰分離效果的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)乙腈與磷酸鹽緩沖液的體積比為16∶84時(shí)，各單糖成分的分離效果較好，且整體保留時(shí)間較為適中，基線相對(duì)平穩(wěn)且峰形良好。故綜合考慮，本研究最終選擇磷酸鹽緩沖液-乙腈（84 ∶ 16，V/V）為流動(dòng)相。

本課題組比較了各單糖在 Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）、Hedera ODS-2 C18（200 mm×4.6 mm，5 ?m）兩種不同類型色譜柱上的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，短柱上各單糖未能實(shí)現(xiàn)基線分離，峰面積小;長柱基線相對(duì)平穩(wěn)，各主要峰之間能夠基本實(shí)現(xiàn)基線分離，且峰形良好，可見長柱的分離效果比短柱好，故選擇長柱對(duì)單糖進(jìn)行定量分析。

生長年限是影響中藥材質(zhì)量的重要因素[7]。本研究以來自于山西、甘肅、內(nèi)蒙古等3個(gè)產(chǎn)地不同生長年限的黃芪藥材為對(duì)象，采用PMP柱前衍生化-HPLC法在上述黃芪藥材中均檢出了甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，其中葡萄糖含量最高?？梢姡瑔翁堑暮亢徒M成比例有一定差異，說明藥材的生長年限對(duì)黃芪多糖的單糖組成有一定影響。就含量最高的葡萄糖而言，3年生黃芪藥材中葡萄糖含量均顯著高于2、4年生黃芪，推測(cè)原因可能是由于藥材產(chǎn)地的土壤、氣候等因素以及不同生長年限的影響導(dǎo)致藥材質(zhì)量發(fā)生變化。至于不同生長年限的黃芪多糖的藥理活性是否存在差異，有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2021-01-06 修回日期：2021-05-06）

（編輯：鄒麗娟）