• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    HCBP6模擬磷酸化對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)三酰甘油合成的調(diào)控作用

    2021-07-09 06:37:40楊雪亮劉小靜劉順愛(ài)藺淑梅
    關(guān)鍵詞:絲氨酸三酰孔板

    楊雪亮,劉小靜,韓 銘,劉順愛(ài),成 軍,藺淑梅

    (1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科,陜西西安 710061;2. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科,陜西西安 710061;3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院傳染病研究所,北京 100020)

    隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高,人們的飲食結(jié)構(gòu)、生活方式及生活習(xí)慣均發(fā)生明顯的改變, 脂肪性肝病的發(fā)病率在我國(guó)逐年上升,嚴(yán)重威脅人民的健康。代謝相關(guān)脂肪性肝病(metabolism-associated fatty liver disease, MAFLD)是最常見(jiàn)的一種脂肪性肝病,普通成人MAFLD患病率高達(dá)15%~30%,現(xiàn)在MAFLD已取代乙型肝炎,成為我國(guó)的第一大慢性肝病[1]。目前由于MAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,故尚無(wú)特異性治療MAFLD的藥物。因此,深入探討MAFLD發(fā)生的分子機(jī)制,尤其肝細(xì)胞中三酰甘油合成的分子機(jī)制,對(duì)治療MAFLD具有重要意義。

    三酰甘油的攝入、生成、分解的異常均能引起MAFLD。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol-regulatory-element-binding protein, SREBP)是一種結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的轉(zhuǎn)錄因子,能夠激活膽固醇和三酰甘油生物合成相關(guān)酶的表達(dá)[2]。SREBP有3種異構(gòu)體:SREBP1c、SREBP1a、SREBP2[3],其中SREBP1c促進(jìn)肝內(nèi)三酰甘油生成[4]。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FASN)與乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACC1)是促進(jìn)脂肪酸合成的關(guān)鍵酶,是三酰甘油生成中不可缺少的酶。SREBP1c通過(guò)上調(diào)FASN、ACC1表達(dá),促進(jìn)三酰甘油生成[5]。HCV結(jié)合蛋白6(hepatitis C binding protein 6, HCBP6)是本課題組通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一種HCV核心蛋白結(jié)合蛋白[6]。前期研究發(fā)現(xiàn),HCBP6能夠結(jié)合在SREBP1c啟動(dòng)子區(qū)域,通過(guò)促進(jìn)SREBP1c基因轉(zhuǎn)錄,增強(qiáng)SREBP1c-FASN 信號(hào)通路表達(dá),促進(jìn)三酰甘油生成[7]。

    通過(guò)改變代謝酶的表達(dá)水平、控制底物的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)或產(chǎn)物的濃度、進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后修飾均能促進(jìn)機(jī)體的代謝,其中蛋白磷酸化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾手段[8]。蛋白磷酸化位點(diǎn)通常在絲氨酸和蘇氨酸。HCBP6是一種富含絲氨酸的蛋白。UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)HCBP6的第10位、第151位絲氨酸(Ser-10、Ser-151)可能存在磷酸化。本研究利用定點(diǎn)突變技術(shù),模擬Ser-10、Ser-151磷酸化與去磷酸化,探討HCBP6模擬磷酸化對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)三酰甘油的調(diào)控作用。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑及引物HepG2細(xì)胞、pcDNA3.1/myc-his(-)質(zhì)粒、pGL4.10-basic質(zhì)粒、pcDNA3.1-HCBP6質(zhì)粒為北京地壇醫(yī)院傳染病研究所保存??焖俣c(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自北京全式金公司??俁NA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司,SYBR Green qPCR Master Mix購(gòu)自美國(guó)ABI公司。SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,M-PERTM Mammalian Protein Extraction Reagent購(gòu)自美國(guó)Thermo公司,Cocktail of Protease Inhibitors購(gòu)自美國(guó)Roche公司,BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司,Pierce?ECL顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司,PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司,HCBP6兔多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,SREBP1c兔單克隆抗體購(gòu)自中國(guó)臺(tái)灣Abnova公司,F(xiàn)ASN兔單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,ACC1兔單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,Phospho-ACC1兔單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司,GAPDH兔單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,HRP 標(biāo)記的羊抗兔抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司,雙螢光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司,三酰甘油檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,油紅O購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自法國(guó)Polyplus公司。

    實(shí)驗(yàn)中所有引物均由蘇州泓迅公司(北京)合成,所有的引物序列見(jiàn)表1所示,其中以β-actin作為qRT-PCR的內(nèi)參,qRT-PCR的產(chǎn)物的計(jì)算采用相對(duì)定量法,即2-ΔΔCT法。qRT-PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min,40個(gè)循環(huán)。

    表1 qRT-PCR引物序列

    1.2 HCBP6第10位與第151位絲氨酸模擬磷酸化與去磷酸化HCBP6第10位、第151位是絲氨酸,采用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)這兩個(gè)位點(diǎn)可能存在磷酸化,通過(guò)點(diǎn)突變,將絲氨酸突變?yōu)楸彼幔沟肏CBP6持續(xù)去磷酸化;將絲氨酸突變?yōu)樘於彼幔沟肏CBP6持續(xù)磷酸化。其中HCBP6不同類型質(zhì)粒如下所述:HCBP6野生型質(zhì)粒p-HCBP6;HCBP6第10位氨基酸去磷酸化質(zhì)粒p-HCBP6 10Ala(p-10Ala);HCBP6第10位氨基酸磷酸化質(zhì)粒p-HCBP6 10Asp(p-10Asp);HCBP6第151位氨基酸去磷酸化質(zhì)粒p-HCBP6 151Ala(p-151Ala);HCBP6第151位氨基酸磷酸化質(zhì)粒p-HCBP6 151Asp(p-151Asp)。以野生型pcDNA3.1-HCBP6質(zhì)粒為模板,采用Primer X數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì),利用快速點(diǎn)突變?cè)噭┖校ㄟ^(guò)PCR反應(yīng)、PCR產(chǎn)物消化、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒提取,成功構(gòu)建HCBP6不同位點(diǎn)磷酸化質(zhì)粒。

    1.3 細(xì)胞內(nèi)三酰甘油含量的測(cè)定復(fù)蘇的肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞,采用100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,50 mL/L CO2的37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細(xì)胞傳至3~4代,細(xì)胞輪廓清楚,細(xì)胞飽滿時(shí),將HepG2細(xì)胞鋪在6孔板,進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。采用三酰甘油檢測(cè)試劑盒測(cè)定三酰甘油含量。

    1.4 油紅O染色取6孔板,每孔放1塊爬片,將培養(yǎng)好的HepG2細(xì)胞鋪板并進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。40 g/L的多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min,配好的油紅工作液室溫染色30 min,600 mL/L的異丙醇快速清洗細(xì)胞,用PBS輕輕清洗細(xì)胞2次,顯微鏡下觀察染色的情況。再用配好的蘇木素染液進(jìn)行細(xì)胞核染色5 min,用PBS反復(fù)清洗細(xì)胞,至顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴,其中三酰甘油染成紅色。

    1.5 qRT-PCR及Western blotting檢測(cè)將HepG2細(xì)胞鋪在12孔板或者6孔板,采用jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染24 h,收獲12孔板的細(xì)胞,qRT-PCR檢測(cè)SREBP1c、ACC1及FASN mRNA的表達(dá)情況;轉(zhuǎn)染48 h,收獲6孔板的細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度,然后蛋白變性后進(jìn)行凝膠電泳、電轉(zhuǎn)印、抗體孵育并曝光,檢測(cè)SREBP1c、ACC1及FASN蛋白的表達(dá)情況。

    1.6 啟動(dòng)子活性檢測(cè)將HepG2細(xì)胞鋪在48孔板,將成功構(gòu)建的SREBP1c核心啟動(dòng)子P2螢光素酶報(bào)告基因載體及HCBP6不同類型質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染24 h后,采用雙螢光素酶報(bào)告基因試劑盒進(jìn)行報(bào)告基因的活性檢測(cè)。

    2 結(jié) 果

    2.1 HCBP6 Ser-10磷酸化促進(jìn)三酰甘油生成圖1顯示,轉(zhuǎn)染p-10Asp的HepG2細(xì)胞內(nèi)三酰甘油水平高于轉(zhuǎn)染p-10Ala(P=0.001)或p-HCBP6(P=0.005),而轉(zhuǎn)染p-151Asp與轉(zhuǎn)染p-151Ala的HepG2細(xì)胞內(nèi)的三酰甘油水平無(wú)明顯區(qū)別(P=0.062),且二者均低于轉(zhuǎn)染p-HCBP6;圖2顯示,轉(zhuǎn)染p-10Asp的HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂滴多于轉(zhuǎn)染p-10Ala或p-HCBP6,而轉(zhuǎn)染p-151Asp與轉(zhuǎn)染p-151Ala的HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴低于轉(zhuǎn)染p-HCBP6,且二者細(xì)胞內(nèi)蓄積的脂質(zhì)無(wú)明顯區(qū)別,說(shuō)明HCBP6 Ser-10磷酸化促進(jìn)三酰甘油生成。

    圖1 HCBP6不同位點(diǎn)磷酸化對(duì)細(xì)胞內(nèi)三酰甘油水平的影響

    圖2 HCBP6不同位點(diǎn)磷酸化對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)生成的影響

    2.2 HCBP6 Ser-10磷酸化能增強(qiáng)SREBP1c-FASN信號(hào)通路表達(dá)圖3A顯示,在p-10Asp轉(zhuǎn)染24 h后,HepG2細(xì)胞SREBP1c的mRNA表達(dá)水平較p-10Ala上升約46%(P<0.001),較p-HCBP6組表達(dá)水平上升約96%(P<0.001),而轉(zhuǎn)染p-151Asp與轉(zhuǎn)染p-151Ala的HepG2細(xì)胞的SREBP1c的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P=0.675),且二者均低于轉(zhuǎn)染p-HCBP6;圖3B結(jié)果顯示,在p-10Asp轉(zhuǎn)染24 h后,HepG2細(xì)胞的FASN的mRNA表達(dá)水平較p-10Ala僅上升11%,但較p-HCBP6組表達(dá)水平上升69%(P=0.01),而轉(zhuǎn)染p-151Asp較轉(zhuǎn)染p-151Ala的HepG2細(xì)胞的FASN的mRNA表達(dá)水平上升約3倍(P=0.002),但是較p-HCBP6表達(dá)水平無(wú)明顯上升(P=0.428);圖3C結(jié)果顯示,在p-10Asp轉(zhuǎn)染24 h后,HepG2細(xì)胞的ACC1的mRNA表達(dá)水平較p-10Ala與p-HCBP6組均未見(jiàn)明顯增加(P=0.947,P=0.108),且轉(zhuǎn)染p-151Asp與轉(zhuǎn)染p-151Ala的HepG2細(xì)胞的ACC1的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P=0.213),且二者均低于轉(zhuǎn)染p-HCBP6。綜上所述,HCBP6 Ser-10磷酸化,促進(jìn)SREBP1c、FASN的mRNA表達(dá),而HCBP6 Ser-151磷酸化對(duì)SREBP1c、FASN的mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響。

    圖3 HCBP6不同位點(diǎn)磷酸化對(duì)SREBP1c-FASN-ACC1 mRNA的影響

    如圖4所示,轉(zhuǎn)染p-10Asp的SREBP1c、p-ACC1、FASN的蛋白表達(dá)均較轉(zhuǎn)染p-10Ala顯著上調(diào),而轉(zhuǎn)染p-151Asp的SREBP1c的蛋白表達(dá)較轉(zhuǎn)染p-151Ala減少,轉(zhuǎn)染p-151Asp的FASN的蛋白表達(dá)較轉(zhuǎn)染p-151Ala增加,轉(zhuǎn)染p-151Asp與p-151Ala的p-ACC1的蛋白表達(dá)無(wú)明顯區(qū)別。綜上所述,HCBP6 Ser-10磷酸化,促進(jìn)SREBP1c、ACC1、FASN的蛋白表達(dá),而HCBP6 Ser-151磷酸化對(duì)SREBP1c、ACC1、FASN的蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。

    圖4 HCBP6不同位點(diǎn)磷酸化對(duì)SREBP1c-FASN-ACC1的蛋白的影響

    2.3 HCBP6 Ser-10磷酸化后可能富集于SREBP1c啟動(dòng)子區(qū)域,促進(jìn)SREBP1c轉(zhuǎn)錄翻譯圖5結(jié)果顯示,在p-10Asp轉(zhuǎn)染24 h后,HepG2細(xì)胞的SREBP1c核心啟動(dòng)子P2相對(duì)活性較p-10Ala上升約57%(P=0.003),較p-HCBP6組上升約44%(P=0.004),而轉(zhuǎn)染p-151Asp較轉(zhuǎn)染p-151Ala的HepG2細(xì)胞的啟動(dòng)子P2相對(duì)活性無(wú)明顯變化(P=0.104)。綜上所述,HCBP6 Ser-10磷酸化,增強(qiáng)SREBP1c核心啟動(dòng)子P2活性,而HCBP6 Ser-151磷酸化對(duì)SREBP1c核心啟動(dòng)子P2活性無(wú)明顯影響。

    圖5 HCBP6不同位點(diǎn)磷酸化對(duì)SREBP1c核心啟動(dòng)子P2活性的影響

    p-ACC1是磷酸化的ACC1,GAPDH作為分子內(nèi)參。p-NC為空質(zhì)粒;p-HCBP6為野生型HCBP6質(zhì)粒;p-10Ala為 HCBP6第10位去磷酸化質(zhì)粒;p-10Asp為HCBP6第10位磷酸化質(zhì)粒;p-151Ala為HCBP6第151位去磷酸化質(zhì)粒;p-151Asp為HCBP6第151位磷酸化質(zhì)粒。

    3 討 論

    HCBP6是本課題組通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)篩選到的與丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白結(jié)合的一種新蛋白[9]。早期將眾多的可以與HCV核心蛋白結(jié)合的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)很多的已知蛋白基因,如載脂蛋白A1(APO-A1)、載脂蛋白A2(APO-A2)等[10]。根據(jù)以上研究結(jié)果,HCV感染與肝臟脂肪變的研究開(kāi)始受到重視,為HCV感染引起肝臟脂肪變性提供許多證據(jù),發(fā)現(xiàn)慢性丙型肝炎與肝臟脂肪變密切相關(guān)[11-12]。研究證實(shí),HCV 核心蛋白在丙型肝炎病毒引起的脂肪性肝病發(fā)病機(jī)制中起重要作用[13-14]。HCBP6作為其中的一種HCV核心蛋白結(jié)合的蛋白,生物信息學(xué)預(yù)測(cè)HCBP6可能調(diào)控與肝細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增生、分化及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等密切相關(guān)的基因[15]。這高度提示HCBP6作為HCV核心蛋白的結(jié)合蛋白可能在脂肪性肝病的發(fā)病機(jī)制或脂質(zhì)代謝中起重要作用。通過(guò)分子、細(xì)胞及動(dòng)物水平研究發(fā)現(xiàn),HCBP6對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇和三酰甘油代謝均具有調(diào)節(jié)作用[7,16-17]。

    蛋白磷酸化是最常見(jiàn)、最重要的一種翻譯后修飾,參與并調(diào)節(jié)機(jī)體的多種生命活動(dòng)。既往研究發(fā)現(xiàn),參與三酰甘油合成與代謝的蛋白通過(guò)不同位點(diǎn)磷酸化發(fā)揮調(diào)控作用。如早期研究發(fā)現(xiàn),脂肪三酰甘油脂酶(adipose triglyceride lipase, ATCL)是一種磷酸化的蛋白酶,分別在Ser-406與Ser-430存在磷酸化位點(diǎn)[18],其中AMPK促使Ser-406磷酸化,從而激活A(yù)TGL酶,促進(jìn)三酰甘油水解[19]。ACC1是脂肪酸合成與代謝中重要的中間產(chǎn)物,其中Ser-66、Ser-79、Ser-117分別存在磷酸化。研究發(fā)現(xiàn),胰島素與酪氨酸激酶共同作用,促進(jìn)脂肪細(xì)胞的ACC1 Ser-66磷酸化[20],AMPK促進(jìn)ACC1 Ser-79磷酸化[21],而PKA促進(jìn)Ser-117磷酸化[22],降低ACC1活性。UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)HCBP6可能也是一種磷酸化蛋白,其中的Ser10、Ser151可能存在磷酸化。

    蛋白磷酸化位點(diǎn)通常在絲氨酸和蘇氨酸,將這些氨基酸利用定點(diǎn)誘變的方式突變?yōu)楸彼岷蟪掷m(xù)去磷酸化,這是因?yàn)楸彼崾欠菢O性氨基酸,永遠(yuǎn)都不會(huì)發(fā)生磷酸化,而將絲氨酸或者蘇氨酸突變?yōu)楣劝彼峄蛘咛於彼岷髮⒊掷m(xù)磷酸化,這是因?yàn)楣劝彼崤c天冬氨酸是帶有羧基側(cè)鏈,本身具有負(fù)電荷的極性氨基酸,這與蛋白磷酸化非常類似,因此一定程度上模擬了磷酸化所產(chǎn)生的物理化學(xué)效應(yīng),一定程度上激活底物,是一種模擬磷酸化狀態(tài)的技術(shù)手段。早在1993年,MORRISON等[23]將表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR的Thr-654與Thr-669定點(diǎn)突變?yōu)镚lu-654與Glu-669模擬EGFR磷酸化,研究EGFR的Thr-654與Thr-66磷酸化受到PKC與MAPK調(diào)控。2005年YANAGAWA等[24]將磷酸葡萄糖異構(gòu)酶PGI的Ser-185定點(diǎn)突變?yōu)镚lu-185、Asp-185、Ala-185,證實(shí)PGI通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)酶活性。2018年JOOS等[25]發(fā)現(xiàn)組蛋白H3 Ser28定點(diǎn)突變?yōu)锳la-28模擬H3去磷酸化,顯示H3去磷酸化后能延長(zhǎng)壽命、提高抗饑餓能力、減少氧化應(yīng)激反應(yīng)。說(shuō)明利用定點(diǎn)突變技術(shù),模擬蛋白磷酸化是一項(xiàng)得到長(zhǎng)久和廣泛應(yīng)用的技術(shù),是一種被認(rèn)可的蛋白修飾技術(shù)。

    本研究通過(guò)該手段模擬HCBP6的Ser-10、Ser-151磷酸化與去磷酸化,發(fā)現(xiàn)當(dāng)HCBP6 Ser-10磷酸化后增強(qiáng)SREBP1c-FASN信號(hào)通路表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)三酰甘油生成;抑制HCBP6磷酸化,減少肝細(xì)胞內(nèi)三酰甘油生成。這可能是未來(lái)治療MAFLD的分子靶點(diǎn)。

    猜你喜歡
    絲氨酸三酰孔板
    高三酰甘油血癥性胰腺炎的血脂管理
    D-絲氨酸與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系的研究進(jìn)展
    核電廠高壓安注系統(tǒng)再循環(huán)管線節(jié)流孔板的分析與改進(jìn)
    D-絲氨酸在抑郁癥中的作用研究進(jìn)展
    富硒酵母對(duì)長(zhǎng)期缺硒和正常大鼠體內(nèi)D-絲氨酸和L-絲氨酸水平的影響
    歐盟評(píng)估一種三酰甘油脂肪酶的安全性
    兩步法催化魚(yú)油制備MLM型結(jié)構(gòu)三酰甘油酯
    限流孔板的計(jì)算與應(yīng)用
    廣州化工(2020年6期)2020-04-18 03:30:20
    高三酰甘油血癥和胰腺疾病的相關(guān)性
    長(zhǎng)距離礦漿管道系統(tǒng)中消能孔板的運(yùn)行優(yōu)化
    一区在线观看完整版| 国产高清激情床上av| 国产精品一区二区三区四区久久 | 女性生殖器流出的白浆| 69av精品久久久久久| 精品一区二区三区四区五区乱码| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 成人欧美大片| 午夜激情av网站| 此物有八面人人有两片| 亚洲激情在线av| 黄频高清免费视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产人伦9x9x在线观看| www日本在线高清视频| 悠悠久久av| 少妇被粗大的猛进出69影院| 91av网站免费观看| 国产av又大| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 九色国产91popny在线| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产午夜福利久久久久久| 一区福利在线观看| 久久中文字幕一级| 日韩有码中文字幕| 九色国产91popny在线| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧美激情 高清一区二区三区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 可以在线观看的亚洲视频| 伦理电影免费视频| 天天一区二区日本电影三级 | 美女 人体艺术 gogo| 国产熟女午夜一区二区三区| 后天国语完整版免费观看| 99精品久久久久人妻精品| 无人区码免费观看不卡| 国产真人三级小视频在线观看| 青草久久国产| 欧美黄色片欧美黄色片| 中文字幕高清在线视频| 国产97色在线日韩免费| 两个人免费观看高清视频| 久久影院123| 欧美日韩一级在线毛片| 精品一区二区三区四区五区乱码| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲国产精品合色在线| 精品人妻1区二区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 这个男人来自地球电影免费观看| 色av中文字幕| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 女性生殖器流出的白浆| 久久九九热精品免费| 两人在一起打扑克的视频| 最新美女视频免费是黄的| 9191精品国产免费久久| 一区二区三区高清视频在线| 午夜福利18| 免费高清视频大片| 十八禁人妻一区二区| 国产精品久久电影中文字幕| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 啦啦啦 在线观看视频| 嫁个100分男人电影在线观看| svipshipincom国产片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲性夜色夜夜综合| 99久久国产精品久久久| 日日爽夜夜爽网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 怎么达到女性高潮| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 99re在线观看精品视频| 欧美激情高清一区二区三区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久青草综合色| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲视频免费观看视频| 在线观看午夜福利视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 99国产精品一区二区三区| 精品人妻1区二区| 91成年电影在线观看| 午夜老司机福利片| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 波多野结衣一区麻豆| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲国产欧美网| 精品国产一区二区久久| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 9191精品国产免费久久| bbb黄色大片| 波多野结衣av一区二区av| 不卡av一区二区三区| 午夜两性在线视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 亚洲一区中文字幕在线| 国产又爽黄色视频| 国产高清有码在线观看视频 | 国产91精品成人一区二区三区| 免费看十八禁软件| 91大片在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲欧美激情综合另类| 色综合婷婷激情| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲精品粉嫩美女一区| 黄片大片在线免费观看| 欧美大码av| 亚洲成人免费电影在线观看| 99热只有精品国产| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲熟女毛片儿| 久久中文看片网| 两性夫妻黄色片| 午夜免费鲁丝| 成人av一区二区三区在线看| 黄色视频不卡| 99久久国产精品久久久| 久久精品国产综合久久久| 午夜影院日韩av| av视频在线观看入口| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 1024香蕉在线观看| 青草久久国产| 成人欧美大片| 亚洲精品在线观看二区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 操美女的视频在线观看| 欧美性长视频在线观看| 国产在线观看jvid| 大型av网站在线播放| 国产成人啪精品午夜网站| 国产99久久九九免费精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 欧美不卡视频在线免费观看 | 欧美色欧美亚洲另类二区 | 淫妇啪啪啪对白视频| 黄片大片在线免费观看| 一二三四社区在线视频社区8| 免费看a级黄色片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 在线播放国产精品三级| 亚洲午夜理论影院| 亚洲伊人色综图| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产单亲对白刺激| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 欧美黑人精品巨大| 嫁个100分男人电影在线观看| 一级毛片女人18水好多| 老鸭窝网址在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品亚洲一级av第二区| 精品乱码久久久久久99久播| 久久午夜亚洲精品久久| 成人欧美大片| 亚洲自拍偷在线| 亚洲七黄色美女视频| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美乱妇无乱码| 啦啦啦韩国在线观看视频| 97碰自拍视频| 精品免费久久久久久久清纯| 日本三级黄在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 国产一区二区激情短视频| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲一区中文字幕在线| 黄片小视频在线播放| 在线观看日韩欧美| 在线国产一区二区在线| 亚洲自拍偷在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲精品av麻豆狂野| ponron亚洲| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 美女 人体艺术 gogo| 日韩精品中文字幕看吧| 免费av毛片视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 在线观看舔阴道视频| 一a级毛片在线观看| 一本久久中文字幕| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲国产精品999在线| 中亚洲国语对白在线视频| 黄色a级毛片大全视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 免费看美女性在线毛片视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 美女高潮到喷水免费观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 午夜两性在线视频| 午夜福利免费观看在线| 中出人妻视频一区二区| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 亚洲成国产人片在线观看| 午夜激情av网站| 天堂√8在线中文| av片东京热男人的天堂| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产成人影院久久av| 久久久久精品国产欧美久久久| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 黄片小视频在线播放| 久久久久久免费高清国产稀缺| 在线观看66精品国产| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 欧美午夜高清在线| 男女下面插进去视频免费观看| 日本一区二区免费在线视频| 深夜精品福利| 日韩欧美免费精品| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 99国产精品一区二区三区| 亚洲av美国av| 热99re8久久精品国产| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 成人国语在线视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品二区激情视频| 女警被强在线播放| 国产亚洲精品一区二区www| 午夜福利欧美成人| 制服诱惑二区| 国产熟女xx| 18禁国产床啪视频网站| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 9热在线视频观看99| 久久久久久国产a免费观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 身体一侧抽搐| 18禁美女被吸乳视频| 国产成人av激情在线播放| 午夜影院日韩av| 国产色视频综合| 色综合婷婷激情| 国产精品久久久久久精品电影 | 午夜久久久久精精品| 波多野结衣高清无吗| 丝袜人妻中文字幕| 韩国av一区二区三区四区| 一进一出好大好爽视频| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 国产av又大| 欧美精品啪啪一区二区三区| 在线天堂中文资源库| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 99精品久久久久人妻精品| 欧美日韩精品网址| 亚洲无线在线观看| 国产av一区在线观看免费| 久久人人97超碰香蕉20202| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲国产看品久久| 人人妻人人澡人人看| 久热爱精品视频在线9| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 伦理电影免费视频| 亚洲精品一区av在线观看| 禁无遮挡网站| 岛国在线观看网站| 美女高潮到喷水免费观看| www.熟女人妻精品国产| 国产av在哪里看| 男人的好看免费观看在线视频 | 成熟少妇高潮喷水视频| 自线自在国产av| 1024视频免费在线观看| 一区福利在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久香蕉精品热| 精品免费久久久久久久清纯| 中文字幕av电影在线播放| 丰满的人妻完整版| 女人精品久久久久毛片| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美日韩乱码在线| 免费在线观看日本一区| av在线播放免费不卡| 国产熟女午夜一区二区三区| 中文字幕高清在线视频| 91成人精品电影| 日本免费a在线| 精品久久久久久成人av| 亚洲五月色婷婷综合| 天堂√8在线中文| 欧美日韩福利视频一区二区| 男人的好看免费观看在线视频 | 中亚洲国语对白在线视频| 国产区一区二久久| 一级毛片女人18水好多| 欧美成人免费av一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9| 大型av网站在线播放| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 可以在线观看毛片的网站| av视频免费观看在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 在线观看www视频免费| 人成视频在线观看免费观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 一二三四社区在线视频社区8| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 涩涩av久久男人的天堂| 久久香蕉激情| 亚洲成人免费电影在线观看| 满18在线观看网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 1024香蕉在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产av又大| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 波多野结衣巨乳人妻| 国产一卡二卡三卡精品| 欧美黄色淫秽网站| 色哟哟哟哟哟哟| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲 欧美一区二区三区| 18禁国产床啪视频网站| 午夜福利成人在线免费观看| 日本五十路高清| 国产熟女午夜一区二区三区| 中文亚洲av片在线观看爽| 色播亚洲综合网| av电影中文网址| 久久精品人人爽人人爽视色| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久精品国产清高在天天线| 国产亚洲欧美精品永久| 精品人妻1区二区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 成人国产一区最新在线观看| a在线观看视频网站| 国产精品国产高清国产av| 淫秽高清视频在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲第一青青草原| 日本三级黄在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 最新在线观看一区二区三区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 日本免费a在线| 国产亚洲精品av在线| av有码第一页| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲中文字幕日韩| 亚洲五月天丁香| 日韩国内少妇激情av| 俄罗斯特黄特色一大片| 色综合婷婷激情| 久久久久久久午夜电影| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 一进一出好大好爽视频| svipshipincom国产片| 欧美在线黄色| 在线av久久热| 免费看a级黄色片| 免费在线观看亚洲国产| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美成狂野欧美在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 男女下面插进去视频免费观看| 99国产精品一区二区三区| 久久中文字幕一级| 丁香六月欧美| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久99久视频精品免费| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 中亚洲国语对白在线视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 男人舔女人下体高潮全视频| 一进一出抽搐动态| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 午夜精品久久久久久毛片777| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久久水蜜桃国产精品网| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 一个人观看的视频www高清免费观看 | av在线天堂中文字幕| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日韩欧美国产一区二区入口| 麻豆av在线久日| 搡老熟女国产l中国老女人| 深夜精品福利| 亚洲av电影不卡..在线观看| 男人舔女人的私密视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 91九色精品人成在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 男人舔女人的私密视频| 国产精品久久视频播放| 精品久久久精品久久久| 十八禁人妻一区二区| 无限看片的www在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲成av人片免费观看| 久久香蕉激情| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 成人特级黄色片久久久久久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲视频免费观看视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久久久国内视频| 成人国产综合亚洲| 久久中文字幕人妻熟女| 欧美日本视频| 91av网站免费观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 男女下面插进去视频免费观看| www日本在线高清视频| 69av精品久久久久久| 九色亚洲精品在线播放| 麻豆av在线久日| 精品福利观看| 一级片免费观看大全| 美国免费a级毛片| 亚洲性夜色夜夜综合| 中文字幕高清在线视频| 国产三级黄色录像| 国产激情欧美一区二区| 美女高潮到喷水免费观看| 在线国产一区二区在线| 国产精品av久久久久免费| 午夜福利影视在线免费观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 中国美女看黄片| 999久久久精品免费观看国产| 99在线视频只有这里精品首页| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 在线视频色国产色| 大码成人一级视频| 在线观看免费视频网站a站| 成人18禁在线播放| 欧美激情 高清一区二区三区| 中文字幕久久专区| 久久久国产精品麻豆| 国产亚洲精品一区二区www| 日日干狠狠操夜夜爽| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 麻豆av在线久日| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲人成电影免费在线| 日韩欧美国产一区二区入口| 在线av久久热| avwww免费| 天堂影院成人在线观看| 国产精品,欧美在线| 免费观看精品视频网站| 国产午夜精品久久久久久| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜福利一区二区在线看| 成年女人毛片免费观看观看9| 波多野结衣高清无吗| 亚洲人成电影免费在线| 老司机靠b影院| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品免费视频内射| 欧美在线一区亚洲| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲片人在线观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲免费av在线视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 91成年电影在线观看| 高清在线国产一区| 日本欧美视频一区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 免费在线观看亚洲国产| 九色亚洲精品在线播放| 一二三四社区在线视频社区8| 日韩大码丰满熟妇| 欧美日韩精品网址| 亚洲五月天丁香| 精品国产亚洲在线| 久99久视频精品免费| 亚洲美女黄片视频| 校园春色视频在线观看| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品av久久久久免费| 老司机在亚洲福利影院| 久久九九热精品免费| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 中出人妻视频一区二区| 1024香蕉在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久中文字幕一级| 国产精品免费视频内射| 69精品国产乱码久久久| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 在线免费观看的www视频| 热re99久久国产66热| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美成人午夜精品| bbb黄色大片| 99re在线观看精品视频| 两个人看的免费小视频| 露出奶头的视频| 美女国产高潮福利片在线看| 成人手机av| 日韩精品青青久久久久久| 精品日产1卡2卡| 亚洲av美国av| 欧美日本视频| 电影成人av| 一区二区三区高清视频在线| 女人被狂操c到高潮| 久久精品国产清高在天天线| 可以在线观看毛片的网站| 午夜福利免费观看在线| 欧美性长视频在线观看| 中国美女看黄片| 老司机靠b影院| 狂野欧美激情性xxxx| 丰满的人妻完整版| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲七黄色美女视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国内精品久久久久久久电影| 精品人妻在线不人妻| 脱女人内裤的视频| 欧美日韩乱码在线| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美黑人精品巨大| 国产激情欧美一区二区| 亚洲七黄色美女视频| 身体一侧抽搐| 少妇的丰满在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲国产欧美网| 午夜福利在线观看吧| 97碰自拍视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲成人免费电影在线观看| 国内精品久久久久久久电影| 欧美黑人精品巨大| 日日夜夜操网爽| 国产成人精品无人区| 12—13女人毛片做爰片一| 少妇的丰满在线观看| 岛国视频午夜一区免费看| 91九色精品人成在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲熟女毛片儿| 又大又爽又粗| netflix在线观看网站| 久热这里只有精品99| 成人手机av| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲国产中文字幕在线视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 桃红色精品国产亚洲av| 欧美不卡视频在线免费观看 |