L-精氨酸對人血管內皮細胞的功能的影響*

閆 媛，牛芳林，王迓君，于 怡，熊裕焱，△

（西北大學1生命科學學院，2醫(yī)學院，陜西西安710069）

L-精氨酸（L-arginine）是一種半必需氨基酸，參與蛋白質的生物合成、宿主免疫反應、尿素循環(huán)和一氧化氮（nitric oxide，NO）的產生等多種生物過程［1］。在心血管系統(tǒng)中，L-精氨酸是內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）產生血管舒張因子NO的單一底物［1-2］，NO在調節(jié)血管張力和整體心血管穩(wěn)態(tài)中具有重要作用［3］，也是血管內皮細胞功能檢測的常見指標［4］。另外，精氨酸也是尿素循環(huán)中精氨酸酶的底物，精氨酸酶對精氨酸的消耗會引起eNOS底物不足，導致NO產生減少，因此二者的表達平衡對維持血管內皮功能具有重要意義［5］。我們之前的研究表明，精氨酸酶I（arginase-I，Arg-I）過表達會引起活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）升高和NO下降，從而導致血管內皮功能障礙［6］。

在基礎理論和臨床研究中，L-精氨酸補充劑被用來治療某些心血管疾病如高血壓和冠心病等［1，7-10］，改善內皮依賴性血管舒張［11-18］，但其作用仍存在許多爭議。已有研究表明，L-精氨酸補充劑對內皮功能沒有持續(xù)有益作用［19-23］；口服L-精氨酸補充劑與心血管疾病的改善沒有關聯［24］；長期L-精氨酸補充對動脈粥樣硬化動物模型［25］和心血管疾病患者存在原因不明的有害作用［26-27］。由此可見，L-精氨酸在心血管疾病中的作用不僅僅和NO的生成有關。為進一步闡明L-精氨酸在心血管系統(tǒng)中的其它作用，我們以人臍靜脈內皮細胞（human umbilicalvein endothelialcells，HUVECs）為研究對象，采用不同的L-精氨酸補充時間處理細胞，探索不同長短的補充時間對血管內皮細胞功能的影響及其分子機制，為L-精氨酸用于治療心血管疾病提供理論指導。

材料和方法

1 實驗材料

原代人HUVECs購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司，經該公司鑒定vWF的表達陽性率達90%以上。血管內皮細胞生長補充因子購自Promo‐Cell；澳洲胎牛血清購自Gibco；RPMI-1640高糖培養(yǎng)基，L-精氨酸和Western blot相關試劑均購自Sigma-Aldrich；超氧化物陰離子熒光檢測探針二氫乙啶（di‐hydroethidium，DHE）和檢測NO的4，5-二氨基熒光素二乙酸酯（4，5-diaminofluorescein diacetate，DAF-2DA）染料均購自Thermo Fisher Scientific；衰老相關β-半乳糖苷酶（senescence-associated galactosidase，SA-β-Gal）染色試劑盒購于Promega；U6啟動子驅動靶向人Arg-I的shRNA重組腺病毒由瑞士弗里堡大學的Zhihong Yang教授贈送；抗tubulin、Arg-I、核糖體蛋白S6、磷酸化S6、核糖體蛋白S6激酶1（ribosomal pro‐tein S6 kinase 1，S6K1）和磷酸化S6K1抗體均購自CST。SDS-PAGE儀器和半干轉印儀均購自Bio-Rad。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 原代HUVECs復蘇于含有5%胎牛血清FBS、血管內皮生長因子和抗生素（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)液中，并置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h換液，待細胞融合率達80%進行傳代。選取第2～4代的HUVECs作為“年輕”的血管內皮細胞。

2.2 細胞L-精氨酸處理 對于短期L-精氨酸處理實驗，對細胞進行血清和L-精氨酸饑餓過夜處理，然后用0.1 mmol/L（正常生理濃度）或0.5 mmol/L（臨床補充濃度）的L-精氨酸處理2 h。對于長期補充L-精氨酸的研究，將細胞在不含L-精氨酸的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后補充0.1或0.5 mmol/L的L-精氨酸，培養(yǎng)10 d，每48 h更換一次培養(yǎng)基。樣品收集前，將細胞饑餓處理過夜。對于需要基因沉默的實驗，在L-精氨酸饑餓后用重組腺病毒感染細胞。

2.3 mTORC1和S6K1活性檢測 通過Western blot分別檢測S6K1在蘇氨酸389（T389）上的磷酸化和它的底物S6在絲氨酸235/絲氨酸236（S235/S236）上的磷酸化來分析mTORC1和S6K1的活性。

2.4 SA-β-Gal染色檢測細胞衰老 首先用PBS洗滌細胞2次，然后用3.7%甲醛PBS溶液固定細胞10～15 min。再次用PBS洗滌兩次后，將細胞與SAβ-Gal染色溶液［1 g/L X-Gal、40 mmol/L Na3C6H5O7·2H2O、5 mmol/L K4Fe（CN）6·3H2O、5 mmol/L K3Fe（CN）6、150 mmol/L NaCl和2 mmol/L MgCl2溶于pH 6.0的PBS中］在37℃無CO2的培養(yǎng)箱中孵育過夜。通過常規(guī)光學顯微鏡檢測藍色的衰老細胞，計算各組陽性衰老細胞的百分比，并進行顯著性分析。

2.5 ROS和NO的檢測 為了測量細胞ROS，將細胞與5μmol/L DHE工作溶液孵育20 min，用熒光顯微鏡采集熒光信號圖像檢測細胞內ROS的產生。為了檢測NO，將HUVECs用不含Ca2+的PBS輕輕洗滌2次，然后將細胞與含有5μmol/L DAF-2DA的Krebs-Ringer碳酸氫鹽溶液（mmol/L：NaCl 118，KCl 4.7，CaCl22.5，MgSO41.2，KH2PO41.2，NaHCO325，EDTA 0.026，葡萄糖5.5）孵育30 min。然后將細胞洗滌3次，并用熒光顯微鏡采集熒光信號圖像，熒光強度通過ImageJ軟件（NIH）定量。

2.6 Western blot實驗 收集不同實驗條件下的細胞或者組織樣品，加入蛋白裂解液，冰上放置40 min，4℃下12 000 r/min離心15 min，取上清。以BSA為標準，用Bradford法對上清進行蛋白定量。取20μg蛋白樣品，行10%SDS-PAGE，100 V轉移1 h至PVDF膜，用封閉溶液（含有5%脫脂奶粉的PBS緩沖液）在室溫下封閉膜1 h，或在4℃下封閉過夜。用適當稀釋度的Ⅰ抗在5%封閉溶液中4℃過夜孵育膜，或在室溫下孵育2 h。用TBST洗滌膜5 min×3次。根據推薦的稀釋度，將遠紅光/紅外Alexa Fluor熒光標記的Ⅱ抗稀釋在含5%封閉緩沖液的TBST中，然后室溫孵育膜1 h。用TBST洗滌膜5 min×3次，然后用TBS沖洗，隨后用清水沖洗膜，室溫晾干，最后用熒光Li-COROdyssey成像儀檢查目標蛋白信號。

3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析。在所有實驗中，n表示進行的單個實驗的次數。數據以均數±標準誤（mean±SEM）表示。兩組間比較采用Student’st檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 短時間和長時間L-精氨酸補充對HUVECs中ROS和NO產生及細胞衰老的影響

在年輕的內皮細胞中，與人體正常生理濃度0.1 mmol/L相比，0.5 mmol/L的L-精氨酸短時間（2 h）處理顯著促進了HUVECs中NO的上升（P<0.01），但對ROS和細胞衰老沒有影響，見圖1。在長時間（8 d）補充條件下，與0.1 mmol/L L-精氨酸處理的細胞相比，0.5 mmol/L的L-精氨酸處理導致ROS含量上升、NO水平下降和衰老標志物SA-β-Gal活性升高（P<0.01），這些現象均是血管內皮細胞功能障礙和衰老的表現，見圖2。該結果表明，短時間L-精氨酸補充至0.5 mmol/L可以增加NO的水平，有利于心血管疾病的改善；然而，長時間的L-精氨酸補充不但沒有增加NO的作用，反而使其降低，同時ROS和細胞衰老指標也顯著增加，即長時間的L-精氨酸補充會產生一定的副作用。

Figure 1.The effects of short-time（2 h）L-arginine supplementation on the ROSand NO production，and senescence of HUVECs.A：DHE and DAF-2DA staining for detection of ROS（red）and NO（green），respectively（scale bar=200μm）；B：SA-β-Gal staining（scale bar=200μm）.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs0.1 mmol/L group.圖1 短時間（2 h）L-精氨酸補充對HUVECs中ROS和NO產生及細胞衰老的影響

Figure 2.The effects of long-time（8 d）L-arginine supplementation on the ROSand NO production，and senescence of HUVECs.A：DHE and DAF-2DA staining for detection of ROS（red）and NO（green），respectively（scale bar=200μm）；B：SA-β-Gal staining（scale bar=200μm）.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs0.1 mmol/L group.圖2 長時間（8 d）L-精氨酸補充對HUVECs中ROS和NO產生及細胞衰老的影響

2 短時間和長時間L-精氨酸補充對HUVECs中Arg-I表達及S6K1/S6信號通路活化的影響

在年輕的內皮細胞中，與0.1 mmol/L組相比，短時間和長時間補充0.5mmol/L L-精氨酸均能促進S6K1-S6磷酸化（P<0.05或P<0.01）；不同的是，長時間處理同時增加Arg-I蛋白表達量，見圖3。該結果表明L-精氨酸長期補充可激活mTORC1-S6K1和Arg-I信號通路，這可能是L-精氨酸影響內皮細胞功能的調控機制。

Figure 3.The effects of short-term（A）and long-term（B）L-arginine supplementation on the expression of Arg-I and activation of S6K1/S6 signaling pathway in the HUVECs.The protein levels of Arg-I，S6K1，S6，phosphorylated S6K1（S6K1-T389）and phosphorylated S6（S6-S235/236）were detected by Western blot.Tubulin served as loading control.Mean±SEM.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs0.1 mmol/L group.圖3 短時間（2 h）和長時間（8 d）L-精氨酸補充對HUVECs中Arg-I表達及S6K 1信號通路活化的影響

3 Arg-I過表達促進S6K1/S6信號通路激活和血管內皮細胞功能障礙

在正常濃度L-精氨酸的培養(yǎng)條件下，用重組腺病毒CMV啟動子過表達Arg-I。如圖4所示，當Arg-I表達量顯著升高以后，S6K1和S6蛋白的磷酸化水平顯著升高（P<0.01）。該結果表明，Arg-I在mTORC1信號通路的上游，長時間的0.5 mmol/L L-精氨酸補充首先導致Arg-I升高，然后進一步激活mTORC1-S6K1信號通路。

Figure 4.Overexpression of Arg-I promoted the phosphorylation of S6K1 and S6.The protein levels of Arg-I，S6K1 and S6，phos‐phorylated S6K1（S6K1-T389）and phosphorylated S6（S6-S235/236）were detected by Western blot.Tubulin served as loading control.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs control group.圖4 Arg-I過表達促進S6K 1和S6磷酸化

另外，功能分析實驗證明，過表達Arg-I同時也會導致HUVECs中ROS升高、NO下降和衰老細胞增加，表明Arg-I可以引起血管內皮細胞功能障礙，見圖5。

Figure 5.Overexpression of Arg-I induced ROSincrease，NO decrease and cellular senescence.A：DHE and DAF-2DA staining for detection of ROS（red）and NO（green），respectively（scale bar=200μm）；B：SA-β-Gal staining（scale bar=200μm）.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs control group.圖5 Arg-I過表達導致ROS增加、NO含量下降和細胞衰老

4 長時間L-精氨酸補充通過激活Arg-I/S6K1信號通路引起血管內皮細胞功能障礙

我們在補充精氨酸（0.5 mmol/L）的培養(yǎng)基中，通過轉導腺病毒rAd/U6-shRNA達到敲減Arg-I的目的。如圖6所示，在長期L-精氨酸（0.5 mmol/L，8 d）處理后，與對照組相比，Arg-I的蛋白表達量顯著下降，表明敲減成功；同時，S6K1和S6的磷酸化水平也顯著下降（P<0.01）。

Figure 6.Silencing of Arg-I inhibited the phosphorylation of S6K1 and S6 induced by long-term L-arginine supplementation.The pro‐tein levels of Arg-I，S6K1，S6，phosphorylated S6K1（S6K1-T389）and phosphorylated S6（S6-S235/236）were detected by Western blot.Tubulin served as loading control.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs control group.圖6 敲減Arg-I表達抑制長時間L-精氨酸補充引起的S6K1和S6磷酸化

此外，敲減Arg-I的表達可以明顯減輕長時間L-精氨酸補充導致的HUVECs功能障礙和衰老。在Arg-I敲減組，ROS水平顯著下降，NO水平顯著升高，衰老細胞數量顯著減少（P<0.01），見圖7。該結果表明，Arg-I參與了長期服用L-精氨酸引起的有害作用，這種毒害作用的機制是通過激活Arg-I/S6K1-S6信號通路來實現的。

討 論

自從發(fā)現L-精氨酸是內皮細胞eNOS產生血管保護性分子NO的唯一底物以來，人們對精氨酸補充劑進行了數十年的研究，以促進包括人在內的不同模式生物體內NO的產生。但是，我們和他人的結果均表明，長期服用L-精氨酸對心血管系統(tǒng)是有害的。然而，該現象的潛在機制仍不清楚。

在本研究中，短時間L-精氨酸補充顯著增加血管內皮細胞的NO水平，而長期補充則會顯著導致內皮細胞衰老和NO產生減少，并上調Arg-I表達以及激活mTORC1-S6K1信號通路，Arg-I基因敲減則可以抑制這一現象。大量研究已表明，mTORC1-S6K1信號通路激活會引起血管內皮細胞功能障礙、衰老和炎癥反應［28-29］。另外，高表達的Arg-I也會導致血管內皮細胞障礙［6，30-31］。因此，這些結果揭示了長時間L-精氨酸補充對血管內皮細胞的有害作用是通過上調Arg-I，然后進一步正調控mTORC1-S6K1活性，導致S6K1持續(xù)活化，最終影響細胞的血管內皮細胞的功能。在實驗中我們也發(fā)現L-精氨酸短時間處理可快速激活mTORC1-S6K1，但不影響Arg-I表達，這一現象很可能是由Rag GTPases介導的［32-33］。然而，長時間L-精氨酸補充是如何上調Arg-I以及Arg-I激活mTORC1-S6K1的詳細機制仍有待研究。精氨酸酶的另一同工酶Arg-II被報道也可以通過mTORC1-S6K1信號通路引起內皮細胞功能障礙，其激活機制是通過肌球蛋白1b引起溶酶體的空間位移而解除TSC1/2對mTORC1的抑制［34］。Arg-I和Arg-II同屬于精氨酸酶，Arg-I對mTORC1-S6K1的激活機制極有可能與Arg-II相似，但由于Arg-I和Arg-II在細胞中存在位置不一樣，Arg-I存在于細胞質中，Arg-II存在于線粒體中，兩種酶激活mTORC1信號通路的機制也有可能不一樣。研究表明，Rag GTPases通過與mTORC1復合體中的Raptor相互作用參與mTORC1的激活［32-33］，因此Arg-I也有可能直接或間接通過調節(jié)Rag GTPases的活性或者與其相互作用，從而影響mTORC1的激活，然而這需要進一步的探索和驗證。

Figure 7.Silencing of Arg-I attenuated the endothelial dysfunction induced by long-term L-arginine supplementation.A：DHE and DAF-2DA staining for detection of ROS（red）and NO（green），respectively（scale bar=200μm）；B：SA-β-Gal staining（scale bar=200μm）.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs control group.圖7 敲減Arg-I表達減輕長時間L-精氨酸補充導致的HUVEC功能障礙

總之，我們的研究證明了L-精氨酸對內皮細胞產生有益或有害作用的證據，這取決于補充的持續(xù)時間。這些發(fā)現不僅可以解釋文獻中報道的補充L-精氨酸對血管作用的矛盾或不一致的結果，而且可以提供對心血管疾病患者不良臨床后果的機制性見解。因此，L-精氨酸補充劑與mTORC1-S6K1的抑制相結合可以保留對NO產生的有益作用，同時減少長期L-精氨酸補充對內皮的有害作用，這可能是L-精氨酸補充劑一種新的治療選擇，而靶向Arg-I也為心血管疾病的治療提供有效策略。