牛蛙致病性陰溝腸桿菌的分離、鑒定和藥敏分析

劉琦濤，黃志藝，孫延杰，馬曉丹，楊培奎

（韓山師范學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，廣東 潮州 521041）

牛蛙（Rana catesbiana）屬于兩棲綱（Amphibia）、無尾目（Anura）、蛙科（Ranidae），原產(chǎn)于北美洲和墨西哥等地，是各地食用蛙中的主要養(yǎng)殖種類［1］.自上世紀(jì)90年代大力推廣牛蛙養(yǎng)殖以來，經(jīng)過多年的發(fā)展，牛蛙的養(yǎng)殖基本覆蓋全國各地，據(jù)統(tǒng)計，早在2013年我國牛蛙的養(yǎng)殖年產(chǎn)量已超過15萬噸［2］.

隨著養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度的不斷增大，以及養(yǎng)殖技術(shù)依舊粗放而綠色健康餌料供不應(yīng)求等問題日益突出，牛蛙養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，病害頻發(fā).其中，富營養(yǎng)化廢水的排放更成為多地禁止牛蛙養(yǎng)殖的重要原因之一，廢水中的病原微生物也是導(dǎo)致近年來牛蛙病害頻發(fā)的重要原因.為了盡快明確養(yǎng)殖環(huán)境導(dǎo)致牛蛙病害頻發(fā)的病原微生物以及尋找防治措施，本研究運用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)方法，從牛蛙養(yǎng)殖場的淤泥中分離細(xì)菌，結(jié)合理化特性以及16 S rRNA 擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，鑒定病原.同時，對分離細(xì)菌的耐藥性以及致病力進(jìn)行分析，以期為牛蛙養(yǎng)殖過程中環(huán)境致病菌的科學(xué)防治提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料來源

池塘底泥采自廣東省汕頭市澄海區(qū)鹽鴻鎮(zhèn)牛蛙養(yǎng)殖場的池塘底部；成體幼蛙購自同一地區(qū)的種苗繁育基地，開展實驗前在實驗室暫養(yǎng)5-7天.

1.1.2 主要試劑和儀器

腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管、藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司；2×Taq PCR StarMix、瓊脂糖，北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；細(xì)菌通用引物27F 和1492R，由華大基因科技有限公司合成.SHP-150型生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；博日LifeECO基因擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司；Gel DOCTMXR+凝膠成像系統(tǒng)、PowerPac basic電泳儀，美國Bio-Rad公司；DYCP-31E型水平電泳槽，北京六一儀器廠.

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10 g，酵母膏10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，調(diào)pH 值至7.2，隨后在121 ℃濕熱滅菌20 min［3］.

1.2 實驗方法

1.2.1 病原菌的分離與純化

將采集的牛蛙池塘底泥，在無菌條件下利用0.7%的生理鹽水進(jìn)行一系列稀釋后，取100 μL稀釋液均勻涂布于普通瓊脂平板，28 ℃，培養(yǎng)24 h.挑選形態(tài)特征相似的優(yōu)勢菌落，通過2-3代的劃線分離純化，獲得一株優(yōu)勢的純培養(yǎng)細(xì)菌S15，4 ℃保存待用.

1.2.2 病原菌的形態(tài)觀察和生理生化鑒定

純化的菌株S15經(jīng)恒溫?fù)u床振蕩活化之后，采用劃線培養(yǎng)的方法將其接種于制備好的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h左右，繼而挑取單菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，并在恒溫振蕩搖床28 ℃，160 rpm/min，培養(yǎng)24 h，隨后收集菌體并用0.7%生理鹽水制成菌懸液，按照常規(guī)方法進(jìn)行革蘭氏染色、生理生化鑒定.生理生化鑒定采用杭州微生物試劑有限公司的腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定試劑盒，并按照相應(yīng)的操作進(jìn)行.

1.2.3 細(xì)菌致病性試驗

將S15接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h后收集菌體，用0.7%的無菌生理鹽水制成濃度為1×109CFU/mL 的菌懸液.采用腹腔注射的方法進(jìn)行感染實驗，其中實驗組每只牛蛙注射100 μL菌懸液，對照組注射同等劑量的無菌生理鹽水.注射之后的牛蛙放入塑料桶中暫養(yǎng)，隨后每隔24 h觀察并記錄一次牛蛙的死亡情況，實驗為期8天.

1.2.4 病原菌16S rRNA基因擴(kuò)增及其序列分析

利用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R （5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′） 對 菌 株S15 基 因 組DNA 進(jìn)行16S rRNA 基因序列的擴(kuò)增.16S rRNA 基因PCR 反應(yīng)體系（10 μL）：2×Taq Master Mix（Dye）5 μL，上、下游引物（10μmol/L）各1 μL，模板1 μL，ddH2O 2 μL；PCR 反應(yīng)條件：96 ℃3 min；96 ℃30 s，55 ℃1 min，72 ℃2 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.隨后，取2 μL 的PCR 產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，將單一且符合目的大小的PCR產(chǎn)物送廣州華大基因科技有限公司完成測序.

圖1 菌株S15的16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2 結(jié)果

2.1 病原菌的形態(tài)特征

經(jīng)革蘭氏染色結(jié)果顯示，分離得到的S15菌株為革蘭氏陰性短桿菌（圖2），在營養(yǎng)肉湯里28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，菌液呈渾濁并有少量菌體沉淀.經(jīng)測試，病原菌生長條件結(jié)果顯示，其最適生長溫度為28 ℃.

圖2 細(xì)菌革蘭氏染色圖

將所獲得的16S rRNA基因序列上傳至NC?BI 數(shù)據(jù)庫，并進(jìn)行BLAST 進(jìn)行序列相似性比對，選取與所測序列同源性高的已知菌株的16S rRNA 基因序列.采用MEGA7.0 軟件，Neighbor-Joining法進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，通過自舉分析進(jìn)行信度檢測，自舉數(shù)集1 000次［4］.

1.2.5 抗生素敏感性試驗

以紙片法對分離純化的S15 菌株進(jìn)行抗生素藥物敏感性實驗.取0.1 mL 稀釋至1.0×10 CFU/mL 的菌懸液涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，貼上購自杭州微生物試劑有限公司的藥敏紙片，28 ℃培養(yǎng)24 h 后，測定其抑菌圈直徑，每種藥物平行重復(fù)三次.

2.2 病原菌的生化特性

分離菌株S15 的生理生化分析結(jié)果表明：山梨醇、棉子糖、動力瓊脂、枸櫞酸鹽反應(yīng)、鳥氨酸脫羧酶試均為陽性；靛基質(zhì)、甲基紅、硫化氫、尿素、賴氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氫酶等均為陰性.具體供試菌株以及參照菌株NTH01［5］和E.cloacae［6-7］主要生理生化特征如表1所示.

表1 S15菌株生理生化特性分析

2.3 人工感染結(jié)果

以每只牛蛙腹腔注射100 μL 濃度為1×109CFU/mL 的菌懸液進(jìn)行人工感染.結(jié)果如圖3 所示，實驗組在注射1 天之后即出現(xiàn)個體死亡，至第五天，累計死亡率超過41%，之后數(shù)天死亡率趨于穩(wěn)定；對照組前四天致死率為0，第五天才出現(xiàn)死亡個體，說明該菌株對牛蛙具有一定的致病性.

圖3 致病菌S15的牛蛙致死率分析

2.4 16S rRNA 基因序列分析及生物進(jìn)化樹構(gòu)建

PCR 擴(kuò)增菌株S15 的16S rRNA 基因片段長度為1 418 bp，將測定的16S rRNA 基因序列與GenBank 中的參考序列進(jìn)行比對，找出相關(guān)序列，利用生物學(xué)聚類軟件MEGA 7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建（圖4）.從結(jié)果可知，菌株S15 與陰溝腸桿菌同源性最高，達(dá)到99%，而與其他腸桿菌等相距較遠(yuǎn).綜合細(xì)菌生理生化特性以及16S rRNA基因序列分析結(jié)果，推斷出該分離菌株為陰溝腸桿菌（E.cloacae）

圖4 菌株S15及其相關(guān)菌株的16S rRNA基因鄰位連接法系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 抗生素敏感性試驗結(jié)果

選取三十種抗生素，采用常規(guī)紙片法對分離菌進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果如表2 所示，其中S15 對頭孢曲松、諾氟沙星、環(huán)丙沙星等抗生素高度敏感；對卡那霉素K、哌拉西林PIP、多粘霉素、新霉素N、米諾環(huán)素、頭孢他定等抗生素中度敏感；其余抗生素S15菌株則表現(xiàn)為耐藥性.

表2 抗生素敏感試驗結(jié)果（單位：mm）

3 討論

本研究旨在分離、鑒定牛蛙養(yǎng)殖環(huán)境中對牛蛙具有致病性的病原微生物，并篩選出合適的抗菌藥物.為此，本實驗從牛蛙養(yǎng)殖場的淤泥中分離得到一株優(yōu)勢菌株S15，經(jīng)人工感染實驗證實該菌株對牛蛙具有一定的致病性.形態(tài)性觀察和生理生化特性分析以及16S rRNA基因分析表明該菌株與陰溝腸桿菌（E.cloacae）的同源性達(dá)到99%，因此S15為牛蛙養(yǎng)殖環(huán)境中對牛蛙具有一定致病性的陰溝腸桿菌（E.cloacae）.

作為一種常見腸道致病菌，陰溝腸桿菌在自然界中廣泛存在.在人機(jī)體抵抗力下降時，可引起呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、傷口及敗血癥感染［8］.同時有研究表明，該菌可導(dǎo)致雞、豬等動物的腹瀉，具有致病作用［9］.近年來眾多研究也表明該細(xì)菌對水產(chǎn)動物也具有致病性，Seker等發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌可感染健康鯔（Mugil cephalus）并造成大量死亡，具有較強(qiáng)的致病性［10］.陳雪峰等的研究表明陰溝腸桿菌是導(dǎo)致羅氏沼蝦幼體大規(guī)模發(fā)病死亡的病原［5］.李席席等從發(fā)病的羅氏沼蝦幼體中分離和鑒定得到耐藥性的陰溝腸桿菌［11］.因此，陰溝腸桿菌作為一種人-獸-魚共患的條件性致病菌，對人類健康和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展的危害性不可忽視.本研究中從牛蛙養(yǎng)殖場淤泥中分離的的陰溝腸桿菌對牛蛙也具有致病性，這為進(jìn)一步闡明環(huán)境因素導(dǎo)致的牛蛙病害以及防治提供了科學(xué)參考.

抗菌類藥物的使用依然是目前水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病防控的主要技術(shù)手段之一，也是目前研究者關(guān)注的熱點之一.白杰等從患病巴西龜中分離得到1株致病性菌株，抑菌結(jié)果表明該致病性菌對株頭孢他啶、萘啶酸、諾氟沙星、四環(huán)素、氟苯尼考等藥物敏感，對阿莫西林、頭孢氨芐、磺胺異惡唑和復(fù)方新諾明等耐藥［12］.蘇英等對1株分離自患病大鯢的致病性菌株進(jìn)行藥敏性分析，結(jié)果表明該致病性菌株對多粘菌素B、頭孢曲松、諾氟沙星等抗生素敏感，而對頭孢氨芐、頭孢拉定、克林霉素、新霉素、青霉素等抗菌藥物存在不同程度的耐藥性［13］.李席席等發(fā)現(xiàn)對羅氏沼蝦具有致病性的陰溝腸桿菌對恩諾沙星最敏感，其次是諾氟沙星、鹽酸土霉素和氟苯尼考等抗菌藥物，而對紅霉素和頭孢曲松等則具有明顯的耐藥性［11］.本研究分析了1株從牛蛙養(yǎng)殖池淤泥中分離的陰溝腸桿菌對30種抗生素的敏感性，結(jié)果表明該菌株對頭孢曲松、諾氟沙星、環(huán)丙沙星等抗菌藥物的敏感性最高，卡那霉素、哌拉西林、多粘霉素B、新霉素、米諾環(huán)素和頭孢他定次之，而青霉素、四環(huán)素、頭孢唑啉等藥物敏感性最差.藥敏實驗結(jié)果與此前其他研究報道的陰溝腸桿菌對喹諾酮類藥物較為敏感基本一致，但是對頭孢類藥物敏感性有差異，這可能與菌株的來源環(huán)境的抗菌藥物使用差異導(dǎo)致的耐藥性不同有關(guān).水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的耐藥性致病菌，大多與養(yǎng)殖過程中不合理的使用抗菌類藥物密切相關(guān).因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中應(yīng)該堅持科學(xué)合理以及對癥下藥的用藥原則，防止濫用藥物導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生.在防治水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病時應(yīng)通過科學(xué)的方法篩選合適的敏感藥物，從而為科學(xué)養(yǎng)殖提供合理的用藥參考.同時，加強(qiáng)微生態(tài)制劑的研究與使用，通過抑制養(yǎng)殖環(huán)境中的病原微生物，改善養(yǎng)殖環(huán)境以減少病害發(fā)生.