bFGF對大鼠急性脊髓損傷組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）信號通路相關(guān)蛋白CHOP、Caspase12表達(dá)的影響

葛小剛　　蔡旗旗　　牟財國　　蔡楊陽

[摘要] 目的 探討堿性成纖維細(xì)胞因子（bFGF）對大鼠急性脊髓損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）信號通路相關(guān)蛋白CHOP、Caspase12表達(dá)的影響。 方法 選取SD大鼠90只分為三組，每組各30只。Sham組為假手術(shù)組;SCI組采用HI-0400脊髓打擊器制備急性脊髓損傷模型;bFGF組在SCI組基礎(chǔ)上予bFGF蛛網(wǎng)膜下隙給藥，評估損傷后不同時點(diǎn)后肢運(yùn)動功能評分、脊髓細(xì)胞凋亡及脊髓組織CHOP、Caspase12表達(dá)情況。 結(jié)果 bFGF組損傷后21 d、28 d的BBB評分分別為（12.48±0.42）分、（13.53±0.47）分，均高于SCI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.533、9.963，P<0.05）。bFGF組損傷后1 d、3 d、7 d細(xì)胞凋亡分別為（7.13±0.45）%、（12.42±1.21）%、（10.31±1.27）%，均低于SCI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.684、8.945、6.507，P<0.05）。bFGF組CHOP及Caspase12表達(dá)分別為（7.66±0.74）分、（7.52±0.87）分，顯著低于SCI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.348、8.653，P<0.05）。 結(jié)論 bFGF可通過抑制ERS相關(guān)蛋白CHOP、Caspase12的表達(dá)，對大鼠急性脊髓損傷起保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 堿性成纖維細(xì)胞因子;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;大鼠急性脊髓損傷;保護(hù)作用;脊髓損傷評分;白細(xì)胞介素1-β轉(zhuǎn)換酶家族12

[中圖分類號] R363? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）11-0036-04

Effect of bFGF on the expression of proteins CHOP and Caspase12 related to endoplasmic reticulum stress（ERS） signaling pathway in acute spinal cord injury in rats

GE Xiaogang CAI Qiqi MOU Caiguo? ?CAI Yangyang

Department of Vascular Surgery， Taizhou First People′s Hospital in Zhejiang Province， Taizhou? ?318020， China

[Abstract] Objective To explore the effects of basic fibroblast growth factor（bFGF） on the expression of proteins CHOP and Caspase12 related to the endoplasmic reticulum stress（ERS） signaling pathway in acute spinal cord injury in rats. Methods A total of 90 SD rats were selected and divided into 3 groups， with 30 rats in each group. The sham group underwent the sham operation. The SCI group underwent the HI-0400 spinal cord percussion device to make acute spinal cord injury models. bFGF was administered to the subarachnoid space in the bFGF group on the basement of the SCI group. The hind legs motor function， spinal cord cell apoptosis and the expression of spinal cord tissue CHOP and Caspase12 at different times after injury were evaluated. Results The BBB scores of the bFGF group were （12.48±0.42） points and （13.53±0.47） points at 21 days and 28 days after injury， which were significantly higher than those in the SCI group， with statistical significance（t=7.533， 9.963; P<0.05）. The cell apoptosis in the bFGF group at 1 day， 3 days， and 7 days after injury was （7.13±0.45）%， （12.42±1.21）%， （10.31±1.27）%， respectively， which were lower than those of the SCI group， the differences were statistically significant（t=4.684， 8.945， 6.507; P<0.05）. The CHOP and Caspase12 expression in the bFGF group were （7.66±0.74） points and （7.52±0.87） points， respectively， which were significantly lower than those in the SCI group， with statistical significance（t=12.348， 8.653; P<0.05）. Conclusion bFGF can protect rats from acute spinal cord injury by inhibiting the expression of ERS-related proteins CHOP and Caspase12.

[Key words] Basic fibroblast growth factor; Endoplasmic reticulum stress; Acute spinal cord injury in rats; Protective effect; Basso，Beattie & Bresnahan locomotor rating scale; Cystein-asparate protease 12

作為臨床常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，脊髓損傷發(fā)病率、致殘率高，且隨著近年來交通及建筑業(yè)的不斷發(fā)展，其發(fā)病率逐年攀升。脊髓損傷主要病理機(jī)制為原發(fā)性損傷后的繼發(fā)性損傷，其中脊髓神經(jīng)元凋亡在脊髓繼發(fā)損傷中有重要作用[1]，且直接影響脊髓神經(jīng)功能。最新研究結(jié)果顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）是細(xì)胞凋亡的又一途徑，C/EBP同源性蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）是其特異性轉(zhuǎn)錄因子[2]。作為新型神經(jīng)營養(yǎng)因子，堿性成纖維細(xì)胞因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞生長及分化，通過外源性bFGF給藥能夠?qū)顾钃p傷修復(fù)起促進(jìn)作用[3]。目前，關(guān)于bFGF對ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡研究較少，本研究選擇大鼠90只構(gòu)建急性脊髓損傷模型，旨在分析bFGF通過ERS信號通路對大鼠急性脊髓損傷的早期保護(hù)作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

90只健康SD雌性大鼠購自上海市公共衛(wèi)生臨床中心[生產(chǎn)許可SCXK（滬）2020-0002]，體重210～240 g，平均（224±15）g;鼠齡6～9周，平均（7.31±0.33）周。bFGF購自北京同立海源生物科技有限公司，兔抗CHOP購自杭州聯(lián)科美訊生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，TUNEL試劑盒購自艾美捷科技有限公司。嚴(yán)格按照醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理及使用指南完成相關(guān)操作，本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)動物管理審批，符合醫(yī)學(xué)倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 急性脊髓損傷模型制備? 所有大鼠術(shù)前12 h禁食，按照40 mg/kg的劑量給予2%戊巴比妥鈉麻醉，將T10棘突作為中心，充分暴露硬脊膜，選擇背部正中位置行一3 cm的切口。制備大鼠急性脊髓損傷模型采用HI-0400脊髓打擊器（北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司），將力度控制在200 kdyn/cm2。置入PE10導(dǎo)管（北京西美杰科技有限公司）至蛛網(wǎng)膜下隙，選擇與脊髓損傷遠(yuǎn)端相距1 cm的位置，查看是否存在腦脊液流出，確認(rèn)有，則采用1-0絲線（義烏市英明線業(yè)有限公司）縫合切口。在切口周圍皮膚處放置導(dǎo)管，固定后進(jìn)行打擊處理，直至大鼠出現(xiàn)雙下肢及尾部痙攣性抖動。損傷后補(bǔ)液采用生理鹽水。按照200 kU/kg的劑量于大鼠腹腔給予青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20013036）注射，預(yù)防感染。每天對大鼠進(jìn)行2～3次膀胱按摩。

1.2.2 分組及給藥? 將90只大鼠隨機(jī)分為三組，每組各30只，bFGF組予bFGF蛛網(wǎng)膜下隙給藥，SCI組為急性脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）組，Sham組為假手術(shù)組。bFGF組損傷后采用IM-9B微量注射器[孚光精儀（中國）有限公司]經(jīng)導(dǎo)管給予20 μL的bFGF，第1周1次/d，1周后每2周給藥1次。SCI組在相同時點(diǎn)給予生理鹽水注入，注入量同bFGF組。Sham組處理僅打開椎板，不進(jìn)行脊髓打擊。

1.2.3 脊髓標(biāo)本采集? 麻醉后，將大鼠放置于灌流池內(nèi)，取仰臥位，以手術(shù)剪剪開大鼠胸腔，穿刺左心室，到達(dá)主動脈，予4%多聚甲醛（上海信帆生物科技有限公司）灌注固定，提取3 cm脊髓組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋后，切片厚度控制在5 μm。

1.3觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 后肢運(yùn)動功能評分? 后肢運(yùn)動功能采用大鼠脊髓損傷評分（Basso，Beattie & Bresnahan locomotor rating scale，BBB scale）評估大鼠損傷后7 d、14 d、21 d及28 d的運(yùn)動功能，早期后肢關(guān)節(jié)活動評分范圍為0～7分，中后期主要評估后肢步態(tài)及協(xié)調(diào)功能，分值為8～13分，最后對大鼠爪子的精細(xì)活動予以評估，分值范圍為14～21分。后肢運(yùn)動功能完全正常計為21分[4-5]。

1.3.2 脊髓細(xì)胞凋亡? 采用DNA斷裂的原位末端標(biāo)記[Terminal dexynucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL]染色檢測脊髓細(xì)胞凋亡，隨機(jī)選擇1 d、3 d、7 d各1張脊髓組織切片，按照試劑盒說明進(jìn)行染色處理，并在Primovert光學(xué)顯微鏡（蘇州長南精密技術(shù)有限公司）下對結(jié)果進(jìn)行觀察。染色處理后，胞核顯示棕褐色表示陽性細(xì)胞，胞核顯示藍(lán)色表示非凋亡細(xì)胞。

1.3.3 脊髓組織CHOP、Caspase12表達(dá)? 采集大鼠脊髓損傷的組織切片進(jìn)行脫蠟、水化及氧化處理，然后進(jìn)行抗原修復(fù)處理，依次加入兔抗CHOP IgG、抗兔生物素化二抗，分別進(jìn)行辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）孵育、二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯色處理，復(fù)染試劑選用蘇木素。隨機(jī)抽取5個視野的數(shù)據(jù)，將其平均值作為陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用（x±s）表示，采用t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的計量資料用M（QL，QU）表示，采用秩和檢驗(yàn);多組間比較采用F檢驗(yàn);計數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組BBB評分比較

三組大鼠在不同時點(diǎn)的BBB評分比較，Sham組評分最高，與SCI組、bFGF組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;bFGF組損傷后21 d、28 d的BBB評分分別為（12.48±0.42）分、（13.53±0.47）分，均高于SCI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.533、9.963，P<0.05）。

2.2三組細(xì)胞凋亡比較

TUNEL染色結(jié)果顯示，損傷后Sham組各時點(diǎn)均無明顯細(xì)胞凋亡;損傷后SCI組1 d出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡，且凋亡在損傷后3 d最為突出，7 d后逐漸下降。見封三圖2。三組不同時點(diǎn)細(xì)胞凋亡比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;bFGF組損傷后1 d、3 d、7 d細(xì)胞凋亡分別為（7.13±0.45）%、（12.42±1.21）%、（10.31±1.27）%，均低于SCI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.684、8.945、6.507，P<0.05）;組內(nèi)不同時點(diǎn)細(xì)胞凋亡趨勢與TUNEL染色結(jié)果一致。

2.3 三組脊髓組織CHOP、Caspase12表達(dá)比較

損傷后7 d，Sham組CHOP、Caspase12表達(dá)均低于SCI組及bFGF組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;bFGF組CHOP及Caspase12表達(dá)分別為（7.66±0.74）分、（7.52±0.87）分，顯著低于SCI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.348、8.653，P<0.05）。見表3。SCI組CHOP、Caspase12陽性細(xì)胞均多于bFGF組，神經(jīng)元存在脊髓灰質(zhì)及白質(zhì)表達(dá)，免疫染色顯示棕褐色，細(xì)胞核也存在棕褐色。

3 討論

有文獻(xiàn)報道，脊髓損傷后神經(jīng)功能會受到直接影響，具有較高的致殘率與死亡率，其中細(xì)胞凋亡在繼發(fā)性脊髓損傷機(jī)制中有重要作用[6]。臨床強(qiáng)調(diào)，針對脊髓損傷應(yīng)盡早選擇合適的藥物，積極抑制繼發(fā)性凋亡，以實(shí)現(xiàn)疾病逆轉(zhuǎn)。作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號通路，ERS介導(dǎo)的凋亡通路對早期細(xì)胞凋亡能產(chǎn)生積極的影響[7]，其可激活未折疊蛋白反應(yīng)，從而更好地適應(yīng)各項(xiàng)應(yīng)激反應(yīng)，當(dāng)其過度表達(dá)時，則會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

作為脊髓損傷后常用的評估運(yùn)動功能的方法，BBB評分能夠相對準(zhǔn)確、客觀地反映后肢運(yùn)動功能情況。本研究結(jié)果顯示，bFGF組損傷后21 d、28 d的BBB評分分別為（12.48±0.42）分、（13.53±0.47）分，均高于SCI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.533、9.963，P<0.05），提示大鼠脊髓損傷后多伴有嚴(yán)重的后肢癱瘓，予bFGF干預(yù)后，其脊髓損傷后后肢運(yùn)動功能能夠得到良好的恢復(fù)。bFGF組損傷后1 d、3 d、7 d細(xì)胞凋亡分別為（7.13±0.45）%、（12.42±1.21）%、（10.31±1.27）%，均低于SCI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.684、8.945、6.507，P<0.05），提示bFGF可以通過促進(jìn)局部內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而抑制細(xì)胞凋亡。且bFGF可以擴(kuò)張血管或促使關(guān)閉的微血管開放，從而上調(diào)SCI部位血流量，改善其缺血缺氧情況;b FGF可以增強(qiáng)SCI后損傷區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞β1整合素表達(dá)，使內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、識別和遷移加強(qiáng)，從而促進(jìn)血管形成。bFGF組CHOP及Caspase12表達(dá)分別為（7.66±0.74）分、（7.52±0.87）分，顯著低于SCI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.348、8.653，P<0.05）。作為轉(zhuǎn)錄因子家族C/EBP的成員，CHOP是ERS的特異轉(zhuǎn)錄因子[8-9]，當(dāng)出現(xiàn)嚴(yán)重或持續(xù)性的ERS時，CHOP被激活。正常情況下，CHOP呈低表達(dá)，當(dāng)受到ERS影響時，其呈現(xiàn)增高趨勢，促使細(xì)胞凋亡[10]。既往研究結(jié)果顯示，bFGF的生物學(xué)特性廣泛，在神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化及凋亡中均有一定作用，目前被應(yīng)用于神經(jīng)損傷修復(fù)領(lǐng)域[11-13]，成為醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)。白細(xì)胞介素1-β轉(zhuǎn)換酶家族12（Cystein-asparate protease 12，Caspase 12）是一種組成性蛋白，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜，未被激活時主要以酶原形式存在，能夠?qū)RS凋亡產(chǎn)生介導(dǎo)作用[14-16]。在ERS狀態(tài)下，Caspase12會被特定位點(diǎn)裂解激活，從而增加表達(dá)，并與細(xì)胞凋亡Caspase產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。脊髓損傷后早期給予bFGF干預(yù)能夠?qū)?xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制作用，減輕細(xì)胞凋亡的程度。有學(xué)者認(rèn)為，給予bFGF后，ERS途徑被激活，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙，促使神經(jīng)細(xì)胞凋亡[17-19]，此時CHOP在ERS凋亡進(jìn)程中也有一定作用，CHOP表達(dá)被抑制，進(jìn)而阻斷或延緩凋亡的發(fā)生，實(shí)現(xiàn)脊髓損傷修復(fù)的目的[20]。但由于bFGF在ERS信號通路中對大鼠急性脊髓損傷的早期保護(hù)作用較為復(fù)雜，且本研究時間有限，未能對其他信號通路對大鼠急性脊髓損傷后的早期保護(hù)作用進(jìn)行分析，存在一定的局限，在后續(xù)研究中應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，為臨床提供依據(jù)。

綜上所述，bFGF通過ERS信號通路能夠抑制CHOP、Caspase12表達(dá)，發(fā)揮對大鼠急性脊髓損傷的早期保護(hù)作用，對于脊髓損傷的臨床治療及藥物開發(fā)具有一定的參考價值。

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（收稿日期：2020-11-18）