韓江流域大刺鰍人工繁殖技術(shù)及染色體核型分析研究

孫延杰，李旭杰，查廣才，林標濤，朱藴丹，楊東娟★

（1.韓山師范學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，廣東 潮州 521041；2.廣東省潮州市農(nóng)業(yè)科技發(fā)展中心，廣東 潮州 521041）

大刺鰍（Mastacembelus armatus）在分類上隸屬于鱸形目（Perciformes）、刺鰍科（Mastacembeli?dae）、刺鰍屬（Mastacembelu），在我國南部及西南部的各水系均有分布，廣東、廣西等區(qū)野生資源較多；但近年來的濫捕及江河環(huán)境污染，使大刺鰍野生資源受到了嚴重的破壞，大刺鰍已成為廣東等地重點保護的野生水生動物之一［1-4］.大刺鰍肉質(zhì)鮮美，高蛋白、低脂肪，符合人們對高品質(zhì)膳食的營養(yǎng)需求［5-6］.市場對大刺鰍需求不斷增長，加快其人工繁育技術(shù)研究，促進其種質(zhì)資源保護和利用迫在眉睫，突破大刺鰍的人工繁育技術(shù)是開展其資源保護和開發(fā)利用的基礎(chǔ)［7］.目前，國外對大刺鰍的研究主要是對大刺鰍精子冷凍保存研究［8］，檢測重金屬［9］和PCBs［10］在體內(nèi)富集情況以及STC活性在性腺周期內(nèi)雌雄間的差異［11］.國內(nèi)目前關(guān)于大刺鰍生物學(xué)方面的研究較多，主要有食性、繁殖、營養(yǎng)、及親緣地理等方面［12-16］，其中的人工繁殖研究主要在室外大池環(huán)境中進行.遺傳特性相關(guān)的研究有大刺鰍線粒體DNA完整測序［17］和華南及鄰近地區(qū)大刺鰍遺傳多樣性的ISSR分析［18］等.有關(guān)大刺鰍染色體核型分析研究尚未報道.

本研究意在進行試驗裝置和培養(yǎng)馴化條件優(yōu)化，通過對親魚注射催產(chǎn)激素進行人工催產(chǎn)繁殖，分析大刺鰍產(chǎn)卵量、受精率、孵化率和幼苗存活率，以此探討大刺鰍的人工繁育關(guān)鍵技術(shù)，探索經(jīng)濟實惠的大刺鰍人工繁育技術(shù)體系；同時，進行大刺鰍的核型分析，從細胞水平上了解其遺傳特征，為大刺鰍優(yōu)良品種選育建立基礎(chǔ).該研究對更好地保護和開發(fā)利用大刺鰍資源具有較大意義.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大刺鰍均來自韓江流域，人工配制鰻魚飼料，豐年蟲卵，豐年成蟲，漂白粉，多情素（寧波第二激素廠），復(fù)方促性腺激素釋放激素類似物（寧波第二激素廠），PHA溶液（1 mg/mL），秋水仙素溶液（250 μg/mL），卡諾氏固定液等.

實驗主要儀器為魚缸（約35 cm × 20 cm × 15 cm），魚網(wǎng)、篩子（80 目），體視顯微鏡（Nikon SMZ1000），顯微鏡（Olympus IX73），離心機（Gence TG16-W）等.

1.2 實驗方法

1.2.1 人工繁殖體系設(shè)計

大刺鰍人工繁殖體系主要由催產(chǎn)缸、孵卵缸及種苗培育缸組成，水中放置幾尾金魚以指示水質(zhì)與經(jīng)消毒的PVC管，魚缸用水為充分曝氣的自來水，并保持24 h曝氣及過濾.催產(chǎn)缸內(nèi)配備潛水泵抽取原水，回沖入缸中形成微水流，以模擬野外水流環(huán)境，促進親魚發(fā)情產(chǎn)卵.孵卵缸、種苗培育缸套黑色塑料袋以避光，保持微流水條件.

1.2.2 親魚的選擇與馴化培育

親魚的選擇基本要求是體型正常、體質(zhì)健壯、性成熟、體表完好，捕獲的野生大刺鰍.親魚在模擬野外環(huán)境的條件下進行馴化培養(yǎng)，初期投喂鮮活小蝦，每天遞減投喂鮮活小蝦量，適量增加冰鮮小蝦量，直至均投喂冰鮮小蝦，待大刺鰍均攝食冰鮮蝦后，投喂動物性餌料混合實驗室自制配合飼料，并逐漸增加人工配合飼料的比例，直到全部投喂人工飼料為止［19］.待親魚完成馴化和餌料轉(zhuǎn)換之后，定時投喂自制配合飼料，根據(jù)每次攝食情況，調(diào)整投喂量.待親魚腹部有明顯隆起，轉(zhuǎn)入催產(chǎn)缸后，加大投餌量，同時注意催產(chǎn)缸水環(huán)境監(jiān)測.

1.2.3 人工催產(chǎn)授精

人工催產(chǎn)注射藥物為2 mL生理鹽水＋2 mL多情素＋0.1 g復(fù)方促性腺激素釋放激素類似物，劑量為0.5 mL/尾，背部肌肉注射，進針深度約1.5 cm 左右［20］.雄魚的藥物劑量為雌魚的1/2.采用兩針法，第一針為總劑量的1/5，第二針間隔24 h，注射剩余部分.催產(chǎn)缸水溫24-27 ℃，預(yù)計效應(yīng)時間為36 - 48 h，催產(chǎn)過程保持周圍環(huán)境安靜， 減少親魚應(yīng)激反應(yīng)［20-21］.

接近效應(yīng)時間時，要加強對親魚的觀察；當輕壓雌魚腹部有魚卵流出，馬上人工授精［22-25］.雄性大刺鰍人工取精采用人工擠壓肚臍，精液流出使用注射器進行抽取，雌性大刺鰍人工擠卵到燒杯中，將抽取到的精子注射到收集到燒杯里的卵子，并輕輕攪拌均勻，完成人工授精.人工授精需全程在室內(nèi)陰涼處進行，所用工具事先均需清洗消毒.

1.2.4 幼苗的孵化與培育

將人工授精后的受精卵分別均勻傾倒在經(jīng)消毒的孵卵缸中的木麻黃針葉和榕樹的氣生根上，使受精卵粘附其上，避光孵化.受精卵呈明顯透明色，未受精卵呈乳白色，需及時將未受精卵用吸管吸出，否則未受精卵極易被細菌感染，影響水質(zhì)，同時對受精卵產(chǎn)生影響.剛孵化的魚苗腹部有一膨大的卵黃囊，可維持自身營養(yǎng)達5 d.大刺鰍魚苗破殼6-7 d后卵黃囊消失，此時以豐年蟲幼體為開口飼料，蛋黃為輔助.飼料要均勻潑灑，原因在于魚苗游動能力較弱，自主覓食能力不強［24-25］.大刺鰍魚苗孵化后15 d開始用冷凍的豐年蟲（需解凍）進行投喂.

1.2.5 水質(zhì)處理與疾病預(yù)防控制

馴化階段，每天定時清污換水，利用哈希HQ40d53檢測水質(zhì)（溫度、pH值和溶解氧）.催產(chǎn)后，換水時往水中加入0.3 g/m3的二溴海因進行消毒.若有親魚受傷，則每天將親魚撈出浸泡在3%-5%氯化鈉溶液5 min，再置于新的清水中.魚苗孵化前，需用膠頭滴管將水中未授精的卵子吸走；魚苗孵化后，用虹吸管每天吸污兩次，每天換水40 %，每天進行一次水質(zhì)檢測.

1.2.6 染色體的制備

采用植物血細胞凝集素（PHA）體內(nèi)注射法，在人工催產(chǎn)后的親魚胸鰭基部注射PHA 溶液（1 mg/ mL），劑量為10 μg/g，24 h 后，胸鰭基部注射秋水仙素溶液（250 μg/mL），劑量為4 μg/g.4-5 h 后將魚斷尾及剪斷鰓部動脈在水中放血30 min.取頭腎組織，0.8%生理鹽水清洗3 次，剪碎，加入少量0.8%生理鹽水，棄去未解離的腎組織，制成細胞懸液.1 000 r/min 離心5 min，收集細胞，加入預(yù)熱的0.075 mol/L的kcl，于37 ℃低滲40 min，1000 r/min離心5 min，棄上清.卡諾氏固定液固定30 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)固定一次，棄上清，留下0.2-0.5 mL的固定液，吸管輕吹打使其成為細胞懸液；吸取細胞懸液滴于預(yù)冷的載玻片上，吹散，晾干；干燥后的滴片置于裝有Giemsa染液的染色缸內(nèi)，染色20-30 min，自然干燥，顯微鏡觀察并拍照.

1.2.7 染色體數(shù)目及核型分析

選取染色體分散良好、著絲點清晰的細胞用顯微鏡觀察、照相.觀察統(tǒng)計50 個完整的中期分裂相，確定染色體數(shù)目與體細胞染色體倍數(shù).

選擇狀態(tài)良好的5個細胞中期分裂相，精確測量染色體的長度，用于核型分析.標本經(jīng)拍照放大后粗略測量照片上每條染色體長度，根據(jù)長短初步按順序編號，標記在染色體短臂的一側(cè)，同時確定主縊痕所在的位置，用游標卡尺測量每條染色體的長臂、短臂長度.

根據(jù)測量的染色體參數(shù)數(shù)據(jù)，計算出染色體的相對長度，臂比及著絲粒指數(shù).根據(jù)測量結(jié)果，將染色體由長到短同源染色體重新編號，從左到右依次排列在紙上.著絲點位于同一水平線上，同時短臂在上，長臂在下.

核型模式圖用Excel繪制，橫坐標為染色體序號，縱坐標為染色體的相對長度.繪制染色體核型模式圖時，短臂在上，長臂在下.

2 結(jié)果與分析

2.1 親魚的選擇培育與人工催產(chǎn)

野生大刺鰍在馴養(yǎng)過程中部分死亡，存活且可完全進食人工飼料的雌魚有19條，雄魚28條.雌魚體色呈淡黃色，腹部膨大且柔軟，生殖孔呈圓形、微紅，體重平均190 g；雄魚體色呈灰黑色，體形較長，腹部不膨大且較硬，生殖孔尖小突出、體重平均220 g.

催產(chǎn)過程中，雄魚24條催產(chǎn)后人工擠壓有乳白色的精液流出，精液較濃；雌魚在注射激素后第二天能產(chǎn)卵的有14條，在注射激素后第三天產(chǎn)卵的有5條，雌魚催產(chǎn)率為100%，見表1.

表1 人工催產(chǎn)結(jié)果

2.2 人工授精與幼苗孵化

孵化介質(zhì)為木麻黃針葉和榕樹氣生根，兩介質(zhì)均長18 cm，直徑1 mm，每100根集成一束，用扎帶捆綁一段，另一端散開，每缸放置2束.實驗結(jié)果顯示，木麻黃針葉介質(zhì)組稍好于榕樹氣生根介質(zhì)組，平均受精率分別是91.7 %和79.8 %（表2）；木麻黃針葉介質(zhì)組孵化率顯著高于榕樹氣生根介質(zhì)組，平均孵化率分別是46.1%和1.7%.兩組介質(zhì)對受精率影響相當，但木麻黃針葉介質(zhì)組更利于大刺鰍卵孵化；因此，選擇合適的孵化介質(zhì)有助于提高大刺鰍人工孵化率.

表2 人工授精結(jié)果表

以木麻黃針葉為孵化介質(zhì)的大刺鰍受精卵發(fā)育較好，孵化率為46.1%（表3）.

表3 人工孵化結(jié)果表

2.3 幼苗培育情況

以榕樹氣生根介質(zhì)的大刺鰍水花，孵出的前三天，其發(fā)育生長良好，第4 d 開始死亡，第5 d全部死亡.以木麻黃針葉介質(zhì)的大刺鰍水花孵出前三天，有部分水花死亡.其余在孵出7 d內(nèi)生長狀況良好.第8-15 d，有大部分水花相繼死亡.經(jīng)25 d的精心管理，剩余魚苗體長約3 - 4.5 cm.

2.4 水質(zhì)處理與疾病預(yù)防控制結(jié)果

在每天更換水和水質(zhì)控制的條件下，溶氧量和pH值較為穩(wěn)定，雖利用二溴海因進行殺菌，但水質(zhì)細菌控制效果不佳，部分魚受細菌感染尾部受傷部位開始發(fā)白，后長白絮狀物，每天泡3%-5%氯化鈉溶液5 min.但傷口依然沒有有效控制，會繼續(xù)蔓延，親魚不再躲避在PVC管內(nèi)，獨自在魚缸角落慢游，不進食，3-5 d后死亡.

2.5 染色體核型分析

染色體的相對長度相對絕對長度而言，更具有可比性和穩(wěn)定性.染色體的相對長度、臂比及類型按Leven 等［26］標準公式計算，相對長度=（每個染色體的長度/全部染色體長度）×100；臂比值=長臂長度/短臂長度；著絲粒指數(shù)=（短臂長度/該染色體長度）×100.參考Matthey［27］的建議，亞端部和端部著絲粒染色體的臂數(shù)記為1，中部和亞中部著絲粒染色體的臂數(shù)記為2.選擇狀態(tài)良好的5 個細胞中期分裂相圖像，經(jīng)放大后，對數(shù)碼照片上的染色體逐條進行測量并計算其相對長度、臂比指數(shù)，著絲粒指數(shù)，然后取平均值，結(jié)果如圖1所示，大刺鰍的染色體2n=48，為二倍體，未見性染色體和隨體.大刺鰍核型公式為：2n=18m+5sm+M，NF=96；根據(jù)表4 獲得的臂比指數(shù)等染色體參數(shù)數(shù)據(jù)，大刺鰍的染色體為正、中或近中部著絲點染色體.大刺鰍染色體著絲粒指數(shù)變化范圍為33.33 - 50.00；臂比值范圍在1.0 - 2.0之間.根據(jù)Stebbins［28］的核型分類標準及Arano［29］的核型不對稱系數(shù)計算方法，大刺鰍的核型為2A型，核型不對稱系數(shù)：59.03%，對稱程度較高.

表4 大刺鰍染色體核型分析數(shù)據(jù)

圖1 大刺鰍染色體核型

3 討論

3.1 親魚選擇與培育

野生狀態(tài)下的大刺鰍，通過科學(xué)的人工馴養(yǎng)、培育，親魚能夠在人工環(huán)境中生長、攝食飼料并達到性成熟，其繁殖狀態(tài)比野生大刺鰍更為可控和預(yù)測，在親魚的選擇與培育中應(yīng)盡量選擇經(jīng)過規(guī)范化馴養(yǎng)的大刺鰍.

3.2 人工催產(chǎn)與受精

在注射催產(chǎn)藥后，24 h內(nèi)親魚有排卵現(xiàn)象，要注意觀察，另在人工授精過程中要充分攪拌均勻以受精，否則未受精卵細胞會發(fā)生病變，引起水質(zhì)災(zāi)難性變化.鑒于人工催產(chǎn)對親魚的傷害，一般親魚在催產(chǎn)后存活率不高.

3.3 人工孵化與幼苗培育

孵化率的高低主要由受精卵的質(zhì)量、孵化水溫的控制、水體溶解氧的含量和水霉病的控制情況所決定.其中榕樹氣生根缸的水霉病難以控制，較為嚴重，導(dǎo)致孵化率低.兩個缸的受精卵來自同一批親魚，因此可能是由于榕樹氣生根缸在將卵移到榕樹氣生根介質(zhì)上時，沒有輕刷均勻，許多受精卵聚集在一起，缺氧、感染水霉病，這需進一步進行探究.

人工孵化過程中幼苗死亡，分析原因可能是：（1）孵化缸充氣過大，會導(dǎo)致大刺鰍水花腹部卵膜破損；充氣過小，孵化缸溶解氧偏低；（2）水體有害生物繁殖過多，尤其水霉病爆發(fā)頻繁，因設(shè)備原因且無法進行徹底消毒，導(dǎo)致幼苗死亡率高，后期還需要進行設(shè)備改造升級，以增加水質(zhì)調(diào)節(jié)能力.

3.4 染色體核型分析的意義

全世界的魚類種類豐富，但在脊椎動物中，魚類染色體小、數(shù)目多，對其展開研究較難.魚類具有巨大的經(jīng)濟價值，對其展開核型研究分析是有必要的，對進一步開展細胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究工作、開發(fā)魚類資源有重要的意義［27-30］.目前，魚類染色體的研究在取材方面大多選擇分裂增殖能力強的頭腎細胞，體內(nèi)注射短期培養(yǎng)法和體細胞體外培養(yǎng)法是制備魚類染色體標本常用的方法，本次實驗采用的是體內(nèi)注射短期培養(yǎng)法，對于一些離水即失活的魚類則不適合采用此法［31］.染色體的形態(tài)與數(shù)目是物種的特征之一，染色體核型代表一個物種或個體在染色體水平上的表型，通過物種間染色體的差別可以對生物進行分類并探討其親緣關(guān)系，同時也可以為生物的演化提供線索.不同實驗室條件下的實驗處理、實驗材料的區(qū)域性，核型分析結(jié)果會略微有差異，染色體組型在一般情況下僅僅是對物種染色體特征粗略描述.

本次實驗獲得大刺鰍染色體2n=48，與國內(nèi)已報道的大多數(shù)魚類染色體數(shù)一致［32］.大刺鰍的染色體核型研究至今未見有公開文獻報道，本實驗的研究為了解大刺鰍細胞水平遺傳學(xué)特征補充了新資料.

綜上所述，本次實驗通過建立大刺鰍人工繁殖系統(tǒng)，對親魚注射催產(chǎn)激素進行催產(chǎn)、人工擠精、擠卵和授精，分析了大刺鰍產(chǎn)卵量、受精率、孵化率和幼苗存活率；為進一步優(yōu)化探索大刺鰍的人工繁殖方法與技術(shù)，為大刺鰍資源保護、開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ).同時，采用（PHA）體內(nèi)注射法短期培養(yǎng)大刺鰍頭腎細胞，添加秋水仙素等操作處理后進行染色體制備及核型分析，闡述了大刺鰍的染色體形態(tài)數(shù)目特征，為進一步深入研究大刺鰍及其他魚類遺傳特性提供參考與借鑒.