miR-1292-5p對肝癌SNU-449細胞自噬與增殖及細胞周期影響

江卓 唐杰 劉彩林 于永敏 高嶺

[摘要]目的 研究miR-1292-5p對肝癌SNU-449細胞自噬、增殖及細胞周期影響。方法 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測肝癌HuH7、HCC9204、SNU-449細胞和正常肝L-02細胞中miR-1292-5p表達水平。肝癌SNU-449細胞中轉(zhuǎn)染miR-1292-5p mimics，細胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8）檢測細胞增殖，碘化丙啶（PI）單染法檢測細胞周期，膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）雙染法檢測細胞凋亡，蛋白質(zhì)印跡法檢測相關(guān)蛋白表達。以蛋白激酶B/磷脂酰肌醇3激酶（Akt/PI3K）信號激活劑處理轉(zhuǎn)染miR-1292-5p mimics以后的肝癌SNU-449細胞，以同樣方法檢測上述指標(biāo)。結(jié)果 肝癌HuH7、HCC9204、SNU-449細胞中miR-1292-5p表達水平低于正常肝L-02細胞（F=260.440，q=13.159～20.505，P<0.05）。轉(zhuǎn)染miR-1292-5p mimics后的肝癌SNU-449細胞存活率降低，G0/G1期比例升高，凋亡率升高，C-Caspase-3、P21蛋白表達水平升高，Cyclin D1、Beclin1、ATG5蛋白表達水平降低，差異有顯著性（F=27.553～611.793，q=7.116～24.042，P<0.05）;p-Akt、p-PI3K蛋白表達水平降低，差異有顯著性（F=42.043、60.545，q=10.307、7.603，P<0.05）。Akt/PI3K信號激活劑可逆轉(zhuǎn)miR-1292-5p mimics對肝癌SNU-449細胞增殖、周期、凋亡和相關(guān)蛋白表達影響（t=5.154～15.949，P<0.05）。結(jié)論 上調(diào)miR-1292-5p可以抑制肝癌SNU-449細胞自噬和增殖，阻滯細胞周期，誘導(dǎo)細胞凋亡，機制可能與抑制Akt/PI3K信號激活有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]肝腫瘤;微RNAs;自噬;細胞周期;細胞增殖

[中圖分類號]R735.7

[文獻標(biāo)志碼]A

[文章編號]2096-5532（2021）02-0234-06

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of miR-1292-5p on the autophagy， proliferation， and cell cycle of SNU-449 hepatoma cells. ?Methods Quantitative real-time PCR was used to measure the expression level of miR-1292-5p in HuH7， HCC9204， and SNU-449 hepatoma cells and normal L-02 liver cells. SNU-449 hepatoma cells were transfected with miR-1292-5p mimics; CCK-8 assay was used to measure cell proliferation， propidium iodide single staining was used to observe cell cycle， Annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide double staining was used to measure apoptosis， and Western blotting was used to measure the expression of related proteins. The SNU-449 hepatoma cells transfected with miR-1292-5p mimics were treated with protein kinase B/phosphatidylinositol 3-kinase signal activator， and the same methods were used to measure the above indicators. Results The expression level of miR-1292-5p in HuH7， HCC9204， and SNU-449 hepatoma cells was lower than that in normal L-02 liver cells （F=260.440，q=13.159-20.505，P<0.05）. The SNU-449 hepatoma cells transfected with miR-1292-5p mimics showed a significant reduction in cell viability， a significant increase in the proportion of cells in G0/G1 phase， and a significant increase in apoptosis rate， as well as significant increases in the protein expression levels of C-caspase-3 and P21 and significant reductions in the protein expression levels of Cyclin D1， Beclin1， and ATG5 （F=27.553-611.793，q=7.116-24.042，P<0.05）， with significant reductions in the protein expression levels of p-Akt and p-PI3K （F=42.043，60.545;q=10.307，7.603;P<0.05）. The Akt/PI3K signal activator reversed the influence of miR-1292-5p mimics on proliferation， cell cycle， apoptosis， and expression of related proteins in SNU-449 hepatoma cells （t=5.154-15.949，P<0.05）.?Conclusion Upregulation of miR-1292-5p can inhibit the autophagy and proliferation of SNU-449 hepatoma cells， block the cell cycle， and induce cell apoptosis， possibly by inhibiting the activation of Akt/PI3K signaling.

[KEY WORDS]liver neoplasms; microRNAs; autophagy; cell cycle; cell proliferation

雖取得明顯進步，但病人生活質(zhì)量仍然較差[1]。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌惡性進展與基因差異表達有關(guān)，這些基因參與調(diào)控肝癌細胞的生物學(xué)行為，可成為腫瘤治療的潛在分子靶點[2]。因此，研究影響肝癌進展的分子機制可為靶向治療提供分子靶點。miRNA可影響腫瘤進展，認為調(diào)控miRNA表達可能是有效抑制腫瘤惡性發(fā)生發(fā)展的途徑之一[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)miR-1292-5p在胃癌中低表達，上調(diào)miR-1292-5p可抑制胃癌細胞惡性生長，表明miR-1292-5p可能是一種腫瘤抑制因子[5]。然而，miR-1292-5p在肝癌中作用及機制尚未見報道。Akt/PI3K信號通路與多種腫瘤進展有關(guān)，Akt/PI3K信號通路過度激活可影響腫瘤細胞的惡性表型[6-8]。本次實驗首先探討miR-1292-5p在肝癌細胞和正常肝細胞中的表達差異，然后首次研究上調(diào)miR-1292-5p對肝癌細胞增殖、自噬、周期和凋亡等影響，為靶向基因治療肝癌提供可能方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

肝癌HuH7、HCC9204和SNU-449細胞均購自廣州賽庫生物技術(shù)有限公司;正常肝L-02細胞購自通派（上海）生物科技有限公司;C-Caspase-3抗體、Beclin1抗體均購自Cell Signaling Technology;miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒、SYBR Premix Ex Taq miRNA kit購自大連TAKARA;p-Akt抗體、p-PI3K抗體和Cyclin D1抗體購自美國BD公司;miR-1292-5p mimics、mimics control購自北京科忠智生物技術(shù)開發(fā)有限公司;ATG5抗體、PI3K抗體和P21抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Akt抗體購自美國Abcam。

1.2 實驗方法

1.2.1 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測肝癌細胞中miR-1292-5p表達 在肝癌HuH7、HCC9204、SNU-449細胞和正常肝L-02細胞中添加Trizol試劑，分別提取各組細胞總RNA，以無RNA酶水將RNA溶解，以-20 ℃保存?zhèn)溆?。以miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄，體系含有：10 μL的2×miRNA L-RT Solution mix、200 ng的miRNA、1.5 μL的miRNA L-RT Enzyme mix以及1 μL的Stem-loop primer，最后添加RNase-free water至20 μL?；旌虾?，放在16 ℃溫浴30 min，37 ℃溫浴30 min，85 ℃反應(yīng)5 min，cDNA以-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肧YBR Premix Ex Taq miRNA kit進行實時定量PCR，PCR體系中含有：1 μL的 Forward Primer、1 μL的Reverse Primer、12.5 μL的SYBR Premix Ex TaqⅡ、1 μL的cDNA，最后添加ddH2O至25 μL。PCR的反應(yīng)程序設(shè)置為：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，55 ℃、30 s，共45個循環(huán)。內(nèi)參照為U6，按照2-△△Ct法計算miR-1292-5p表達變化。引物序列見表1。

1.2.2 細胞分組及處理 在肝癌SNU-449細胞中分別轉(zhuǎn)染miR-1292-5p mimics、mimics control，記為miR-1292-5p組和miR-NC組，細胞轉(zhuǎn)染步驟參照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說明書進行。把沒有轉(zhuǎn)染的細胞設(shè)置為Control組。Control（A組）、miR-NC（B組）、miR-1292-5p（C組）細胞培養(yǎng)48 h之后，按照1.2.1中qRT-PCR方法測定miR-1292-5p表達。

1.2.3 CCK-8測定細胞增殖 Control、miR-NC、miR-1292-5p組細胞培養(yǎng)48 h后，每孔分別加入15 μL的CCK-8，于37 ℃條件下結(jié)合4 h。檢測490 nm波長處每個孔的OD值，以Control組細胞存活率為100%，分析miR-NC、miR-1292-5p組細胞存活率變化。

1.2.4 PI單染法測定細胞周期 Control、miR-NC、miR-1292-5p組細胞培養(yǎng)48 h之后，加入4 ℃預(yù)冷后的PBS液洗滌2次。在細胞內(nèi)加入體積分數(shù)0.75的乙醇，將細胞固定1 h。以9 400 r/min離心10 min，棄上清溶液，再添加PBS溶液重懸，加入PI染液混合，上流式細胞儀測定細胞周期。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI雙染法測定細胞凋亡

Control、miR-NC、miR-1292-5p組細胞培養(yǎng)48 h之后，收集各組細胞用冰預(yù)冷后的PBS溶液懸浮2次，最后將細胞懸浮在500 μL的Binding Buffer溶液中，再添加10 μL的PI以及Annexin V-FITC，在室溫中孵育結(jié)合15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡變化。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡方法測定C-Caspase-3、Beclin1、ATG5、P21、Cyclin D1、p-Akt、Akt、PI3K、p-PI3K蛋白表達 Control、miR-NC、miR-1292-5p組細胞培養(yǎng)48 h之后，收集細胞，加入細胞裂解溶液，提取總蛋白，按照BCA方法檢測蛋白濃度。在蛋白內(nèi)加入1/4體積的5×Loading Buffer溶液，于100 ℃反應(yīng)5 min。分別制備100 g/L的分離膠及體積分數(shù)0.05的濃縮膠，每個泳道內(nèi)加入30 μg的蛋白樣品，濃縮膠內(nèi)電壓為80 V，分離膠內(nèi)電壓為120 V，等到溴酚藍染料點樣到分離膠的底部以后，終止電泳。將分離膠切下，在4 ℃條件下以170 mA的電流轉(zhuǎn)膜。電轉(zhuǎn)以后的PVDF膜放在制備好的封閉液（其中含有體積分數(shù)0.05的牛血清清蛋白）內(nèi)，在室溫環(huán)境中結(jié)合1 h，然后將PVDF膜放在稀釋以后的一抗孵育液內(nèi)，于4 ℃條件下過夜，然后將PVDF膜放在二抗稀釋液中，在室溫中結(jié)合1 h。以ECL方法發(fā)光，Image Lab分析條帶的OD值，以β-actin作為參照，分析目的蛋白表達水平。二抗按照1∶4 000稀釋，C-Caspase-3、Beclin1、ATG5、P21、Cyclin D1、p-Akt、Akt、PI3K、p-PI3K等一抗分別按照1∶400、1∶800、1∶800、1∶1 000、1∶1 000、1∶600、1∶1 000、1∶1 000、1∶600稀釋。

1.2.7 Akt/PI3K信號激活劑對上調(diào)miR-1292-5p的肝癌細胞增殖、周期、凋亡和自噬影響檢測 取轉(zhuǎn)染miR-1292-5p mimics后的肝癌SNU-449細胞，用含有Akt/PI3K信號激活劑IGF-1（50 μg/L）的細胞培養(yǎng)液處理培養(yǎng)，記為miR-1292-5p+IGF-1組（D組），以miR-1292-5p組為對照（C組），以CCK-8方法檢測細胞增殖（步驟同1.2.3），PI單染法檢測細胞周期（步驟同1.2.4），Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡（步驟同1.2.5），蛋白質(zhì)印跡檢測C-Caspase-3、Beclin1、ATG5、P21、Cyclin D1、p-Akt、Akt、PI3K、p-PI3K蛋白表達（步驟同1.2.6）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料數(shù)據(jù)用x2±s表示，兩組間差異比較采用t檢驗，多組間差異比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-1292-5p在肝癌細胞中的表達

L-02、HuH7、HCC9204、SNU-449細胞中miR-1292-5p表達量分別為1.00±0.11、0.36±0.02、0.47±0.05和0.20±0.04，肝癌HuH7、HCC9204、SNU-449細胞中miR-1292-5p表達水平低于正常肝L-02細胞（F=260.440，q=13.159～20.505，P<0.05）;肝癌SNU-449細胞中miR-1292-5p表達水平低于肝癌HuH7、HCC9204細胞（q=10.733、12.650，P<0.05）。選用表達水平最低的 SNU-449細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 miR-1292-5p上調(diào)對肝癌SUN-449細胞生物學(xué)行為影響

結(jié)果表明，與miR-NC組比，miR-1292-5p組肝癌SNU-449細胞中miR-1292-5p表達水平升高，細胞存活率降低，G0/G1期比例升高，細胞凋亡率升高，C-Caspase-3、P21蛋白表達水平均升高，Cyclin D1、Beclin1、ATG5蛋白表達水平明顯降低（F=27.553～611.793，q=7.116～24.042，P<0.05）。miR-1292-5p mimics可上調(diào)肝癌SNU-449細胞中miR-1292-5p表達水平，抑制其細胞增殖和自噬，阻滯細胞周期，誘導(dǎo)細胞凋亡。見圖1和表2。

2.3 miR-1292-5p上調(diào)對肝癌細胞中Akt/PI3K信號通路相關(guān)蛋白影響

結(jié)果表明，與miR-NC組比，miR-1292-5p組肝癌SNU-449細胞中p-Akt、p-PI3K蛋白表達水平降低（F=42.043、60.545，q=10.307、7.603，P<0.05）。提示miR-1292-5p mimics可以抑制肝癌SNU-449細胞中Akt/PI3K信號通路激活。見圖2。

2.4 Akt/PI3K信號通路激活劑逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-1292-5p對肝癌細胞生物學(xué)行為和相關(guān)蛋白影響

結(jié)果表明，與miR-1292-5p組比較，miR-1292-5p+IGF-1組肝癌SNU-449細胞存活率升高，G0/G1期細胞比例、凋亡率、細胞中C-Caspase-3與P21蛋白表達水平均降低，Beclin1、ATG5、Cyclin D1、p-Akt、p-PI3K蛋白表達水平升高，差異均有顯著性（t=5.154～15.949，P<0.05）。提示Akt/PI3K信號通路激活劑可以逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-1292-5p對肝癌SNU-449細胞增殖、自噬的抑制作用，促進細胞周期進展，抑制細胞凋亡。見圖3和表3。

3 討 論

miRNA已成為生命科學(xué)研究的重點和熱點，miRNA參與調(diào)控多種疾病進展，可能成為疾病治療的分子靶點[9-12]。miRNA表達改變與腫瘤細胞惡性程度有關(guān)，通過人為改變miRNA的表達能夠改變腫瘤細胞的惡性表型[13]。已有研究表明，miR-1292-5p在胃癌中發(fā)揮類似抑癌基因作用[5]。本文結(jié)果顯示，肝癌細胞中miR-1292-5p表達水平低于正常肝細胞，并且上調(diào)miR-1292-5p可降低肝癌細胞增殖能力，提示miR-1292-5p在肝癌進展中可能發(fā)揮抑癌作用，與其在胃癌中的結(jié)果相一致。

本實驗結(jié)果還表明，上調(diào)miR-1292-5p后的肝癌細胞G0/G1期比例升高，細胞凋亡率升高，說明上調(diào)miR-1292-5p可阻滯肝癌細胞周期并誘導(dǎo)細胞凋亡。細胞周期分為分裂期和分裂間期，G0/G1期是細胞分裂間期中的關(guān)鍵調(diào)控點，其受到多種蛋白的作用[14]。Cyclin D1促進細胞從G1期向S期進展，Cyclin D1表達上調(diào)促進細胞周期進展[15]。P21是細胞周期的抑制因子，P21表達上調(diào)能夠阻滯細胞周期[16]。Caspase蛋白家族是細胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，Caspase-3是Caspase蛋白家族成員，位于細胞凋亡的下游，Caspase-3被活化后形成C-Caspase-3可不可逆地誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生[17]。本實驗表明，上調(diào)miR-1292-5p后的肝癌細胞中C-Caspase-3、P21表達上調(diào)，而Cyclin D1表達下調(diào)，提示上調(diào)miR-1292-5p可誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，阻滯細胞周期進展，這與細胞周期和凋亡檢測結(jié)果一致。

細胞自噬是機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持的重要途徑。腫瘤進展與細胞自噬的關(guān)系目前還不十分明確，且存在較大爭議，一部分人認為，自噬可以延緩腫瘤細胞凋亡;還有一部分人認為自噬能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡[18]。Beclin1、ATG5均為自噬標(biāo)志蛋白，其表達水平升高表明細胞自噬水平升高[19]。本實驗結(jié)果顯示，上調(diào)miR-1292-5p后的肝癌細胞Beclin1、ATG5蛋白表達水平明顯降低，提示上調(diào)miR-1292-5p能夠抑制肝癌細胞自噬。

Akt/PI3K是一個具有多種功能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其參與調(diào)控腫瘤細胞增殖以及凋亡[20]。Akt/PI3K信號在自噬中的作用研究較多，但結(jié)果存在分歧[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-37通過抑制Akt/PI3K信號誘導(dǎo)肝癌細胞自噬[22]。而下調(diào)lncRNA HAGLROS通過抑制Akt/PI3K信號通路降低肝癌細胞自噬水平[22]。本實驗結(jié)果顯示，上調(diào)miR-1292-5p后的肝癌細胞中Akt/PI3K信號通路激活水平下降，并且Akt/PI3K信號激活劑可以逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-1292-5p對肝癌細胞增殖和自噬抑制作用、凋亡抑制作用和周期阻滯作用，這說明上調(diào)miR-1292-5p可能通過抑制Akt/PI3K信號通路抑制肝癌細胞自噬。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1292-5p抑制胃癌細胞生長與靶向調(diào)控DEK基因表達有關(guān)[5]。因此，我們推測，miR-1292-5p可能是通過靶向調(diào)控DEK的表達影響Akt/PI3K通路的激活。

綜上所述，miR-1292-5p在肝癌中可能發(fā)揮抑制作用，其能夠抑制肝癌細胞自噬、增殖，阻滯細胞周期，誘導(dǎo)細胞凋亡，機制可能與下調(diào)Akt/PI3K信號通路激活水平有關(guān)。本實驗沒有分析miR-1292-5p在肝癌組織中的表達及其表達改變與肝癌病人臨床病理特征之間的關(guān)系，尚未對miR-1292-5p通過何種靶向機制影響Akt/PI3K通路進行詳細探討，以后會對上述部分進行深入探討和補充。

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（本文編輯 于國藝）