福林酚法測(cè)定檀香橄欖中總多酚含量的研究

吳曉青，孫燕麗，鐘碧萍

（福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州350007）

橄欖又名青果，為橄欖科植物橄欖（Canarium album Raeusch.）的果實(shí)，是一種藥食兩用的水果［1］。有研究表明：橄欖中所含的主要成分為多酚類化合物，如沒(méi)食子酸、并沒(méi)食子酸、短葉蘇木酚等，具有增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗病毒、抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、解酒護(hù)肝、抑制血糖升高、增加骨密度和骨鈣含量、抗乙肝病毒等作用［2-4］。 福建橄欖產(chǎn)量居全國(guó)之首，故開發(fā)橄欖多酚產(chǎn)品對(duì)帶動(dòng)和促進(jìn)橄欖的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。 目前對(duì)于橄欖總多酚含量測(cè)定的方法多采用福林酚（folin-ciocalteu，F(xiàn)C）法，但隨著產(chǎn)地或品種的不同，試驗(yàn)條件各不相同［5-7］。 檀香橄欖是橄欖科橄欖屬下的植物，為福建省名貴的果樹，原產(chǎn)于閩清縣安仁溪一帶，宋朝開始栽培，已有數(shù)百年的栽培歷史，現(xiàn)已發(fā)展到閩侯、福州郊區(qū)、長(zhǎng)樂(lè)、連江、永泰、莆田、仙游及漳浦等地栽培。 故本研究建立FC 法測(cè)定檀香橄欖中總多酚的含量，為進(jìn)一步篩選閩產(chǎn)橄欖品種，開發(fā)橄欖多酚產(chǎn)品提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-1800PC DS2 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；AL 204 電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ-600GKDV 型高功率恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHA-B 恒溫振蕩器（常州國(guó)華電器有限公司）；DS-1 高速組織搗碎機(jī)（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 試藥 檀香橄欖（產(chǎn)地：福建閩清，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室范世明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為橄欖科植物橄欖（Canarium album Raeusch.）的果實(shí)；沒(méi)食子酸對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào) B20851，純度≥98%）；碳酸鈉、FC、無(wú)水乙醇等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 取橄欖鮮果適量，去核，60 ℃熱風(fēng)干燥，粉碎（過(guò)40 目篩），即得橄欖粉末；精密稱取橄欖粉末約1 g，加60%乙醇溶液30 mL，40 ℃水浴超聲提取25 min，趁熱過(guò)濾，取2 mL 濾液至50 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，即得供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品0.100 8 g，置 100 mL 量瓶中，蒸餾水溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得1 mg／mL 沒(méi)食子酸對(duì)照品貯備液；精密吸取對(duì)照品貯備液2.5 mL 至100 mL 量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，即得濃度約為25 μg／mL的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液。

2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，分別置于刻度離心管中；加FC試劑 2.0 mL、10%碳酸鈉6 mL，搖勻，加水稀釋至25.0 mL，在30 ℃恒溫振蕩器中反應(yīng)1 h，以溶劑試劑為空白，反應(yīng)后在600～900 nm 波長(zhǎng)范圍掃描。結(jié)果表明：兩種溶液在765 nm 處均有最大吸收峰，故選擇 765 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)。 結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品溶液和供試品溶液吸收光譜圖

2.4 FC 法測(cè)定條件的優(yōu)化

2.4.1 FC 試劑用量的考察 取1.0 mL 供試品溶液至刻度離心管中，分別加入FC 試劑0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，加 10% Na2CO3溶液 6.0 mL，加水稀釋至25.0 mL，搖勻，在30 ℃恒溫振蕩器中反應(yīng)1 h，于765 nm 處測(cè)定吸光度。 結(jié)果表明：當(dāng)FC 試劑加入量為2.0 mL 時(shí)吸光度趨于穩(wěn)定，故確定FC 試劑用量為 2 mL。 結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 FC 試劑用量考察圖

2.4.2 10% Na2CO3溶液用量的考察 取1.0 mL 供試品溶液至刻度離心管中，加FC 試劑2.0 mL，分別加入 10% Na2CO3溶液 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL，加水稀釋至25.0 mL，搖勻，在30 ℃恒溫振蕩器中反應(yīng)1 h，于765 nm 處測(cè)定吸光度。 結(jié)果表明：當(dāng)10% Na2CO3溶液加入量為4.0 mL 時(shí)吸光度達(dá)到最大，而加入量大于6.0 mL 時(shí)，吸光度反而開始下降。故確定10% Na2CO3溶液加入量為4.0 mL。 結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 10% Na2CO3 溶液用量考察圖

2.4.3 反應(yīng)溫度的考察 分別取1.0 mL 供試品溶液至刻度離心管中，加FC 試劑2.0 mL，再加入10%Na2CO3溶液 4.0 mL，加水定容至 25.0 mL，搖勻，分別在 30、40、50、60 ℃的恒溫振蕩器中反應(yīng)1 h，于765 nm 處測(cè)定吸光度。 結(jié)果表明：相同時(shí)間內(nèi)，在50 ℃恒溫振蕩器中反應(yīng)的吸光度最大，反應(yīng)最完全，故確定供試品溶液反應(yīng)溫度為50 ℃。 結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.4.4 反應(yīng)時(shí)間的考察 分別取1.0 mL 供試品溶液至刻度離心管中，加入FC 試劑2.0 mL，10%Na2CO3溶液 4.0 mL，加水定容至 25.0 mL，搖勻，在50 ℃恒溫振蕩器中分別反應(yīng) 15、30、45、60 min 后，于765 nm 處測(cè)定吸光度。結(jié)果表明：反應(yīng)30 min 時(shí)吸光度達(dá)到穩(wěn)定，故確定供試品溶液反應(yīng)時(shí)間為30 min。 結(jié)果見(jiàn)圖 5。

圖4 反應(yīng)溫度考察圖

圖5 反應(yīng)時(shí)間考察圖

2.4.5 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)與結(jié)果分析 為進(jìn)一步考察各因素之間的交互作用，采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化，分別精密量取1.0 mL 供試品溶液，其他實(shí)驗(yàn)條件一致，對(duì) FC 試劑用量（A）、10% Na2CO3溶液用量（B）、反應(yīng)溫度（C）和反應(yīng)時(shí)間（D） 4 個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。 實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)表2 進(jìn)行直觀分析可知：極差大小顯示各因素的影響作用依次為A＞B＞D＞C，最佳顯色條件為 A3B1C2D2，即 1.0 mL 供試品溶液中加 FC 試劑3.0 mL，10%碳酸鈉溶液 4.0 mL，40 ℃恒溫振蕩器中反應(yīng)45 min。 由于反應(yīng)條件最佳理論組合不在9 個(gè)實(shí)驗(yàn)中，故追加驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。 取3 批次的供試品溶液，分別取1.0 mL，按最佳反應(yīng)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)后測(cè)得的吸光度（0.569、0.568、0.564）均略高于正交試驗(yàn)中試驗(yàn)號(hào) 7 的測(cè)定值（0.562、0.563、0.559），因最佳組合溫度更低，更節(jié)能，故選擇最佳理論組合作為FC 法測(cè)定閩產(chǎn)檀香橄欖總多酚含量的條件。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性關(guān)系的考察 精密量取對(duì)照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置刻度離心管中，按檀香橄欖總多酚含量測(cè)定的最佳條件，以溶劑試劑為空白，測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖6?；貧w方程為：y＝0.1350x＋0.006 9，r＝0.999 7，表明沒(méi)食子酸在 1.008 0～5.040 0 μg／mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取同一對(duì)照品溶液1.0 mL，共6 份，分別置刻度離心管中，按檀香橄欖總多酚含量測(cè)定的最佳條件，測(cè)定吸光度，吸光度分別為 0.569、0.567、0.559、0.562、0.565、0.564，RSD＝0.63%。 結(jié)果表明儀器精密度良好。

圖6 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批閩產(chǎn)檀香橄欖粉約1 g，共6 份，按“2.1”項(xiàng)下和檀香橄欖總多酚含量測(cè)定的最佳條件測(cè)定吸光度值，計(jì)算閩產(chǎn)檀香橄欖總多酚含量，結(jié)果分別為7.80%、7.62%、7.59%、7.79%、7.72%和7.76%，檀香橄欖總多酚的平均含量為 7.71%，RSD＝1.18%。 結(jié)果表明該方法重復(fù)性符合要求。

2.5.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液1.0 mL，按檀香橄欖總多酚含量測(cè)定的最佳條件，顯色后室溫下放置，于 0、2、4、6、8、12 h 測(cè)定吸光度，吸光度分別為0.565、0.568、0.569、0.567、0.564、0.560，RSD＝0.58%。結(jié)果表明反應(yīng)后放置12 h 均穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密稱取同一批次檀香橄欖粉約0.5 g，共6 份，分別精密加入約38.55 mg沒(méi)食子酸對(duì)照品，按“2.1”項(xiàng)下和檀香橄欖總多酚含量測(cè)定的最佳條件測(cè)定吸光度值，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表 3。 結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于檀香橄欖總多酚的定量分析。

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.6 檀香橄欖中總多酚含量測(cè)定 分別取3 批次橄欖，每批次平行測(cè)定3 份，按“2.1”項(xiàng)下和檀香橄欖總多酚含量測(cè)定的最佳條件測(cè)定吸光度值，計(jì)算總多酚含量。 結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 檀香橄欖中總多酚含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

FC 法是利用在堿性溶液中，酚類化合物可將鎢鉬酸還原（使W6+變?yōu)閃5+），生成藍(lán)色的化合物，顏色的深淺與酚含量成正比的原理進(jìn)行測(cè)定總多酚含量。 本實(shí)驗(yàn)以閩清檀香橄欖為測(cè)定對(duì)象，首次采用單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)對(duì)FC 法的測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化。 根據(jù)比爾定律，吸光度與吸光物質(zhì)量的濃度成正比，對(duì)于同一供試品溶液，吸光度越大，說(shuō)明反應(yīng)越完全，故本實(shí)驗(yàn)以吸光度作為衡量測(cè)定條件優(yōu)劣的評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立了檀香橄欖中總多酚的含量測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)首次采用單因素結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化FC 法測(cè)定檀香橄欖總多酚的條件，充分考慮各因素的交互作用，建立的方法穩(wěn)定、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，可作為檀香橄欖總多酚含量的測(cè)定方法，為后續(xù)閩產(chǎn)橄欖多酚產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。