消瘤止痛凝膠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李 江，李爭(zhēng)艷，王 飄，李 嬌，付 鵬，彭 霜，陳凌云*

(1.昆明市中醫(yī)醫(yī)院，昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；3.玉溪市紅塔區(qū)婦幼保健院，玉溪 653100)

消瘤止痛凝膠由土茯苓、姜黃、山慈菇、海風(fēng)藤、蜈蚣等13味藥材經(jīng)提取制成，具有化痰散結(jié)、活血止痛、解毒消瘤的功效，主治腫瘤所致的疼痛。方中土茯苓和姜黃為君藥，土茯苓中的落新婦苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤的效果[1-2]，姜黃中的姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤的特點(diǎn)[3-5]，山慈姑、海風(fēng)藤和蜈蚣藥材具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛的效果[6-8]。

本文以上述兩味君藥中的標(biāo)志性成分落新婦苷和姜黃素為指標(biāo)進(jìn)行了含量測(cè)定研究，對(duì)方中所有被《中國(guó)藥典》2015年版收錄且定有TLC鑒別項(xiàng)的藥味進(jìn)行了研究，建立了5味藥材的鑒別方法。同時(shí)，建立了體外釋放度的檢測(cè)方法，為本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升和藥品生產(chǎn)批文的申報(bào)奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1100型高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司)；Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬科技公司)；T-1000型電子天平(美國(guó)雙杰兄弟有限公司)；AB265-SMETTLER TOLEDO分析天平(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán))；SK2200HP型超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；薄層層析硅膠G板(青島海洋化工分廠、青島鼎康硅膠有限公司)。

1.2試藥 消瘤止痛凝膠，由云南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院提供(批號(hào)分別為20193211、20193212、20193220)。土茯苓對(duì)照藥材(批號(hào)121439-201803)，冰片對(duì)照藥材(批號(hào)111688-201602)，丁香對(duì)照藥材(批號(hào)121039-201405)，肉桂對(duì)照藥材(批號(hào)121363-201703)，細(xì)辛對(duì)照藥材(批號(hào)121204-201606)，落新婦苷對(duì)照品(批號(hào)111798-201504，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.9%)，姜黃素對(duì)照品(批號(hào)110823-201706，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.7%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純(德國(guó)默克公司)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1TLC鑒別

2.1.1土茯苓 取消瘤止痛凝膠5 g，加入甲醇50 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液[9]。另取土茯苓對(duì)照藥材0.2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取不含土茯苓的凝膠0.2 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。按照《中國(guó)藥典》2015年版TLC法(通則0502)實(shí)驗(yàn)，吸取上述3種溶液各8 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以正己烷-乙酸乙酯(8∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以100 mL·L-1硫酸乙醇，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰。結(jié)果顯示，供試品溶液色譜與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上均顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖1A。

2.1.2冰片 取消瘤止痛凝膠5 g，加入三氯甲烷25 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取冰片對(duì)照藥材5 mg，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取不含冰片的凝膠5 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。按照《中國(guó)藥典》2015年版TLC法(通則0502)實(shí)驗(yàn)，分別吸取上述3種溶液4、10、10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以乙酸乙酯-環(huán)己烷(5∶20)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以50 mL·L-1香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰[10]。結(jié)果顯示，供試品溶液色譜與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上均顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖1B。

2.1.3丁香 取消瘤止痛凝膠5 g，加入乙醚25 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右颐? mL使溶解，作為供試品溶液。另取丁香對(duì)照藥材0.2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取不含丁香的凝膠5 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。分別吸取上述3種溶液10、10、4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(9∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以50 mL·L-1香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰[11]。結(jié)果顯示，供試品溶液與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上均顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖1C。

2.1.4肉桂 取消瘤止痛凝膠5 g，加入石油醚(60～90 ℃)50 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液[12]。取肉桂對(duì)照藥材0.2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取不含肉桂的凝膠5 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。分別吸取上述3種溶液4、10、10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(15∶3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰。結(jié)果顯示，供試品溶液與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上均顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖1D。

圖1 TLC圖

2.1.5細(xì)辛 取2.1.1項(xiàng)下制備的供試品溶液[13]。取細(xì)辛對(duì)照藥材0.3 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取不含細(xì)辛的凝膠5 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。分別吸取上述3種溶液10、10、5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(3∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以50 mL·L-1香草醛硫酸溶液為顯色劑，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰。結(jié)果顯示，供試品溶液與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上均顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖1E。

2.2體外釋放度檢查方法考察

2.2.1落新婦苷的含量測(cè)定 精密稱取落新婦苷對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為200 μg·mL-1的落新婦苷對(duì)照品溶液。取對(duì)應(yīng)釋放時(shí)間的釋放介質(zhì)50 mL，水浴蒸干，加甲醇定容至5 mL，作為供試品溶液。取不含土茯苓的凝膠，按照上述方法制備陰性對(duì)照溶液。

色譜條件及方法學(xué)考察：采用Diamonsil C18色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-1 mL·L-1磷酸(31∶69)；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：291 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：30 μL；理論塔板數(shù)以落新婦苷峰計(jì)不低于4 000。落新婦苷在6.02～77.48 μg·min-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=13.30x-6.96(r=0.999 5)，定量限為6.02 μg·min-1，準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)中，平均回收率為99.43%，RSD=2.96%(n=6)，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性RSD值均<2.0%。

2.2.2影響因素實(shí)驗(yàn) 以落新婦苷的釋放度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0931第三法(小杯法)，稱取消瘤止痛凝膠2 g，置于透析袋中(截留相對(duì)分子質(zhì)量范圍12 000～14 000)，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，待恒溫至37 ℃開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，考察水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液[14-15](pH=7.4和5.8模擬創(chuàng)面和皮膚的pH)、10 g·L-1吐溫80溶液[16]對(duì)釋放度的影響，并在此基礎(chǔ)上對(duì)轉(zhuǎn)速(75、100、125 r·min-1)和半透膜不同截留相對(duì)分子質(zhì)量范圍(3 500、7 000和8 000～14 000)及樣本使用量(1、2、3 g)進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，在釋放介質(zhì)考察中，10 g·L-1吐溫80溶液釋放度最快且釋放度最高。在轉(zhuǎn)速考察中，125 r·min-17 h開(kāi)始累積釋放度與100 r·min-1相當(dāng)，但前期釋放速度略快，參考標(biāo)準(zhǔn)起草及研究文獻(xiàn)中使用100 r·min-1進(jìn)行測(cè)定的較多，而125 r·min-1使用很少且二者釋放曲線較為相近，故確定100 r·min-1為最佳轉(zhuǎn)速。在透析袋截留相對(duì)分子質(zhì)量范圍考察中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)釋放度影響較小，截留相對(duì)分子質(zhì)量范圍為8 000～14 000時(shí)，累積釋放度相對(duì)較大，故選取該型號(hào)的透析袋進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在樣品取樣量考察中，取1 g時(shí)5 h前的釋放度測(cè)定無(wú)法達(dá)到定量限的要求，不利于后期曲線的模型擬合，取3 g時(shí)的釋放度低于2 g，故確定2 g為取樣量。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 釋放度考察單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.3釋放機(jī)制分析 采用Origin Pro 8.0對(duì)2 g取樣量對(duì)應(yīng)的累積釋放曲線進(jìn)行Zero-order方程、First-order方程、Higuchi方程、Ritger-Peppa方程和SWeibull 1方程擬合。結(jié)果顯示，SWeibull 1方程的擬合度最高，說(shuō)明其釋放機(jī)制以擴(kuò)散為主[17-19]。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 累積釋放曲線方程擬合結(jié)果

2.2.4釋放度均一性考察 取3批樣品，每批2份，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，7 h時(shí)平均累積釋放度為80.85%(n=6，RSD=3.44%)，且各取樣點(diǎn)下釋放度的RSD值均小于6.50%(n=6)，表明釋放度均一性良好。結(jié)果見(jiàn)表2。

4)由于的長(zhǎng)度有限，稱作FIR濾波器。為矩形脈沖序列，每個(gè)元素均為1，整個(gè)卷積運(yùn)算過(guò)程相當(dāng)于對(duì)輸入信號(hào)求相鄰6個(gè)元素的平均值，因此可以理解為平滑濾波過(guò)程。

表2 釋放度均一性考察結(jié)果 (n=2)

2.3HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定落新婦苷和姜黃素的含量

2.3.1溶液的制備 取落新婦苷和姜黃素對(duì)照品適量，加甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為200、10 μg·mL-1的落新婦苷對(duì)照品溶液和姜黃素對(duì)照品溶液。取消瘤止痛凝膠2 g，加甲醇定容至10 mL，稱定質(zhì)量，超聲5 min，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，取續(xù)濾液作為供試品溶液。分別取不含土茯苓、姜黃的2種陰性凝膠，按照上述方法制備土茯苓陰性對(duì)照溶液和姜黃陰性對(duì)照溶液。

2.3.2線性關(guān)系及范圍考察所需溶液的配制 精密稱取姜黃素對(duì)照品2.48 mg，加甲醇定容至10 mL，作為姜黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱取落新婦苷對(duì)照品3.82 mg，并取姜黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，加甲醇定容至10 mL，取6 mL，再加甲醇定容至10 mL，按此比例反復(fù)稀釋，配制得落新婦苷的質(zhì)量濃度依次為358.70、215.22、129.13、77.48、46.49、27.89 μg·mL-1及姜黃素的質(zhì)量濃度依次為24.48、14.69、8.81、5.29、3.17、1.90 μg·mL-1的系列混合對(duì)照品溶液。

2.3.3色譜條件及方法學(xué)考察 色譜柱為Diamonsil C18柱；流動(dòng)相：乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸(B)(0～26 min，10%A；26～40 min，10%A～30%A；40～50 min，30%A～50%A)；流速：1 mL·min-1；落新婦苷和姜黃素檢測(cè)波長(zhǎng)分別為291、430 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)中，供試品色譜中落新婦苷、姜黃素色譜峰與相鄰色譜峰分離度均大于1.50，理論塔板數(shù)以落新婦苷峰計(jì)算不低于4 000，陰性對(duì)照無(wú)干擾。二者分別在27.89～358.70、1.90～24.48 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程分別為y1=5.11x1-24.65(r1=0.999 6)、y2=166.26x2+4.86(r2=0.999 9)。在準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)中平均回收率分別為100.35%、99.97%，RSD值分別為2.74%、2.63%(n=9)，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中相應(yīng)RSD值均<2.0%。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 HPLC圖

2.3.4落新婦苷和姜黃素的含量測(cè)定 取3批樣品，各2份，按照2.3.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.3.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果顯示，落新婦苷和姜黃素的平均含量分別為660.16、10.20 μg·g-1，RSD值分別為2.41%、2.16%(n=6)。

3 討論

TLC法在藥物分析中具有快速、簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，本文依此建立了樣品中5味藥材的鑒別方法。由于TLC鑒別常受溫度、濕度、薄層板廠家、樣品批次等因素的影響，故本研究依據(jù)《云南省中藥材(民族藥材)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》對(duì)5味藥材的TLC鑒別進(jìn)行了分析方法驗(yàn)證及重復(fù)性考察，結(jié)果均符合指導(dǎo)原則中的要求。

雙波長(zhǎng)-HPLC法可在1次進(jìn)樣后同時(shí)采用2個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)樣品進(jìn)行分析，其可對(duì)吸收波長(zhǎng)差異較大的多種物質(zhì)同時(shí)分析，較單波長(zhǎng)HPLC法更便捷。實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品含量測(cè)定的供試品制備方法進(jìn)行了考察，分別采用甲醇、乙醇提取及有機(jī)溶劑萃取后復(fù)溶的方法制備，結(jié)果優(yōu)選出的甲醇超聲溶解所得含量最佳，符合分析方法驗(yàn)證的相關(guān)要求。

綜上所述，本研究建立了消瘤止痛凝膠中5種藥材的TLC鑒別方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)考察，同時(shí)對(duì)土茯苓和姜黃中落新婦苷和姜黃素的含量測(cè)定進(jìn)行了研究，為本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了參考，將有利于本品的質(zhì)量控制，保障其臨床療效，促進(jìn)其臨床推廣。